Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Resumen

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Resumen

Barrera Blood - brain (BBB) es una barrera especializada que protege el microambiente del cerebro de toxinas y agentes patógenos en la circulación y mantiene la homeostasis cerebral. Los sitios principales de la barrera son las células endoteliales de los capilares del cerebro cuya función barrera resulta de uniones intercelulares estrechas y transportadores de eflujo expresados en la membrana plasmática. Esta función está regulada por los pericitos y los astrocitos que juntos forman la unidad neurovascular (NVU). Varias enfermedades neurológicas tales como accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer (EA), tumores cerebrales se asocian con un deterioro de la función BBB. Evaluación de la permeabilidad BBB, por tanto, es crucial en la evaluación de la severidad de la enfermedad neurológica y el éxito de las estrategias de tratamiento empleadas.

Presentamos aquí un simple pero ensayo de permeabilidad robusto que se han aplicado con éxito al ratón de varios modelos tanto genética como experimental. El método es muy cuantitativa y objetiva en comparación con el análisis de fluorescencia de tracer por microscopía que comúnmente se aplica. En este método, los ratones se inyectan por vía intraperitoneal con una mezcla de marcadores fluorescentes inertes acuosos seguido de anestesiar los ratones. La perfusión cardíaca de los animales se realiza antes de la cosecha el cerebro, los riñones u otros órganos. Órganos se homogeneizó y se centrifugó seguido de medición de la fluorescencia del sobrenadante. Sangre de la punción cardiaca justo antes de la perfusión sirve para el propósito de la normalización en el compartimento vascular. La fluorescencia de tejidos se normaliza a la fluorescencia húmeda peso y suero para obtener cuantitativo índice de permeabilidad de trazador. Para la confirmación adicional, contralateral hemi-cerebro preservado por inmunohistoquímica puede ser utilizado para fines de visualización de la fluorescencia tracer.

Introducción

La barrera blood - brain (BBB) consiste en las células endoteliales microvasculares (ECs) apoyadas por pericitos estrechamente (PC), que son rodeadas en la lámina basal, y astrocitos (ACs) que envuelven la membrana del sótano con sus final-pies^{1 ,2}. ECs interactúan con varios tipos de células que apoyan y regulan la función de barrera, principalmente ACs y PC, y también las neuronas y microglia, que juntos forman la unidad neurovascular (NVU). El NVU es crítico para la función de la BBB, que limita el transporte de toxinas transmitidas por la sangre y patógenos entren en el cerebro. Esta función es el resultado de moléculas de ensambladura apretada como claudin-5, occludin, zonula occludens-1, presentes entre ECs y también debido a la acción de transportadores como p-glicoproteína (P-gp) flujo de salida de las moléculas que entran en el endotelio de nuevo en los vasos lumen^1,2,3. El BBB sin embargo permite el transporte de moléculas esenciales tales como nutrientes (glucosa, hierro, aminoácidos) por los transportadores específicos expresados en las membranas del plasma EC^1,2,3. La capa CE es altamente polarizada con respecto a la distribución de los diferentes transportadores entre el luminal (sangre-orientado) y abluminal (orientada al cerebro membranas) para permitir el transporte vectorial y específica función^4,5 . Mientras que el BBB es protectora con respecto a regular bien el ambiente de la CNS, es un gran desafío para la entrega de la droga del CNS en enfermedades como la enfermedad de Parkinson con un BBB funcional. Incluso en enfermedades neurológicas con disfunción BBB, no puede suponerse que la entrega de drogas cerebro aumenta particularmente ya que la disfunción de la barrera puede incluir daño a los objetivos específicos del transportador por ejemplo como en la enfermedad de Alzheimer (AD). En DC, varios transportadores de beta amiloide como LRP1, rabia, P-gp se saben que existen y por lo tanto dirigidos a estos transportadores podrían ser inútil^6,7,8. El BBB se deteriora en varias enfermedades neurológicas como meningitis tiempos, AD, esclerosis múltiple y en tumores de cerebro^9,10,11. Restaurar la función barrera es una parte crucial de la estrategia terapéutica y por lo tanto su evaluación es fundamental.

En este trabajo, hemos descrito una objetiva y cuantitativa protocolo para ensayo de permeabilidad en roedores que hemos aplicado con éxito a varias líneas de ratón ambos enfermedad transgénicos y experimental modelos^{10,12,13 ,14}. El método se basa en una simple inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión de los ratones para eliminar los marcadores desde el compartimiento vascular. Cerebro y otros órganos son recogidos post perfusión y permeabilidad determinada por un objetivo e índice de permeabilidad absoluta basados en mediciones de la fluorescencia de homogenados de tejido en un lector de placas. Todos los valores de fluorescencia crudo se corrigen para el fondo usando homogenados de tejidos o del suero de animales simulada que no reciben ningún trazador. Normalizar un amplio se incluyen volumen de suero, suero fluorescencia y el peso de los tejidos, produciendo así el índice de permeabilidad absoluta y comparables entre experimentos y tipos de tejidos. Para facilitar la comparación entre grupos, los valores de índice de permeabilidad absoluta pueden ser fácilmente transformados a las relaciones que habíamos realizado previamente¹². Al mismo tiempo, almacenado hemi-cerebro y el riñón podrían utilizarse para la visualización de tracer por fluorescencia microscopía¹⁰. La microscopia de fluorescencia clásica podría ser valiosa en la obtención de diferencias regionales en la permeabilidad aunque engorroso debido a la selección subjetiva de las secciones de tejido e imágenes para el análisis semi-cuantitativo. Se presentan los pasos detallados en el protocolo y se añaden notas en su caso. Esto proporciona la información necesaria para realizar con éxito el ensayo de permeabilidad en vivo en ratones que pueden ampliarse a otros animales pequeños. El ensayo se puede aplicar a muchos tipos de marcadores que permiten la carga y el tamaño basado en evaluación de la permeabilidad por una combinación de marcadores con espectros de fluorescencia distintas.

Protocolo

Todos los animales se manejaron con mucho cuidado, minimizar el dolor o malestar durante el procedimiento. Este procedimiento sigue las pautas de cuidado de los animales de nuestra institución y ha sido aprobado por el Comité local (Regierungspraesidium Darmstadt, número de homologación de FK/1044).

Un esquema de los pasos de trabajo para en vivo ensayo de permeabilidad en los ratones se muestra en la figura 1. A continuación se describen los detalles de cada paso

1. manejo de animales

1. Preparación y administración de marcadores y anestésicos
   1. Preparar tubos etiquetados y moldes para inclusión por lo menos un día antes del ensayo de la permeabilidad tisular. Mantener las condiciones estériles durante el protocolo trabajando bajo campana limpia y utilizando herramientas limpiadas con etanol al 80%. Uso masculino o femenino tipo salvaje (WT) o ratones de CD1 (GOF) de ganancia de función de angiopoyetina-2 (Ang-2) en el grupo de edad adulto madurito de 3 a 6 meses para el protocolo actual. Realizar el Genotipado de los ratones como se describió anteriormente ¹⁰.
      Nota: 80% de alcohol no dará lugar a instrumentos estériles pero reducirá al mínimo la contaminación de las muestras preparadas.
   2. Diluir todos los trazadores en PBS estéril en las existencias de 2 mM y almacenar las alícuotas protegidas de la luz a-20 ° C.
   3. Elegir marcadores como (tetrametil rodamina) TMR y (isotiocianato de fluoresceína) FITC con espectros de excitación/emisión distinta y lisina pueden corregir dando por resultado interferencia mínima entre los tintes por microscopía de fluorescencia (con la TMR o FITC filtro respectivamente) y por fluorometría en un lector de placas para el ensayo de permeabilidad.
      Nota: Dextrano TMR 3 kD y FITC dextrán 3 kD utilizados en el estudio son ambas lisina pueden corregir y por lo tanto, podría también ser utilizado para inmunohistoquímica análisis posteriores a la fijación con los aldehinos para investigar las diferencias regionales.
   4. Manejar todos los animales con mucho cuidado siguiendo las pautas de atención institucional. Inyectar por vía intraperitoneal cada ratón con 100 μl trazador solución puede aumentarse hasta 200 μL cuando un indicador adicional se combina con 100 μl de cada indicador en una mezcla 1:1^10,13. Inyectar al menos un animal con PBS solo en lugar de los trazadores para servir como control de farsa para sustracción de fondo de autofluorescencia.
   5. 5 minutos después de la inyección del trazador, anestesiar al animal con una inyección i.p de ketamina y xilacina (100 mg y 5-10 mg en 0,9% de solución salina por kg cuerpo respectivamente, peso 150 μL del cóctel por ratón de 25 g).
      Nota: Ungüento veterinario no se aplicó en los ojos durante el procedimiento como el periodo de anestesia animal y perfusión/sacrificio fue breve (10 minutos) donde cualquier sequedad de los ojos no se observó.
2. Perfusión cardíaca y colección de la sangre
   1. Preparar los animales para perfusión cardiaca 10 min después de la administración anestésica. Comprobar la ausencia de respuesta de contracción de la pata con el fin de asegurar que el animal alcanza un plano quirúrgico de anestesia.
   2. Colocar los animales en su espalda y aplicar etanol al 80% en la piel del área abdominal. Con unas tijeras pequeñas, abrir la pared abdominal con una pequeña incisión (2 cm) justo debajo de la caja torácica. Separar el hígado del diafragma y cortan lentamente a través del diafragma exponiendo la cavidad pleural ¹⁵.
   3. Cortar la caja torácica bilateral y fijar el esternón cortado para el ventrículo izquierdo. Inserte una aguja calibre 21 mariposa conectada a un sistema de perfusión peristáltica en la parte posterior del ventrículo izquierdo.
   4. Perforar la aurícula derecha y rápidamente (dentro de 10 s) recoger 200-300 μL de sangre que se libera en la cavidad de pecho utilizando pipetas de 1 mL (con el corte final) en tubos de suero y almacenar en hielo.
      Nota: Este procedimiento de perfusión es no sobrevivir.
   5. Tan pronto como se recoge la sangre, activar el sistema de perfusión (10-12 rpm, 5 mL/min) y perfusión del animal por 3 min con calor (RT) 1 x PBS (libre del Ca^{2 +}iones de Mg^{2 +} ).
      Nota: PBS que contenga Ca^{2 +}/Mg^{2 +} iones pueden ser utilizados para la mejor actividad del corazón durante la perfusión. La cantidad total de PBS utilizados para perfusión está en el rango de 15-20 mL.
   6. Evaluar la calidad de perfusión observando el color del hígado, los riñones, que aparecen blanco/pálido después de la perfusión.
      Nota: Riñón o perfusión hepática no necesariamente indican perfusión cerebral como arterias (carótida, vertebral) alcanzar el cerebro desde la aorta puede rompen durante la preparación en el paso 3, particularmente durante la punción atrial.

2. tejido procesamiento

1. Almacenamiento y recogida de órgano
   1. Al final de la perfusión, confirman muerte de los animales por dislocación cervical y cosecha cerebro y riñones. Perfusión cerebral para comprobar el color de los cerebros (no hay sangre visible en los vasos de las meninges), con el fin de excluir a los animales de análisis de permeabilidad cuando la calidad de la perfusión no es buena. Separar el cerebro en 2 hemibrains con un bisturí (figura 1).
   2. Disecar con un bisturí una hemibrain libre de lóbulos olfativos y cerebelo y transfiera el hemicerebrum a un tubo de 2 mL. Guarde la hemi-cerebelo en un tubo adicional si es necesario para la evaluación de la permeabilidad cerebelosa.
   3. Transferencia de un solo riñón a otro tubo de 2 mL. Almacenar las muestras inmediatamente en hielo seco.
   4. Integrar nativamente el riñón restante y hemi-cerebro (formado por el cerebelo y los lóbulos olfativos) en temperatura óptima de corte de tejido-tek (O.C.T) compuesto de hielo seco.
   5. Al final, centrifugar las muestras de sangre almacenadas en hielo en tubos de suero en 10, 000 g, 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante suero a tubos de 1,5 mL y colocarlos en el contenedor de hielo seco.
   6. Transferencia de todas las muestras recolectadas en hielo seco al congelador de-80 ° C hasta el procesamiento posterior.
      Nota: Es importante a la congelación de las muestras antes de proceder a los pasos de homogeneización homogeneización eficiencia aumenta después de congelación descongelación.
2. Homogenización y la centrifugación
   1. Descongelar el hielo las hemi-cerebro y riñón muestras congeladas a-80 ° c y pesar los tubos que contienen los órganos. De estos pesos, reste el valor medio de varios tubos de vacíos (sobre 20) para obtener el peso del tejido. Añadir 300 μl y 200 μL de frío 1 X PBS para los tubos con riñón y hemi-cerebro, respectivamente.
      Nota: para cantidades menores de tejido (como hemi-cerebelo, por debajo de 100 mg) se recomienda el peso de los tubos individuales.
   2. Homogeneizar cada muestra en el tubo original de eppendorf con un mortero de politetrafluoroetileno (PTFE) conectado a un agitador eléctrico de arriba (1, 000 rpm) realizando 15 movimientos (1 movimiento = 1 arriba y 1 abajo). Enjuagar el mortero con PBS entre muestras y secar antes de proceder a la siguiente muestra.
      Nota: El uso de detergentes durante la homogeneización fue evitado debido a posibles interferencias con los análisis de fluorescencia. Sin embargo, tracer intracelular también se detecta en este protocolo como el tejido es completamente homogeneizado, que es más eficiente después de una ronda de congelación descongelación.
   3. Almacenar las muestras homogeneizadas en hielo protegido contra luz y centrífuga todos junto al final a 15.000 g, 20 min, 4 ° C en una centrifuga de mesa. Transferir sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mL en hielo de inmediato fluorometría o a-80 ° C que se analizará más adelante.
3. Cuantificación y medición de la fluorescencia
   1. Si congelado al final del paso anterior, descongelar en el hielo las muestras de tejido sobrenadante y sueros almacenadas a-80 ° c proteger de la luz con el papel.
   2. Pipetear 50 μl de suero diluido (30 μL 1 x PBS + 20 suero μL) o sobrenadantes de tejido (como es) en una placa de 384 pozos negra. Incluir al menos una muestra de animales simulada para el sobrenadante suero y tejido para sustracción de fondo adecuada, este fondo de homogeneizado de tejido es normalmente más alto que el de PBS que se utiliza como diluyente.
      Nota: Un promedio de 3 animales simulada puede utilizarse para autofluorescence aunque se observó una muy poca variabilidad en los valores de la autofluorescencia de sham (datos no mostrados). Puede reducir la cantidad de suero utilizado diluyendo con PBS, que también puede aumentar la relación señal a ruido para muestras con fluorescencia bajo tales como las muestras de cerebro. Hasta 10 μl suero fue probado diluir con 40 μl PBS. Asegúrese de que no hay burbujas están presentes en los pozos.
   3. Inserte la placa de 384 pozos negra en el lector de la placa y abrir un nuevo script seleccionar medición de fluorescencia.
   4. Establece la ganancia en óptimo y utilizar valores de excitación/emisión (nm) de 550/580 o 490/520 para TMR o FITC dyee respectivamente y comenzar la medición para obtener las unidades de materia prima de la fluorescencia (RFUs).
   5. Utilizar las unidades de materia prima de la fluorescencia (RFUs) desde el lector de la placa para calcular el índice de permeabilidad (PI) después de restar los valores correspondientes de la farsa.
      1. * Índice de permeabilidad (mL/g) = (Peso de tejido tejido RFUs/g) / (suero suero RFUs/mL)
   6. Ejemplo cálculo de índice de permeabilidad cerebral (PI) del animal GOF1 (tabla 1):
      1. GOF1 cerebro RFUs - SHAM cerebro RFUs = 154-22.5 = 131,5
      2. GOF1 suero RFUs - suero SHAM RFUs = 38305-27 = 38278
      3. Peso (g) del cerebro = 0.195
      4. Volumen de suero (ml) = 0,02
      5. Índice de permeabilidad (10^-3 mL/g) del cerebro = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
         Nota: Los cálculos del índice de permeabilidad límite absoluto y comparables entre experimentos y tipos de tejidos. Estos sin embargo se pueden presentar como ratios para facilitar la comparación entre 2 grupos de ¹². Esto puede lograrse dividiendo lo PI de cada animal en ambos grupos con el PI media del grupo control, la media del grupo control a través de 1 sin embargo mantener la variación animal de inter en el grupo control de conducción. Esta transformación proporciona valores para el grupo experimental (o grupos) en relación con grupo de control 1.
4. Visualización de la inmunofluorescencia del trazador
   1. Corte los bloques del hemi-riñón, cerebro integrados nativamente en compuesto de tejido-tek (O.C.T) (paso 2.1) en μm 10 secciones en un criostato a-20 ° C y transferir las secciones a las diapositivas en temperatura ambiente. Una vez que las secciones son secadas (30 minutos), transferencia de diapositivas a congelador de-80 ° C hasta su uso.
   2. En el día de la coloración, descongelar los portaobjetos a 37 ° C durante 10 minutos y luego fijar las secciones con 4% paraformaladehyde (PFA) durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de lavado rápido, en PBS.
   3. Incubar las secciones en buffer de permeabilización/bloqueo de PBS estéril que contiene BSA 1% y 0.5% Tritón X-100 pH 7,5 por 1 h a temperatura ambiente.
   4. Incube los portaobjetos durante 1,5 h a temperatura ambiente con el anticuerpo primario CD31 (0.5 mg/ml, clon MEC 13.3), diluido en 1: 100 en solución tampón que contiene PBS estéril, BSA 0.5%, 0.25% Tritón X-100 (pH 7,2) seguido de tres lavados de 5 minutos en PBS.
   5. Realizar incubación del anticuerpo secundario en el tampón anterior por 1 h a temperatura ambiente con sobre etiquetado fluorescente anticuerpos diluido 1: 500 (2 mg/mL). Para CD31, cabra anti-rata 568 Alexa o Alexa 488 se puede utilizar en una dilución de 1: 500. Incluyen DAPI (300 μm) en el anticuerpo secundario mezcla (1:1, 000 dilución del material) para la tinción de los núcleos.
   6. Monte las secciones manchadas con aqua NILÖN y dejarlo toda la noche para la polimerización a temperatura ambiente en oscuridad.
   7. Adquisición de imágenes mediante un láser confocal de imágenes espectral sistema de microscopio de la exploración. Análisis de imágenes por software de elementos de NIS (versión 4.3). Puede utilizarse software como Photoshop para la generación de figuras de montaje.

Resultados

Recientemente hemos demostrado que ratones de (GOF) de ganancia de función de angiopoyetina-2 (Ang-2) tienen mayor permeabilidad vascular cerebral que los ratones de control en condiciones saludables¹⁰. En los ratones inducidos por el movimiento, era también muestra que los ratones GOF tenían mayor tamaño del infarto y mayor permeabilidad de los hermanos de camada de control. Estos resultados demuestran un papel crítico de Ang-2 de la permeabilidad en el BBB. ...

Discusión

Disfunción de la barrera blood - brain se asocia con un número de trastornos neurológicos, como tumores cerebrales primarios y secundarios o un accidente cerebrovascular. Desglose BBB a menudo se asocia con edema peligroso para la vida de CNS. La elucidación de los mecanismos moleculares que provocan la apertura o cierre de la BBB es por lo tanto de importancia terapéutica en trastornos neurológicos y comúnmente investigado por los investigadores. Sin embargo, los métodos para investigar permeabilidad BBB en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R