In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Summary

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

Abstract

מחסום הדם - מוח (BBB) היא מכשול מיוחדים מגן microenvironment למוח את הרעלים ואת פתוגנים במחזור ושומר על הומאוסטזיס המוח. האתרים העיקריים של המכשול הם תאי אנדותל של הנימים במוח שתפקידם המכשול נובעת צמתי המערכת צר, מסועי בזרימת הביע על קרום פלזמה. פונקציה זו מוסדר על ידי pericytes, האסטרוציטים היוצרים יחד את יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ, מחלת אלצהיימר (AD), גידולים במוח קשורים עם תפקוד לקוי BBB. הערכה של החדירות BBB לכן חשוב בהערכת חומרת המחלה הנוירולוגית וההצלחה של אסטרטגיות טיפול המועסקים.

אנו מציגים כאן פשוטה אך assay חדירות חזקות זה הוחלו בהצלחה על העכבר מספר מודלים שניהם, גנטית ו ניסיוני. השיטה היא מאוד כמותי ואובייקטיבי לעומת הניתוח פלורסצנטיות מעקב על ידי מיקרוסקופ שמוחל כלל. בשיטה זו, עכברים מוזרקים intraperitoneally עם שילוב של מימית המשדרים פלורסנט אינרטי ואחריו מאלחש העכברים. זלוף הלב של בעלי החיים מבוצע לפני הקטיף במוח, בכליות או איברים אחרים. האיברים הומוגני, centrifuged ואחריה פלורסצנטיות מדידה תגובת שיקוע. דם מן הלב הניקוב רק לפני זלוף משמש לצורך נורמליזציה כדי תא כלי הדם. קרינה פלואורסצנטית הרקמה הוא מנורמל כדי פלורסצנטיות משקל, סרום רטוב להשיג כמותיים מעקב חדירות אינדקס. לאישור נוסף, contralateral המי-המוח יחסית אימונוהיסטוכימיה יכול להיות מנוצל למטרות הדמיה פלורסצנטיות מעקב.

Introduction

מחסום הדם - מוח (BBB) מורכב microvascular אנדותל התאים (ECs) נתמך על ידי הדוק pericytes (אישיים), אשר ensheathed בתוך הנדן הבזליים, ו האסטרוציטים (ACs) זה לעטוף את קרום המרתף ברגליים הסוף-^{1 ,2}. ECs אינטראקציה עם מספר סוגי תאים תומכים, לווסת את הפונקציה מכשול, בעיקר ACs ומחשבים, גם נוירונים ואת מיקרוגלייה, אשר כולם יחד יוצרים יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). NVU היא קריטית עבור הפונקציה של BBB, אשר מגביל את התעבורה של רעלים נישא בדם, פתוגנים מלהיכנס המוח. פונקציה זו היא תוצאה של מולקולות חזק-צומת claudin-5, occludin, zonula occludens-1, אשר נמצאים בין ה-ECs וגם עקב הפעולה של מובילי כגון p-גליקופרוטאין (P-gp) בזרימת את מולקולות מזין את אנדותל בחזרה כלי לומן^1,2,3. BBB עם זאת מאפשר עבור הובלה של מולקולות חיוניים כגון חומרים מזינים (גלוקוז, ברזל, חומצות אמינו) על ידי מובילי ספציפיים הביע על^2,31,ממברנות פלזמה EC. השכבה EC הוא מקוטב מאוד לגבי חלוקת למעליות שונים בין luminal (דם הפונה) לבין abluminal (המוח הפונה ממברנות) כדי לאפשר וקטורי וספציפית התחבורה פונקציה^4,5 . בעוד BBB הוא מגן ביחס בחוזקה המסדיר את חצרו CNS, זה אתגר גדול עבור משלוח סמים CNS מחלות כגון פרקינסון עם BBB פונקציונלי. אפילו במחלות נוירולוגיות עם תפקוד לקוי של BBB, זה לא יכול להניח כי משלוח סמים המוח מוגברת במיוחד בזכות תפקוד המחסום יכול לכלול נזק על מטרות טרנספורטר ספציפי למשל כמו מחלת אלצהיימר (AD). לספירה, מספר שנאים עמילואיד ביתא כגון LRP1, זעם, P-gp ידועים להיות dysregulated, ומכאן מיקוד שנאים אלה עשוי להיות חסר תועלת^6,7,8. BBB היא נפגעת מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ מוחי, לספירה, דלקת קרום המוח,-טרשת נפוצה, ואת המוח גידולים^9,10,11. שחזור הפונקציה מכשול הוא חלק חיוני של האסטרטגיה הטיפולית, ובכך בהערכתו הוא קריטי.

בעבודה זאת, שתיארנו אובייקטיבית, הפרוטוקולים כמותית של חדירות assay בחולדות כי אנחנו הוחלו בהצלחה מספר קווים העכבר בשתי מחלות הטרנסגניים וניסויים מודלים^{10,12,13 ,14}. השיטה מבוססת על זריקה בקרום הבטן פשוטה של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף של העכברים כדי להסיר את המשדרים תא כלי הדם. למוח ולאיברים נוספים הם פוסט שנאספו זלוף, חדירות לאומדן אובייקטיבית ואינדקס חדירות מוחלטת על סמך מדידות קרינה פלואורסצנטית של רקמת homogenates ב קורא צלחת. כל הערכים פלורסצנטיות raw מתוקנות על רקע באמצעות רקמות homogenates או סרום מחיות המזויפים שאינם מקבלים כל מעקב. Normalizations בשפע כלולים עבור נפח סרום נסיוב פלורסצנטיות, המשקל של הרקמות, ובכך מניב אינדקס חדירות מוחלטת, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. כדי להקל על ההשוואה בין הקבוצות, ערכי אינדקס חדירות מוחלט יכול בקלות להיהפך ל יחסי כפי שאנחנו ביצע בעבר¹². במקביל, מאוחסנות המי-המוח וכליות יכול להיות מנוצל להמחשת נותב על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ¹⁰. מיקרוסקופיה זריחה קלאסי יכול להיות יקר בהשגת אזורי השוני חדירות אמנם מסורבלת עקב בחירה סובייקטיבית של מקטעי רקמת ותמונות עבור ניתוח כמותי למחצה. השלבים המפורטים מוצגים בפרוטוקול, הערות נוספות בהתאם לצורך. פעולה זו מספקת את המידע הדרוש לביצוע בהצלחה וזמינותו חדירות ב- vivo בעכברים כי ניתן לשנות אחרים חיות קטנות. הבדיקה ניתן להחיל על סוגים רבים של המשדרים ומאפשר את החיוב ואת הגודל המבוסס על חדירות הערכה ע י שילוב של המשדרים עם פלורסצנטיות ברורים ספקטרה.

Protocol

כל החיות שטופלו עם ש"צריך מזעור כאב או אי נוחות במהלך ההליך. הליך זה עוקב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של מוסדנו, אושרה על ידי הוועדה המקומית (Regierungspraesidium דרמשטט, אישור מספר FK/1044).

תיאור סכמטי של השלבים בעבודה ויוו חדירות assay בעכברים מוצג באיור1. הפרטים של כל שלב שיפורטו להלן.

1. לטיפול בבעלי חיים

1. הכנה וניהול של המשדרים, הרדמה
   1. להכין תבניות שפופרות שכותרתו רקמות הטבעה לפחות יום לפני וזמינותו חדירות. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל הפרוטוקול על ידי עובד תחת מכסה המנוע נקי fume באמצעות כלים לנקות עם 80% אתנול. השתמש זכר או נקבה פראי-סוג (WT) או angiopoietin-2 (אנג-2) רווח-של-פונקציה CD1 (GOF) עכברים בקבוצת הגיל מבוגר בוגר של 3-6 חודשים עבור פרוטוקול הנוכחי. לבצע genotyping של העכברים כפי שתואר לעיל ¹⁰.
      הערה: 80% אלכוהול לא יביא כלי סטרילי אך יצמצם זיהום של הדגימות מוכן.
   2. לדלל את כל המשדרים ב- PBS סטרילי לתוך 2 מ מ מניות ולאחסן את aliquots מוגן מפני אור ב-20 ° C.
   3. לבחור המשדרים כגון (Tetramethyl Rhodamine) TMR, (fluorescein isothiocyanate) FITC עם עירור ברורים/פליטת ספקטרום וכי הן ליזין שניתן לתקן וכתוצאה להפרעה מזערית בין צבעים הן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (באמצעות את TMR או FITC לסנן בהתאמה) על ידי fluorometry ב קורא צלחת עבור וזמינותו חדירות.
      הערה: TMR לתוספי 3 kD, FITC לתוספי 3 kD השתמשו במחקר הם שני ליזין ניתן לתיקון, ומכאן יכול גם לשמש עבור קיבוע שאחרי ניתוח immunohistochemical עם aldehydes על מנת לחקור הבדלים אזוריים.
   4. להתמודד עם כל החיות עם ש"צריך לבצע את ההנחיות לטיפול מוסדי. מזריקים intraperitoneally העכבר כל 100 פתרון מעקב µL אשר ניתן להגדיל עד 200 µL כאשר מעקב נוספים משולב באמצעות µL 100 של מעקב כל^10,1:1 לערבב¹³. מזריקים חיה אחת לפחות PBS לבד במקום המשדרים כדי לשמש המזויפים למזגן autofluorescence רקע חיסור.
   5. 5 דקות לאחר ההזרקה tracer, עזים ומתנגד החיה עם זריקה מקומות של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (100 מ ג ו- 5-10 מ"ג ב- 0.9% תמיסת מלח לכל ק"ג גוף משקל בהתאמה, µL 150 של. הקוקטייל לכל 25 g העכבר).
      הערה: משחה הוטרינר לא הוחל על העיניים במהלך ההליך כמו בתקופה שבין בעלי חיים הרדמה והקרבה/זלוף היה קצר (10 דקות) שבו כל ייבוש העיניים לא נצפתה.
2. דם הלב ואוסף זלוף
   1. להכין את החיות זלוף לב 10 דקות לאחר הרדמה. בדוק היעדר תגובה עווית כפה על מנת להבטיח כי החיה הגיע מטוס כירורגי של הרדמה.
   2. לשים את בעלי החיים שלהם בחזרה ולהחיל 80% אתנול על העור של אזור הבטן. בעזרת מספריים קטנות, לפתוח את קיר הבטן עם חתך קטן (2 ס מ) רק מתחת לצלעות. להפריד בין הכבד מהסרעפת ולאחר מכן לאט לחתוך דרך הסרעפת לחשוף את חלל הצדר ¹⁵.
   3. לחתוך את כלוב הצלעות בשני הצדדים ותקן עצם החזה שנגזרו על מנת לחשוף את החדר השמאלי. הכנס מחט 21-מד פרפר מחובר דרך מערכת סינון זלוף. הצד האחורי של החדר השמאלי.
   4. לנקב אטריום ימין במהירות (תוך 10 s) לאסוף 200-300 µL של דם שוחרר לתוך הפתח שבחזה באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל (עם סיום ניתוק) בסרום אוסף צינורות ולאחסן אותו בקרח.
      הערה: הליך זלוף זה ההישרדות.
   5. ברגע הדם נאסף, אדליק את המערכת זלוף (10-12 סל ד, 5 mL/min), perfuse החיה למשך 3 דקות עם חמים (RT) 1 x ל- PBS (חינם של Ca^{2 /}מ"ג^{2 +} יונים).
      הערה: PBS המכיל Ca^{2 +}/Mg^{2 +} יונים יכול להיות מנוצל עבור פעילות הלב טוב יותר במהלך זלוף. הסכום הכולל של PBS המשמש זלוף הוא בטווח של 15-20 מ.
   6. להעריך איכות זלוף מאת וציין את הצבע של הכבד, הכליות, אשר מופיעים לבן/חיוור לאחר זלוף.
      הערה: בכליות או בכבד זלוף אינן מצביעות בהכרח על המוח זלוף כמו עורקים (עורק הצוואר/בחוליות) מתוכניות המוח של אבי העורקים עלול לקבל נקרע במהלך הכנת בשלב 3 במיוחד במהלך הניקוב פרפור.

2. ברקמה

1. אורגן איסוף ואחסון
   1. בסוף זלוף, לאשר את מותו של החיה על ידי נקע בצוואר הרחם, המוח מסיק והכליות. ודא זלוף המוח לפי הצבע של המוח (גלוי דם בכלי של קרומי המוח), כדי לא לכלול את החיות מניתוח חדירות כאשר איכות זלוף אינה טובה. הפרד בין המוח לתוך 2 hemibrains באמצעות אזמל (איור 1).
   2. לנתח עם האזמל hemibrain אחד ללא הריח אונות, המח ולהעביר את hemicerebrum צינור 2-mL. לאחסן המי-המוח הקטן צינור נוסף אם נדרש להערכת אסטרוציטומה חדירות.
   3. העברה כליה בודדת עוד צינור 2-mL. לאחסן את הדגימות מיד קרח יבש.
   4. הטבע באופן מקורי את הכליה הנותרת ואת המי-מוח (הכוללת את המוח ואת הריח אונות) רקמה-tek חיתוך אופטימאליים טמפרטורה (O.C.T) המורכב על קרח יבש.
   5. בסופו של דבר, centrifuge את דגימות הדם המאוחסן על הקרח סרום אוסף צינורות-10, 000 גרם, 10 דקות ב 4 º c להעביר סרום supernatants 1.5 mL צינורות ומניחים בתוך המיכל קרח יבש.
   6. העברת כל הדגימות שנאספו על קרח יבש ל-80 מעלות צלזיוס למקפיא עד עיבוד נוסף.
      הערה: חשוב להקפיא את הדגימות לפני שממשיכים לשלבים המגון כמו המגון מגביר יעילות לאחר כמו הקפאת מפשיר.
2. המגון, צנטריפוגה
   1. להפשיר על הקרח הדגימות המי-המוח לבין הכליות קפואים למטה ב-80 מעלות צלזיוס ולשקול הצינורות המכילים את האיברים. מכל אלה משקולות, להחסיר את הערך הממוצע של שפופרות ריק מספר (בערך 20) כדי לקבל את המשקל רקמות. להוסיף 300 µL ו- µL 200 קר 1 X PBS כדי הצינורות המכילים הכליה ואת המי-המוח הגדול, בהתאמה.
      הערה: עבור כמויות נמוכות של רקמות (כמו המי-המוח הקטן, להלן 100 מ"ג) במשקל של צינורות בודדים מומלץ.
   2. Homogenize כל מדגם בצינור גלאים המקורי עם כבעלי טפלון (PTFE) המצורפת של בחישה תקורה חשמלי (1, 000 סל ד) על-ידי ביצוע כ-15 קווים (קו 1 = 1 למעלה ולמטה 1). לשטוף את המרוסקים עם PBS בין דגימות, לנגב היבש לפני שתמשיך את הדוגמה הבאה.
      הערה: השימוש דטרגנטים במהלך המגון היה נמנע עקב הפרעה אפשרית עם fluorometry. עם זאת, מעקב תאיים מזוהה גם ב פרוטוקול זה כמו הרקמה ביסודיות הוא הומוגני, אשר יעיל יותר לאחר סיבוב אחד של הקפאת מפשיר.
   3. לאחסן את הדגימות homogenized על הקרח מוגן מפני האור ואת כולם ביחד בסופו של דבר ב 15,000 g, 20 דקות, 4 ° C ומפרידה שולחן צנטריפוגה. העברה supernatants צינורות 1.5 mL החדש על הקרח מיידית fluorometry או ב- 80 ° C כדי להיות מנותח מאוחר יותר.
3. פלורסצנטיות מדידה ו כמת
   1. אם קפוא בסוף השלב הקודם, להפשיר על קרח את תגובת שיקוע, סרום דגימות רקמה המאוחסנים ב-80 הלעפה תרוטרפמט ולהגן עליהם מפני אור עם מסכל.
   2. פיפטה µL 50 של סרום מדולל (PBS 1 x µL 30 + סרום µL 20) או רקמה supernatants (כמו) לתוך צלחת שחורה 384-. טוב. כוללים מדגם אחד לפחות מן החי מזויפים עבור supernatants סרום ורקמות להבטיח רקע נכון חיסור, רקמת homogenate הוא בדרך כלל גבוה מזה של PBS משמש את diluent.
      הערה: ממוצע של 3 חיות דמה יכול לשמש autofluorescence למרות השתנות מעט מאוד בערכים autofluorescence דמה (נתונים לא מוצג) נצפתה. כמות הנסיוב בשימוש יכול להיות מופחת על ידי לדלל אותה עם PBS, אשר יכול גם להגביר את האות לרעש יחס עבור דגימות עם פלורסצנטיות נמוך כגון הדגימות המוח. סרום µL Upto 10 נבחנה לדלל אותה עם 40 µL PBS. ודא כי אין בועות נמצאים הבארות.
   3. תכניס את הצלחת שחור 384-ובכן לקורא צלחת ופתח תסריט חדש בחירת פלורסצנטיות מדידה.
   4. להגדיר הרווח של האופטימלית, לשימוש עירור/פליטה (ננומטר) הערכים של 550/580 או 490/520 TMR או FITC dyee בהתאמה ולהתחיל את המדידה כדי להשיג את יחידות קרינה פלואורסצנטית raw (RFUs).
   5. להשתמש את יחידות קרינה פלואורסצנטית raw (RFUs) מהקורא צלחת לחישוב מדד חדירות (PI) לאחר הפחתת את הערכים המזויפים.
      1. * אינדקס חדירות (mL/g) = (משקל רקמות רקמות RFUs/g) / (סרום נסיוב RFUs/mL)
   6. למשל חישוב עבור המוח חדירות אינדקס (PI) של החיה GOF1 (טבלה 1):
      1. GOF1 המוח RFUs - דמה המוח RFUs = 154-22.5 = 131.5
      2. GOF1 סרום RFUs - בשאם נסיוב RFUs = 38305-27 = 38278
      3. המוח משקל (g) = 0.195
      4. סרום נפח (ml) = 0.02
      5. המוח חדירות אינדקס (10^-3 g/mL) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
         הערה: החישובים אינדקס חדירות תשואות ערכים מוחלטים, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. אלה עם זאת ניתן להציג כמו יחסי, כדי להקל על ההשוואה בין 2 קבוצות ¹². זו יכולה להיות מושגת על ידי חלוקת החוקר של כל בעל חיים בשתי הקבוצות עם החוקר מתכוון בקבוצת הבקרה, נהיגה הממוצע קבוצת הבקרה באמצעות 1 עדיין שומר את הווריאציה בעלי חיים של אינטר בקבוצת הביקורת. השינוי הזה מספק את הערכים של הקבוצה הניסיונית (או קבוצות) ביחס קבוצת הביקורת מוגדר כ- 1.
4. Immunofluorescence ויזואליזציה של מעקב
   1. חותכים את אבני כליה/חמי-מוח מוטבע באופן מקורי במתחם רקמות-tek (O.C.T) (שלב 2.1) 10 מיקרומטר מקטעים cryostat מוגדר כ-20 ° C ולהעביר הסעיפים על השקופיות ממוקמים בטמפרטורת החדר. ברגע הסעיפים הם יבשים (בערך 30 דקות), העברת שקופיות מקפיא-80 ° C עד השימוש.
   2. ביום של צביעת, להפשיר את השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לתקן את הסעיפים עם 4% paraformaladehyde (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריה כביסה מהירה ב- PBS.
   3. דגירה בסעיפים permeabilization/חסימת מאגר של PBS סטרילי המכיל 1% BSA ו- 0.5% טריטון X-100 pH 7.5 לשעה בטמפרטורת החדר.
   4. דגירה שקופיות עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר עם נוגדן ראשוני CD31 (0.5 מ"ג/מ"ל, כפיל MEC 13.3), מעורבבת עם בטחונות במאגר המכיל PBS סטרילי, BSA 0.5%, 0.25% טריטון X-100 (pH 7.2) ואחריו שלושה שוטף 5 דקות ב- PBS.
   5. לבצע נוגדנים משניים הדגירה במאגר לעיל לשעה בטמפרטורת החדר עם תלויי מין fluorescently שכותרתו שבערך מדולל נוגדנים (2 mg/mL). עבור CD31, ניתן להשתמש עז אנטי חולדה אלקסה 568 או אלקסה 488-לדילול שבערך. כוללים דאפי (300 מיקרומטר) בהנוגדן משני לערבב (1:1, 000 דילול מן המלאי) כתם על הגרעינים.
   6. הר הסעיפים ויטראז'ים עם polymount אקווה ולהשאיר אותה ללילה עבור הפילמור בטמפרטורת החדר בחושך.
   7. לרכוש תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי ספקטרלי הדמיה במיקרוסקופ מערכת סריקה. לנתח את התמונות על-ידי תוכנת אלמנטים ש"ח (גירסה 4.3). תוכנות כגון פוטושופ ניתן לדור של דמויות מונטאז.

תוצאות

אנחנו הראו לאחרונה כי angiopoietin-2 (אנג-2) רווח-של-פונקציה (GOF) עכברים יש גבוה יותר חדירות כלי דם במוח מאשר עכברים שליטה תנאים בריאים¹⁰. בעכברים שבץ הנגרמת, היה זה גם מראה כי העכברים GOF היו חדירות גדולה יותר מאשר הארנבונים מאותה שליטה וגדלים לאוטם גדול יותר. תוצאות אלו...

Discussion

מחסום הדם - מוח בתפקוד מזוהה עם מספר רב של הפרעות נוירולוגיות, כולל גידולים במוח העיקרי והמשני או שבץ מוחי. התפלגות BBB קשורה לעיתים קרובות עם בצקת CNS סכנת חיים. הבהרה של המנגנון המולקולרי המפעילות את פתיחת או סגירת BBB ולכן חשיבות טיפולית בהפרעות נוירולוגיות, בדרך כלל נחקר על ידי חוקרים. עם זא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R