Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

요약

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

초록

혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.

우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.

서문

Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발^{1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2}. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘^1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막^1,,23에 의해 수 있습니다. EC 레이어 luminal (혈액 연결)와 abluminal (뇌 연결 막) 대 한 구체적이 고 vectorial 전송 기능^{4,5 수 있도록 다양 한 전송기의 분포에 관하여 매우 편광은} . BBB 단단히 CNS 환경 규제에 대해 보호 하는 동안, CNS 약물 전달 기능 BBB와 파 킨 슨 등 질환에 대 한 주요 도전 이다. BBB 장애와 신경 질환에도 장벽 부전 손상 Alzheimer의 질병 (광고)에서 예를 들어 특정 전송 대상에 포함 될 수 있습니다 때문에 특히 두뇌 약물 전달 증가 추측 될 수 없다. 광고에서 LRP1, 분노, P-gp 등 여러 가지 아 밀 로이드 베타 전송기 dysregulated 것으로 알려져 있습니다 하 고 쓸데^6,,78수 있습니다 따라서 이러한 전송기를 대상으로 합니다. BBB는 획, 광고, 수 막 염, 다 발성 경화 증 및 뇌 종양^9,,1011등 여러 신경 질환에 손상 이다. 장벽 기능 복원 치료 전략의 중요 한 부분 이며 따라서 그 평가 중요 한.

이 작품에서는, 우리는 설명 된 객관적이 고 침투성 분석 결과 우리가 성공적으로 적용할 여러 마우스 라인 모두 실험과 유전자 변형 질환 모델^{10,12,13 설치류에 대 한 양적 프로토콜 ,14}. 방법은 혈관 칸막이 추적기를 제거 뒤에 쥐의 관류 형광 추적기의 간단한 복 주사를 기반으로 합니다. 뇌 및 기타 장기 수집된 게시물 관류 및 침투성 객관적인 평가 절대 침투성 인덱스 플레이트 리더에서 조직 homogenates의 형광 측정에 따라 있습니다. 모든 원시 형광 값 조직 homogenates 또는 어떤 추적 프로그램에는 영향을 받지 않는 가짜 동물에서 혈 청을 사용 하 여 배경색을 수정할 수 있습니다. 충분 한 정규화 세럼 볼륨, 혈 청 형광, 및 조직, 따라서 저조한 침투성 인덱스를 완전 하 고 실험 및 조직 유형 사이 비교의 무게에 대 한 포함 되어 있습니다. 그룹 사이 비교의 용이성, 절대 침투성 인덱스 값 수 쉽게 변형 될 비율을 우리¹²이전 수행 했다. 동시에, 저장 된 hemi-두뇌와 신장 수 활용할 수 추적 프로그램 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법¹⁰. 고전적인 형광 현미경 검사 법 이기는 하지만 조직 단면도 및 반 정량 분석에 대 한 이미지의 주관적인 선택으로 인해 성가신 침투성에 지역 차이 얻기에 중요 한 될 수 있습니다. 자세한 단계는 프로토콜에서 제공 됩니다 그리고 적절 한 노트 추가 됩니다. 이 성공적으로 다른 작은 동물을 확장할 수 있는 쥐에서 vivo에서 침투성 시험을 수행 하기 위한 필요한 정보를 제공 합니다. 분석 결과 추적기의 많은 종류에 적용 될 수 있습니다 추적기와 독특한 형광 스펙트럼의 조합에 의해 침투성 평가 기반으로 책임과 크기에 대 한 허용.

프로토콜

모든 동물은 절차 동안 통증이 나 불편을 최소화 하는 최대 관심을가지고 처리 합니다. 이 절차 우리 기관의 동물 보호 지침을 다음과 같이 하 고 지역 위원회 (Regierungspraesidium 다름슈타트, 승인 번호 FK/1044)에 의해 승인 되었습니다.

침투성 시험 쥐에서 vivo에서 에 대 한 작업 단계의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 각 단계의 자세한 내용은 아래 설명 되어 있습니다.

1입니다. 동물 처리

1. 준비 및 추적기 및 마 취약의 관리
   1. 침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 ¹⁰쥐의 유전형을 수행 합니다.
      참고: 80% 알코올 살 균 계기 초래 하지 것입니다 있지만 준비 샘플의 오염을 최소화 됩니다.
   2. 2mm 주식으로 메 마른 PBS에 모든 추적기를 희석 하 고-20 ° c.에 빛에서 보호 하는 aliquots를 저장
   3. (Tetramethyl Rhodamine) TMR 같은 추적기를 선택 하 고 (fluorescein isothiocyanate) 고유 여기/방출 스펙트럼과는 FITC는 리 형광 현미경 검사 법에 의해 모두 염료 간의 최소한의 간섭 결과로 고칠 수 (는 TMR을 사용 하 여 또는 FITC 각각 필터)와 fluorometry 침투성 분석 결과 대 한 플레이트 리더에 의해.
      참고: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD는 연구에 사용 된 두 리 고칠 수 및 따라서 사용 될 수 있는 또한 알데하이드와 immunohistochemical 분석 후 고정 지역 차이 조사 하기 위하여.
   4. 최대한 주의 기관 관리 지침에 따라 모든 동물을 처리 합니다. 추가 추적 프로그램 1:1 믹스^10,13의 각 추적기의 100 µ L를 사용 하 여 결합 될 때 200 µ L까지 증가 될 수 있다 100 µ L 추적 솔루션으로 intraperitoneally 각 마우스를 주사. 혼자 autofluorescence 배경 빼기에 대 한 가짜 제어 역할을 추적기 대신 PBS를 가진 하나 이상의 동물을 주입.
   5. 추적 프로그램 삽입 후 5 분 anesthetize i.p 주사 마 취 제 및 Xylazine를 가진 동물 (100 mg과 5-10 밀리 그램 0.9%에서 염 분 당 킬로그램 몸 무게 각각, 150 µ L 당 25 g 마우스 칵테일의).
      참고: 수 의사 연 고는 적용 되지 눈에 절차 동안 동물 마 취과 관류/희생 사이 기간 이었다 짧은 (10 분) 관찰 되지 있던 모든 눈의 건조.
2. 혈액 수집 및 심장 관류
   1. 동물 마 취 관리 후 심장 관류 10 분에 대 한 준비. 동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다 수 있도록 발 트 위치 응답의 부재를 확인 합니다.
   2. 그들의 뒤에는 동물을 80% 에탄올 복 부의 피부에 적용. 바로 흉 곽 아래에 작은 절 개 (2 cm)와 복 벽을 열어 작은 위를 사용 하 여. 횡 경 막에서 간 고 천천히 횡 격 막 흉 막 캐비티 ¹⁵노출 극복 합니다.
   3. 양측 흉 곽을 잘라 고 왼쪽된 심 실 노출 하려면 컷된 흉 골을 해결. 좌 심 실의 뒷부분에 연동 관류 시스템에 연결 된 21-게이지 나비 바늘을 삽입 합니다.
   4. 오른쪽 아 트리 움 펑크와 신속 하 게 (10 s) 혈 청 컬렉션 튜브에 혈액 1 mL 피 펫 팁 (최종 마감)를 사용 하 여 흉 강에 발표의 200-300 µ L를 수집 하 고 얼음에 저장.
      참고:이 관류 절차는 비 생존.
   5. 즉시 혈액 수집 관류 시스템 (10-12 rpm, 5 mL/min)에 전환 하 고 따뜻한 (RT) 1 x PBS로 3 분에 대 한 동물을 perfuse (Ca의 무료^{2 +}Mg^{2 +} 이온).
      참고: PBS 포함 캘리포니아^{2 +}/Mg^{2 +} 이온 활용할 수 있습니다 더 나은 심장 활동에는 관류 동안. PBS 관류에 대 한 사용의 총 금액은 15 ~ 20 mL의 범위입니다.
   6. 간, 색상을 지적 함으로써 관류 품질 평가 신장 관류 후 화이트/창백을 표시.
      참고: 신장 또는 간 관류 반드시 나타내지 않습니다 뇌 관류로 동맥 (경 동맥/척추) 도달 뇌 대동맥에서 특히 심 방 찔린 중 3 단계에서 준비 하는 동안 파열 얻을 수 있습니다.

2. 조직 처리

1. 장기 수집 및 저장
   1. 관류의 끝에, 자 궁 경부 전위 및 수확 뇌와 신장에 의해 동물의 죽음을 확인 합니다. 관류 품질은 좋은 동물 침투성 분석에서 제외 되므로 뇌 관류 (meninges의 혈관에서 보이는 혈액), 머리의 색깔에 의해 확인 합니다. 메스 (그림 1)를 사용 하 여 2 hemibrains로 두뇌를 구분 합니다.
   2. 후 엽과 소 뇌의 무료 메스 한 hemibrain와 dissect 그리고 2 mL 튜브에는 hemicerebrum를 전송. 소 뇌 침투성 평가에 필요한 경우 추가 튜브에 헤 미-소 뇌를 저장 합니다.
   3. 다른 2 mL 튜브에 단일 신장 전송. 드라이 아이스에 샘플을 즉시 저장 합니다.
   4. 기본적으로 나머지 신장과 hemi-뇌 (소 뇌와 후 엽으로 구성 된)에 포함 조직-테크 최적의 절삭 온도 (O.C.T) 드라이 아이스에 화합물.
   5. 결국, 원심 10, 000g, 4 ° c.에서 10 분에 혈 청 컬렉션 튜브에 얼음에 저장 된 혈액 샘플 1.5 mL 튜브에 혈 청 supernatants 전송 및 드라이 아이스 컨테이너에 넣어.
   6. 추가 처리까지-80 ° C 냉장고를 드라이 아이스에 수집 된 모든 샘플을 전송 합니다.
      참고: 그것은 녹고 동결로 후 균질 효율성 증가로 균질 단계를 진행 하기 전에 샘플을 동결 하는 것이 중요입니다.
2. 균질 및 원심 분리
   1. Hemi-뇌와 신장 샘플 다운-80 ° C에서 냉동 얼음에 thaw와 장기를 포함 하는 튜브를 무게. 이러한 무게에서 조직 무게를 여러 빈 관 (약 20)의 평균 값을 뺍니다. 추가 300 µ L 및 감기 1의 200 µ L 신장과 hemi-뇌, 각각 포함 된 튜브에 X PBS.
      참고: (헤 미-소 뇌, 100 mg 아래) 같은 조직의 낮은 금액에 대 한 개별 튜브의 무게는 것이 좋습니다.
   2. 소계 (PTFE) 유 봉 약 15 스트로크를 수행 하 여 전기 오버 헤드 교 반기 (1, 000 rpm)에 연결 된과 원래 eppendorf 관에서 각 샘플을 균질 (1 스트로크 = 1 및 1 다운). 샘플 사이 PBS 가진 유 봉 헹 구 고 닦아 다음 예제를 진행 하기 전에 건조.
      참고: 균질 동안 세제의 사용 했다 fluorometry 잠재적인 간섭으로 인해 피할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 세포내 추적 감지 또한 조직을 철저 하 게 균질 한 라운드의 동결 해 동 후는 더 효율적으로.
   3. 빛과 15000 g, 20 분, 탁상 원심 분리기에 4 ° C의 끝에 모두 함께 원심 분리기에서 보호 하는 얼음에 무 균된 샘플을 저장 합니다. 즉각적인 fluorometry 또는 나중에 분석할 수-80 ° C에서 얼음에 새로운 1.5 mL 튜브 supernatants 전송.
3. 형광 측정 및 정량화
   1. 이전 단계의 끝에 동결 조직 상쾌한 및 혈 청 샘플은 호 일 빛에서 그들을 보호 하는-80 ˚C에 저장 된 얼음에 녹여.
   2. 384 잘 검정 잉크 판으로 희석된 혈 청 (30 µ L 1 x PBS + 20 µ L 세럼) 또는 (있는 그대로) 조직 supernatants의 50 µ L 플라스틱. 이 조직 homogenate 배경 일반적으로 희석제로 사용 하는 PBS의 이상으로 혈 청 및 조직의 supernatants 적절 한 배경 빼기를 보장 하기 위한 가짜 동물에서 적어도 하나의 샘플을 포함 합니다.
      참고: 3 가짜 동물의 평균 비록 가짜 autofluorescence 값 (데이터 표시 되지 않음)에 아주 작은 변화 관찰 되었다 autofluorescence에 대 한 사용할 수 있습니다. PBS, 또한 뇌 샘플 같은 낮은 형광 샘플에 대 한 신호 대 잡음 비 증가 수와 그것을 diluting 하 여 혈 청 사용의 금액을 줄일 수 있습니다. 최대 10 µ L 세럼 40 µ L PBS와 그것을 diluting 테스트를 했다. 아니 거품 우물에 있는지 확인 합니다.
   3. 384 잘 블랙 플레이트 플레이트 판독기에 삽입 하 고 형광 측정을 선택 하는 새로운 스크립트를 엽니다.
   4. 최적 이득을 설정 하 고 각각 TMR 또는 FITC dyee에 대 한 550/580 또는 490/520 여기/방출 (nm) 값을 사용 하 고 원시 형광 단위 (RFUs)를 측정 시작.
   5. 플레이트 리더에서 원시 형광 단위 (RFUs)를 사용 하 여 해당 하는 가짜 값을 뺀 후 침투성 색인 (PI) 계산.
      1. * 침투성 인덱스 (mL/g) = (조직 RFUs/g 조직 중량) / (혈 청 RFUs/mL 혈 청)
   6. 예제 계산 뇌 침투성 색인 (PI)에 대 한 동물 GOF1의 (표 1).
      1. GOF1 RFUs-가짜 뇌 RFUs 뇌 = 154-22.5 131.5 =
      2. GOF1 혈 청 RFUs-가짜 혈 청 RFUs 38305-27 = = 38278
      3. 뇌의 무게 (g) = 0.195
      4. 혈 청 볼륨 (ml) = 0.02
      5. 뇌의 침투성 인덱스 (10^-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
         참고: 침투성 인덱스 계산 항복 값을 절대 및 실험 및 조직 유형 사이 비교. 그러나 이들은 2 그룹 ¹²사이 비교의 용이성에 대 한 비율으로 제시 될 수 있습니다. 이 두 그룹에 각 동물의 PI 1 아직 유지 간 동물 변형 제어 그룹에서 통해 컨트롤 그룹 평균 운전 제어 그룹의 평균 PI와 함께 나누어 얻을 수 있습니다. 이 변화는 1로 설정 하는 컨트롤 그룹을 기준으로 실험 그룹 (또는 그룹)에 대 한 값을 제공 합니다.
4. 추적의 면역 형광 시각화
   1. 10 µ m는 cryostat에 섹션-20 ° C로 설정 하 고 실내 온도 슬라이드 섹션을 전송으로 조직-테크 화합물 (O.C.T) (2.1 단계)에 기본적으로 포함 된 신장/hemi-두뇌 블록을 잘라. 섹션은 일단 말리 면 (약 30 분), 전송 슬라이드-80 ° C 냉동 고 사용까지.
   2. 얼룩이 지기의 날, 10 분 동안 37 ° C에서 슬라이드를 해 동 하 고 PBS에서 빠른 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaladehyde (PFA)와 섹션을 수정.
   3. Permeabilization/차단 버퍼 1 %BSA 및 0.5% 트라이 톤 X-100 pH 7.5 실 온에서 1 h 포함 된 살 균 PBS의에서 섹션을 품 어.
   4. CD31 1 차 항 체로 상 온에서 1.5 h에 대 한 슬라이드를 품 어 (0.5 mg/ml, 멕 13.3 복제), 트라이 톤 X-100 (pH 7.2) PBS에 3 5 분 세척 뒤 살 균 PBS, 0.5% BSA 0.25%를 포함 하는 버퍼에 1: 100에 희석.
   5. 수행 이차 항 체 외피 종의 함께 실 온에서 1 h 대 위의 버퍼 붙일 항 체 희석된 1: 500 (2 mg/mL)를 표시 합니다. CD31에 대 한 염소 반대로 쥐 알 렉 사 568 또는 알 렉 사 488 1: 500의 희석에 사용할 수 있습니다. DAPI를 포함 (300 μ M) 이차 항 체는 핵에 대 한 얼룩 (1:1, 000 희석 주식에서) 혼합.
   6. 아쿠아 polymount와 스테인드 섹션을 탑재 하 고 어둠 속에서 실 온에서 중 합에 대 한 그것을 떠나 하룻밤.
   7. 스펙트럼 영상 confocal 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. NIS 요소 소프트웨어 (버전 4.3)에 의해 이미지를 분석 합니다. 몽타주 그림의 생성을 위해 포토샵과 같은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.

결과

우리는 최근에 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) 마우스 건강 조건¹⁰제어 마우스 보다 더 높은 두뇌 혈관 침투성을가지고 나타났습니다. 뇌졸중 유발 쥐에서 그것은 또한 쇼 프 쥐 했다 더 큰 경색 크기와 제어 littermates 보다 큰 침투성. 이러한 결과 BBB에 침투성에 중앙 2의 중요 한 역할을 보여 줍니다. 따라서 프로토콜 GOF 마우스를 활용 하 고 비보에

토론

혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지¹⁷

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R