Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Résumé

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Résumé

Barrière hémato - encéphalique (BHE) est une barrière spécialisée qui protège le microenvironnement de cerveau de toxines et d’agents pathogènes dans la circulation et maintient l’homéostasie du cerveau. Les sites principaux de la barrière sont des cellules endothéliales des capillaires cerveau dont la fonction barrière résulte des jonctions intercellulaires et transporteurs d’efflux exprimées sur la membrane plasmique. Cette fonction est régie par les péricytes et astrocytes qui forment ensemble l’unité neurovasculaire (UNV). Plusieurs maladies neurologiques telles que des accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer (ma), les tumeurs cérébrales sont associées à une fonction altérée de BBB. Évaluation de la perméabilité BBB est donc essentielle pour évaluer la gravité de la maladie neurologique et le succès des stratégies de traitement employées.

Nous présentons ici un simple, pourtant test de perméabilité robustes qui ont été appliqués avec succès à plusieurs souris modèles génétiques et expérimentale. La méthode est très quantitative et objective par rapport à l’analyse de fluorescence du traceur par microscopie qui est couramment appliquée. Dans cette méthode, les souris sont injectés par voie intrapéritonéale avec un mélange de solution aqueuses traceurs fluorescents inertes suivie d’anesthésier les souris. La perfusion cardiaque des animaux est effectuée avant leur récolte de cerveau, des reins ou des autres organes. Organes sont homogénéisés et centrifugés suivie par mesure de la fluorescence du surnageant. Tirés de la ponction cardiaque juste avant la perfusion de sang sert pour le but de la normalisation dans le compartiment vasculaire. La fluorescence de tissu est normalisée à la fluorescence de sérum et poids humide pour obtenir un quantitatif indice de perméabilité de traceur. Pour une confirmation supplémentaire, hemi-cerveau controlatérale préservé pour immunohistochemistry peut être utilisé à traceurs fluorescence visualisation des fins.

Introduction

La barrière sang - encéphalique (BHE) se compose des cellules endothéliales microvasculaires (ECs) pris en charge par des péricytes étroitement associés (SCP), qui sont entourées dans la lame basale, et les astrocytes (ACs) qui enveloppent la membrane basale avec leurs embouts^{1 ,2}. ECs interagissent avec plusieurs types de cellules qui soutiennent et régulent la fonction de barrière, principalement les ACs et les PC, et aussi les neurones et les cellules microgliales, qui ensemble constituent l’unité neurovasculaire (UNV). Le NVU est critique pour la fonction de la BHE, qui limite le transport des toxines véhiculées par le sang et les agents pathogènes de pénétrer dans le cerveau. Cette fonction est le résultat de la jonction serrée molécules tels que claudin-5, occludin, zonula occludens-1, qui se trouvent entre l’ECs et aussi grâce à l’action des transporteurs comme la p-glycoprotéine (P-gp) cet efflux de molécules qui entrent dans l’endothélium de nouveau dans le navire lumen^1,2,3. Le BBB permet toutefois pour le transport de molécules essentielles comme les nutriments (glucose, fer, acides aminés) par des transporteurs spécifiques exprimés sur les membranes plasmiques de ce^1,2,3. La couche d’EC est fortement polarisée en ce qui concerne la répartition des différents transporteurs entre la luminale (sang-face) et abluminal (cerveau face à membranes) pour permettre le transport spécifique et vectoriel fonction^4,5 . Alors que la BHE est protectrice à l’égard de bien réguler le milieu de la CNS, c’est un défi majeur pour l’administration de médicaments CNS dans des maladies comme la maladie de Parkinson avec un BBB fonctionnel. Même dans les maladies neurologiques présentant une dysfonction BBB, on ne peut présumer que l’administration de médicaments du cerveau augmente autant que le dysfonctionnement de la barrière pourrait inclure des dégâts aux cibles transporteur spécifique par exemple comme dans la maladie d’Alzheimer (ma). Dans AD, plusieurs transporteurs de bêta-amyloïde comme LRP1, RAGE, P-gp sont connus pour être dysrégulation et donc cibler ces transporteurs pourrait être futile^6,7,8. Le BBB est altérée chez plusieurs maladies neurologiques comme la méningite AVC, AD, sclérose en plaques- et du cerveau tumeurs^9,10,11. Restaurer la fonction barrière est un élément crucial de la stratégie thérapeutique et son évaluation est donc critique.

Dans ce travail, nous avons décrit une objective et quantitative protocole pour l’analyse de la perméabilité chez les rongeurs que nous avons appliqué avec succès à plusieurs lignées de souris les deux maladies expérimentales et transgéniques modèles^{10,12,13 ,},¹⁴. La méthode est basée sur une simple injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion des souris pour enlever les traceurs du compartiment vasculaire. Cerveau et autres organes sont prélevés post perfusion et évalués par un objectif de perméabilité et indice de perméabilité absolue fondée sur des mesures de fluorescence des homogénats de tissus dans un lecteur de plaque. Toutes les valeurs brutes de fluorescence ont été corrigés pour l’arrière-plan à l’aide d’homogénats de tissus ou de sérum provenant d’animaux d’imposture qui ne reçoivent pas tous traceur. Un grand normalisations sont incluses pour volume de sérum, sérum fluorescence et le poids des tissus, produisant ainsi des index de perméabilité qui est absolu et comparables entre les expériences et les types de tissus. Pour faciliter la comparaison entre les groupes, les valeurs d’index de perméabilité absolue peuvent se transformer facilement ratios que nous avions effectué précédemment¹². Parallèlement, stockée hemi-cerveau et les reins pourraient être utilisés pour la visualisation du traceur par microscopie de fluorescence¹⁰. La microscopie de fluorescence classique pourrait être utile à obtenir une différence régionale perméabilité quoique encombrant en raison de la sélection subjective de coupes de tissus et d’images pour une analyse semi-quantitative. Les étapes détaillées sont présentées dans le protocole et les notes sont ajoutées, le cas échéant. Ceci fournit les informations nécessaires pour effectuer avec succès le test de perméabilité in vivo chez la souris qui peuvent être adaptés à d’autres petits animaux. Le test peut être appliqué à beaucoup de genres de traceurs permettant la charge et la taille fondé l’évaluation de la perméabilité par une combinaison de traceurs avec les spectres de fluorescence distinctes.

Protocole

Tous les animaux ont été traités avec soin, minimisant la douleur ou l’inconfort lors de la procédure. Cette procédure suit les directives de protection des animaux de notre institution et a été approuvée par le Comité local (Regierungspraesidium Darmstadt, numéro d’homologation FK/1044).

Un schéma des étapes de travail pour l’analyse perméabilité in vivo chez la souris est illustré à la Figure 1. Les détails de chaque étape sont décrites ci-dessous.

1. animal de manutention

1. Préparation et administration des traceurs et anesthésiques
   1. Préparer les tubes étiquetés et moules pour incorporation au moins une journée avant le dosage de la perméabilité des tissus. Maintenir des conditions stériles dans tout le protocole en travaillant sous une hotte de laboratoire propre et en utilisant les outils nettoyés avec de l’éthanol à 80 %. Utiliser le mâle ou femelle sauvage (WT) ou souris de CD1 (GOF) pour le gain de fonction angiopoietin-2 (Ang-2) dans le groupe d’âge adult mature de 3 à 6 mois pour le protocole actuel. Effectuer un génotypage des souris comme décrit plus haut ¹⁰.
      Remarque : 80 % d’alcool n’entraînera des instruments stériles mais réduira au minimum la contamination des échantillons préparés.
   2. Diluer tous les traceurs dans du PBS stérile en stocks de 2 mM et stocker les aliquotes à l’abri de la lumière à-20 ° C.
   3. Choisissez des traceurs tels que (tétraméthyl Rhodamine) TMR et (isothiocyanate de fluorescéine) FITC avec les spectres d’excitation/émission distincts et qui sont lysine fixable entraînant une interférence minimale entre les colorants, microscopie à fluorescence (en utilisant le TMR ou FITC filtrer respectivement) et par fluorimétrie dans un lecteur de plaque pour le test de perméabilité.
      Remarque : Dextran TMR 3 kD et dextran FITC 3 kD utilisés dans l’étude sont les deux lysine réparable et ainsi pourrait être également utilisées pour immunohistochemical analyse après fixation avec les aldéhydes afin d’étudier les différences régionales.
   4. Traiter tous les animaux avec soin en suivant les directives de placement en institution. Injecter par voie intrapéritonéale chaque souris avec 100 µL de solution de traceur qui peut être augmentée jusqu'à 200 µL lorsqu’un traceur supplémentaire est associé à l’aide de 100 µL de chaque traceur dans un mélange 1:1^10,13. Injecter au moins un animal avec du PBS seul au lieu de traceurs pour servir de contrôle sham pour la soustraction du fond autofluorescence.
   5. 5 min après l’injection du traceur, anesthésier l’animal avec une injection de i.p de kétamine et de Xylazine (100 mg et 5 à 10 mg chez 0,9 % Solution Saline par corps kg poids respectivement 150 µL du cocktail par souris 25 g).
      NOTE : Vet onguent ne était pas appliqué sur les yeux au cours de la procédure comme la période comprise entre animaux anesthésie et perfusion/sacrifice était brève (10 minutes) où aucun séchage des yeux n’était pas observée.
2. Perfusion sanguine collection et cardiaque
   1. Préparer les animaux pour la perfusion cardiaque 10 min après l’administration de l’anesthésie. Vérifier l’absence de réponse en secousse patte afin de s’assurer que l’animal atteint un plan chirurgical de l’anesthésie.
   2. Posez les animaux sur leur dos et appliquer l’éthanol à 80 % sur la peau de la zone abdominale. À l’aide de petits ciseaux, ouvrir la paroi abdominale avec une petite incision (2 cm) juste sous la cage thoracique. Séparer le foie de la membrane et couper lentement à travers le diaphragme, exposant ainsi la cavité pleurale ¹⁵.
   3. Couper la cage thoracique au niveau bilatéral et fixer le sternum coupé afin d’exposer le ventricule gauche. Insérer une aiguille à ailettes de calibre 21 connectée à un système de perfusion péristaltique dans la partie postérieure du ventricule gauche.
   4. Perforer l’oreillette droite et rapidement (moins de 10 s) recueillir 200-300 µL de sang libéré dans la cavité thoracique à l’aide de pointes de pipette de 1 mL (avec coupure de la fin) dans les tubes de prélèvement de sérum et placez-le sur la glace.
      Remarque : Cette procédure de perfusion est sans survie.
   5. Dès que le sang est prélevé, mettre en marche le système de perfusion (10-12 t/mn, 5 mL/min) et perfuse l’animal pendant 3 min à chaud (RT) 1 x PBS (libre de Ca^{2 + /}ions Mg^{2 +} ).
      NOTE : PBS contenant Ca^{2 +}/Mg^{2 +} ions peuvent être utilisées pour une meilleure activité cardiaque durant la perfusion. Le montant total de PBS, utilisé pour la perfusion est de l’ordre de 15 à 20 mL.
   6. Évaluer la qualité de la perfusion en notant la couleur du foie, reins, qui apparaissent blanc/pale après la perfusion.
      NOTE : Rein ou perfusion hépatique n’indiquent pas nécessairement la perfusion cérébrale comme les artères (carotides vertébrale) atteignant le cerveau de l’aorte peut obtenir s’est rompu lors de la préparation à l’étape 3, en particulier pendant la ponction auriculaire.

2. tissu traitement

1. Stockage et collection de l’orgue
   1. À la fin de la perfusion, confirmer la mort de l’animal par dislocation cervicale et récolte de cerveau et les reins. Vérifiez la perfusion du cerveau par la couleur des cerveaux (pas visible de sang dans les vaisseaux des méninges), afin d’exclure les animaux de l’analyse de la perméabilité lorsque la qualité de la perfusion n’est pas bonne. Le cerveau se divisent en 2 hemibrains à l’aide d’un scalpel (Figure 1).
   2. Disséquer avec un hemibrain d’un bistouri sans lobes olfactifs et cervelet et transférer le hemicerebrum dans un tube de 2 mL. Stocker les hemi-cervelet dans un tube supplémentaire si nécessaire pour l’évaluation de la perméabilité cérébelleux.
   3. Transférer un rein unique dans un autre tube 2 mL. Stocker les échantillons immédiatement sur la glace sèche.
   4. Intégrer nativement le rein restant et le hemi-cerveau (comprenant le cervelet et les lobes olfactifs) température de coupe optimale de tissu-tek (O.C.T) composé sur la glace sèche.
   5. En fin de compte, centrifuger les échantillons de sang stockés sur la glace dans les tubes de prélèvement de sérum à 10, 000 g, 10 min à 4 ° C. Transfert de surnageants de sérum pour tubes de 1,5 mL et placez-les dans le récipient de glace sèche.
   6. Tous les échantillons prélevés sur carboglace congélateur-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure de transfert.
      Remarque : Il est important congeler les échantillons avant de procéder aux étapes homogénéisation comme l’homogénéisation des augmentations de l’efficacité après que la congélation décongélation.
2. Homogénéisation et centrifugation
   1. Laisser décongeler sur glace hemi-cerveau et les reins congelés vers le bas à-80 ° C et peser les tubes contenant les organes. De ces poids, soustraire la valeur moyenne de plusieurs tubes vides (environ 20) pour obtenir le poids du tissu. Ajouter 300 µL et 200 µL de froid 1 X PBS pour les tubes contenant les reins et hemi-cerveau, respectivement.
      Remarque : pour des montants inférieurs des tissus (comme hemi-cervelet, inférieures à 100 mg) pesant les tubes individuels est recommandé.
   2. Homogénéiser chaque échantillon dans le tube eppendorf original avec un pilon de polytétrafluoroéthylène (PTFE) attaché à un agitateur électrique aérienne (1, 000 tr/min) en effectuant environ 15 accidents vasculaires cérébraux (1 AVC = 1 haut et 1 bas). Rincer le pilon avec PBS entre échantillons et sécher avant de passer à l’échantillon suivant.
      Remarque : L’utilisation de détergents au cours de l’homogénéisation a été évitée en raison de l’interférence avec la fluorométrie. Cependant, traceur intracellulaire est également détectée dans le présent protocole que le tissu soit bien homogène, qui est plus efficace après un cycle de gel dégel.
   3. Stocker les échantillons homogénéisés sur glace protégé de la lumière et la centrifugeuse tous ensemble en fin de compte à 15 000 g, 20 min, 4 ° C dans une centrifugeuse de table. Transfert de surnageants à un nouveaux tubes de 1,5 mL sur la glace pour fluorométrie immédiate ou à-80 ° C à analyser plus tard.
3. Quantification et mesure de la fluorescence
   1. Si gelé à la fin de l’étape précédente, dégel sur glace les sérum et le liquide surnageant des échantillons de tissus conservés à-80 ° c, protégeant de la lumière avec la feuille.
   2. Pipetter 50 µL de sérum dilué (30 µL 1 x PBS + 20 µL de sérum) ou les surnageants de tissu (tel quel) dans une plaque 384 puits noire. Inclure au moins un échantillon d’animal de simulacre de surnageants de sérum et de tissus pour soustraction de fond appropriée, comme cette toile de fond l’homogénat tissulaire est normalement plus élevé que celui de PBS utilisé comme diluant.
      Remarque : Une moyenne de 3 animaux factice peut être utilisée pour l’autofluorescence bien qu’on observe une variabilité très peu dans les valeurs d’autofluorescence sham (données non présentées). La quantité de sérum utilisé peut être réduite en diluant il par PBS, qui peut également augmenter le rapport signal sur bruit pour les échantillons avec faible fluorescence tels que des échantillons de cerveau. Jusqu'à 10 µL de sérum a été testé avec 40 µL PBS dilution d’elle. Veillez à ce qu’aucune bulle n’est présents dans les puits.
   3. Insérer la plaque 384 puits noire dans le lecteur et ouvrez un nouveau script de sélection de mesure de la fluorescence.
   4. La valeur du gain optimal et utilisez respectivement les valeurs d’excitation/émission (nm) de 550/580 ou 490/520 pour dyee TMR ou FITC et démarrer la mesure afin d’obtenir les unités de fluorescence brut (RFUs).
   5. Utiliser les unités de fluorescence brut (RFUs) du lecteur de plaque pour calculer l’indice de perméabilité (IP) après avoir soustrait les valeurs correspondantes de la farce.
      1. * Indice de perméabilité (mL/g) = (Poids de tissu tissu RFUs/g) / (sérum sérum RFUs/mL)
   6. Exemple de calcul de l’indice de perméabilité cérébrale (IP) de l’animal GOF1 (tableau 1) :
      1. GOF1 cerveau RFUs - SHAM cerveau RFUs = 154-22,5 = 131,5
      2. GOF1 sérum RFUs - sérum SHAM RFUs = 38305-27 = 38278
      3. Poids (g) du cerveau = 0,195
      4. Volume de sérum (ml) = 0,02
      5. Cerveau en indice de perméabilité (10^-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0,352
         Remarque : Les calculs d’indice de perméabilité donnent des valeurs absolues et comparables entre les expériences et les types de tissus. Ceux-ci peuvent toutefois être présentées sous forme de rapport pour faciliter la comparaison entre les 2 groupes de ¹². Ceci peut être réalisé en divisant la PI de chaque animal dans les deux groupes avec la PI moyen du groupe témoin, la moyenne du groupe contrôle par 1 tout en conservant la variation animale inter dans le groupe témoin de conduite. Cette transformation fournit des valeurs pour le groupe expérimental (ou groupes) par rapport au groupe contrôle, la valeur 1.
4. Visualisation d’immunofluorescence de traceur
   1. Couper les blocs de rein/hemi-cerveau intégrés nativement dans le tissu-tek composé (O.C.T) (étape 2.1) dans 10 µm sections sur un cryostat à-20 ° C et les sections à diapositives placées à température ambiante. Une fois que les sections sont séchées (environ 30 min), transfert diapositives au congélateur-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
   2. Le jour de la coloration, décongeler les diapositives à 37 ° C pendant 10 min et puis fixer les sections avec 4 % paraformaladehyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante, suivie d’un lavage rapide dans du PBS.
   3. Incuber les coupes dans le tampon perméabilisation/blocage de PBS stérile contenant 1 % de BSA et de 0,5 % Triton X-100 pH 7,5 pendant 1 h à température ambiante.
   4. Incuber les lames pendant 1,5 h à température ambiante avec l’anticorps primaire CD31 (0,5 mg/ml, clone MEC 13,3), dilué au 1/100 dans un tampon contenant du PBS stérile, 0,5 % de BSA, 0,25 % Triton X-100 (pH 7,2), suivie de trois lavages 5 min dans du PBS.
   5. Effectuer d’incubation anticorps secondaire dans le tampon ci-dessus pendant 1 h à température ambiante avec chaque espèce fluorescent étiquetée anticorps dilué 1/500 (2 mg/mL). Pour CD31, anti-rat chèvre Alexa 568 ou Alexa 488 peut être utilisé à une dilution de 1/500. Inclure le DAPI (300 µM) dans l’anticorps secondaire mélanger (1 / 1 000 de dilution de la crosse) pour souiller pour les noyaux.
   6. Monter les sections colorées avec polymount aqua et laisse la nuit pour la polymérisation dans l’obscurité à température ambiante.
   7. Acquisition d’images à l’aide d’une spectre d’imagerie confocale à balayage laser système de microscope. Analyser les images par logiciel d’elements NIS (version 4.3). Logiciel tel que Photoshop peut être utilisé pour la génération des figures de montage.

Résultats

Nous avons récemment démontré que les souris angiopoietin-2 (Ang-2) gain de fonction (GOF) ont la perméabilité vasculaire cérébrale plus élevée que les souris témoins dans des conditions de salubrité¹⁰. Chez les souris induite par l’accident vasculaire cérébral, il était aussi montre que les souris GOF avaient de plus grandes tailles d’infarctus et d’une plus grande perméabilité que la portée du contrôle. Ces résultats montrent un rôle cru...

Discussion

Dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique est associé à un certain nombre de troubles neurologiques, y compris les tumeurs cérébrales primaires et secondaires ou accident vasculaire cérébral. Rupture BBB est souvent associé avec oedème de CNS mortelles. L’élucidation des mécanismes moléculaires qui déclenchent l’ouverture ou la fermeture de la BHE est donc d’importance thérapeutique dans les troubles neurologiques et généralement étudié par les chercheurs. Cependant, méthodes pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R