جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية

Summary

توفر هذه المقالة بروتوكول مفصلة لإعداد وتقييم للأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية لاستخدامها في مختلف تحديدكم. ويشمل هذا الإجراء التحصين، خلية الانصهار، أليسا المنافسة غير المباشرة لاستنساخ إيجابية الفحص، وإعداد هيبريدوما [مونوكلونل]. كما يتم توفير مواصفات جسم توصيف استخدام استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد وتحليل إليزا.

Abstract

تحليل المكونات النشطة بيولوجيا في الأطعمة والمنتجات الطبيعية أصبحت منطقة شعبية للدراسة في العديد من المجالات، بما في ذلك التقليدية الصينية الدواء والغذاء السلامة/علم السموم. تتطلب العديد من تقنيات التحليل الكلاسيكي معدات غالية الثمن و/أو الخبرة. جدير بالذكر أن فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط (الساس) أصبحت أسلوب ناشئة لتحليل الأطعمة والمنتجات الطبيعية. يستند هذا الأسلوب إلى الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة من مكونات الهدف. ومع ذلك، كالعديد من المكونات النشطة بيولوجيا في المنتجات الطبيعية هي صغيرة (< دا 1,000) والحث على عدم استجابة مناعية، وغالباً ما يصعب إيجاد الأجسام المضادة (مابس) ضدهم. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم شرحاً مفصلاً للخطوات المطلوبة لإنشاء مابس ضد الجزيئات المستهدفة، فضلا عن تلك المطلوبة لإنشاء المرتبطة بها غير المباشرة التنافسية (ic) أليسا للتحليل السريع للمجمع في عينات متعددة. يصف الإجراء توليف مستضد اصطناعية (أي، المتقارن هابتين الناقل)، التحصين، خلية الانصهار، إعداد هيبريدوما [مونوكلونل]، وصف الإنسان والمحيط الحيوي، وتطبيق المستندة إلى أليسا الإنسان والمحيط الحيوي. المتقارن هابتين الناقل تم تصنيعه بالصوديوم فوق يودات الأسلوب وتقييمه بواسطة استخدام TOF-مللي ثانية. بعد التحصين، بمعزل عن الماوس المحصنين مع عيار الأجسام المضادة أعلى سبلينوسيتيس وتنصهر مع Ag14 (القبعة)--ماوس حساسة الورم النخاعي الخلية خط Sp2/0-هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-التريتيوم استخدام البولي إيثيلين غليكول (شماعة)-على أساس الأسلوب. تم فحص هيبريدوماس إفراز مابس رد الفعل على مستضد الهدف من إيسيليسا لخصوصية وه. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق الأسلوب إضعاف الحد لإعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]. كذلك اتسمت إيسيليسا مابس النهائي وثم استخدامها في أحد تطبيقات المستندة إلى إليزا للكشف السريع ومريحة هابتين مثال (نارينجين (NAR)) في المنتجات الطبيعية.

Introduction

مونوكلونل (مابس)، يعرف أيضا باسم الأجسام المضادة أحادية محددة، يتم إنتاجها من استنساخ بليمفوسيتي واحدة وتتألف من الأجسام المضادة الفموي الأحادي التكافؤ أن كل ربط حانمه نفس¹. في السنوات الأخيرة، استخدمت العديد من المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات الطبية في علاج الأمراض المختلفة². وفي الواقع، تطبق الآن العديد من المركبات الجزيئية الصغيرة مستمد أصلاً من المنتجات الطبيعية كأدوية الخط الأول، مثل مادة الأرتيميسينين لعلاج الملاريا وباسيلتاكسيل (تاكسول) للسرطان^2،3. دراسة المنتجات الطبيعية حققت تقدما سريعاً، إلى حد كبير بسبب تنمية هائلة والاستغلال الأمثل لتقنيات التحليل التقليدي، بما في ذلك كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) والطيف الكتلي (مللي ثانية). ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود المرتبطة بهذه الأساليب، مثل بروتوكولات المعالجة المعقدة والتكاليف المرتبطة بها فيما يتعلق بالوقت والعمل/الخبرة والأدوات المطلوبة⁴.

في الآونة الأخيرة، طبقت الاختبارات المستندة إلى ماب الممتز المرتبط بالانزيم (الساس) على كمياً ونوعيا في تحليل المواد الغذائية والمنتجات الطبيعية. في الواقع، هذا الأسلوب قد طبقت لتحليل العينات البيولوجية والتجارب السريرية وقد تبين أن تكون دقيقة وحساسة وذات كفاءة عالية في حين أيضا تجنب الخطوات مملة المعالجة المسبقة المرتبطة ب التحاليل الأخرى^{5، 6}.

عند استخدام الساس ماب المستندة إلى دراسة المنتجات الطبيعية المعقدة، إعداد الأجسام المضادة واحدة من الخطوات الأساسية. ولسوء الحظ، مابس الخاصة بالمكونات النشطة بيولوجيا الصغيرة الموجودة في هذه الأنواع من المواد^6،،من^78،،من^{910،11،12 13، ،،}من¹⁴¹⁵ غالباً ما تكون محدودة مقارنة بمولدات المضادات البروتين. للالتفاف حول هذه المسألة، وقد وضعنا بروتوكولا لإنشاء مابس ضد المركبات الصغيرة على وجه التحديد. يشمل البروتوكول المعروضة هنا التوليف مستضد اصطناعية الماوس، خلية الانصهار، ELISA التنافسية غير المباشرة والتحصين والإعداد هيبريدوما [مونوكلونل].

جدير بالذكر أن دراسة تشكيل مابس ضد المركبات النشطة بيولوجيا الصغيرة من الأدوية الصينية التقليدية لدينا مجموعة بحوث وتطوير التطبيقات الخاصة بهم لسنوات. وقد وضعنا في دراساتنا الجارية، مابس ضد بايكالين¹⁶، بويرارين¹⁷، وحامض glycyrrhizic¹⁸، بايونيفلورين¹⁹، جنسنوسد Re²⁰، جنسنوسد Rh1²¹والعديد من الجزيئات الصغيرة الأخرى. لدينا بروتوكولات أليسا استناداً إلى هذه مابس قد استخدمت في عدد من الدراسات لتقييم الدوائية هذه الجزيئات الصغيرة، فضلا عن تفاعلها مع غيرها من المركبات النشطة بيولوجيا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذه مابس، قد وضعنا أيضا أساليب اللوني إيمونوافينيتي لفصل نظائر الهيكلية، بما في ذلك ابيميرس. في الآونة الأخيرة، أعددنا المناعة تدفق أفقي استخدام لدينا ماب بويرارين المضادة التي استخدمت فيما بعد للكشف السريع، في الموقع لهذا المركب. نتائجنا تشير إلى أن لدينا فحوصات المستندة إلى ماب أدوات لا غنى عنها ومريحة لدراسة علم الأحياء ونوعية المركبات المشتقة من المنتجات الطبيعية، وخاصة تلك المستخدمة في الأدوية الصينية التقليدية.

Protocol

كافة الإجراءات الحيوان القيام في هذه الدراسة بموافقة "لجنة استعراض الأخلاقية" بجامعة بكين "الطب الصيني" (الموافقة على رقم 2016BZYYL00109).

ملاحظة: تم تحصين الفئران الإناث بالب/c (8 أسابيع) مع يصرف البروتين الناقل هابتين. عندما تستخدم وحدها، جزيء صغير (< دا 1,000) لا يمكن الحصول على استجابة مناعية. ومع ذلك، التصريف صغيرة جزيء إلى جزيء ضخم ينتج مستضد توليف الناقل. وفي هذا السياق، يسمى جزيء صغير من هابتين. تصريف هابتين استراتيجية ضرورية وفعالة لإنتاج الإنسان والمحيط الحيوي. لتجنب عبر مفاعليه، حاملتي البروتين المختلفة، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) وأوفالبومين (OVA) أو ثقب المفتاح مفج هيموسيانين (كله) وجيش صرب البوسنة، ينبغي أن تستخدم إيمونوجينس (للتحصين الحيواني) وطلاء المستضدات (للوحة لمعطف اكتشاف المصل المضاد). جيش صرب البوسنة والبويضات تستخدم كمثال في هذا البروتوكول.

1. إعداد إيمونوجين وطلاء مستضد

ملاحظة: لتوليف مستضد مصطنعة، استخدم مجموعة وظيفية مناسبة (مثلاً، الهيدروكسيل، سلفهيدريل الكربوكسيل الحمضية، أو الأمينية) كذراع الجانب للربط التساهمي مع البروتين الناقل. تتضمن أساليب التصريف فوق يودات الأكسدة والأسلوب كاربودييميدي ورد فعل مختلطة أو أملاحه، رد فعل glutaraldehyde والأسلوب سوكسيناتي. هذا البروتوكول يستخدم نارينجين (نار)، غليكوزيد فلافانوني معروفة، كمجمع لمثال. نار مركب صغير (دا 581) موجودة في الحمضيات، فضلا عن مختلف الأدوية الصينية التقليدية.

1. استخدام إجراء أكسدة بيريوداتي لتوليف يصرف نار-جيش صرب البوسنة، ونار-البويضات.
   1. حل 50 مغ نار في الماء بتركيز 1 ملغ/مل²²نهائي.
   2. إضافة 100 ميليلتر من الصوديوم المحضرة فوق يودات الحل (0.1 M) إلى 5 مل الحل نار. يقلب الخليط في درجة حرارة الغرفة ح 1.
2. حل 4 ملغ من جيش صرب البوسنة والبويضات في مل 2.0 من المخزن المؤقت لكربونات 50 مم (pH 9.6). إضافة البروتين هذا الحل على النار/الصوديوم فوق يودات خليط رد فعل.
3. ضبط المخلوط للأس الهيدروجيني 9 مع 1 م Na₂CO₃ الحل وآثاره في درجة حرارة الغرفة ح 6-8.
4. دياليزي الخليط رد فعل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) باستخدام غشاء الديال (كاتشين موكو 10) لمدة 3 أيام لتبادل شبكة سي بي إس.
5. تحليل المتقارن هابتين الناقل باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF)-مرض التصلب العصبي المتعدد.
   1. مزيج بمول 1-10 من المرافق مع 10³-أمثال المولى الزائدة من حمض سينابينيك محلول مائي يحتوي على حامض trifluoroacetic 0.15% (تفا). الجاف الخليط في صفيحة عينة في الهواء.
   2. القيام التحليل باستخدام استخدام-TOF مطياف أسلحة مزودة بليزر نيتروجين نابض يعمل في 337 شمال البحر الأبيض المتوسط. اكتساب أيون إيجابية استخدام الأطياف الشامل في الوضع الخطي ضمن النطاق الشامل (m/z) كما سبق وصف 15,000 100,000²².

2-التحصين

ملاحظة: استخدمت ما مجموعة 5 بالب/ج الفئران الإناث (8 أسابيع): 4 لنار متزاوجة التحصين و 1 للتحصين التحكم (PBS).

1. للتطعيم الأولى، مزيج 50 ميكروغرام من المتقارن (مخففة في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني) مع زيادة في حجم إكمال adjuvant فروند (CFA) المساواة واستحلاب تماما. إدارة 100 ميليلتر من هذا الخليط كل الماوس عبر الظهرية تحت الجلد حقن.
2. تسليم بعد أسبوعين، الداعم (100 ميليلتر) التحصين عن طريق الحقن تحت الجلد بنفس المقدار من المتقارن مختلطة مع adjuvant غير مكتملة (إيفا).
3. استخراج 200 ميليلتر من الدم من الوريد ذيل الماوس كل 7 أيام في وقت لاحق للحصول على المصل.
   1. نقل الدم في 3,000 س ز من أجهزة الطرد المركزي للحد الأدنى 10 المصل طافية إلى أنبوب جديد.
   2. تحليل مصل الدم باستخدام أليسا كما هو موضح سابقا²¹. اختر الماوس مع عيار المصل أعلى لاستخدام لخلية الانصهار.
4. في التحضير لخلية الانصهار، إدارة تحصين نابض بالماوس المختار 50 ميكروغرام عن طريق الحقن داخل المتقارن في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني دون adjuvant 3 أيام قبل الانصهار.
   ملاحظة: يمكن حذف هذه الخطوة إذا كانت عيار مرتفع بما يكفي.

3-التحضير لخلية الانصهار

1. خلية الانصهار إعداد متوسطة
   1. للمتوسط انتقائية هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-thymidine (قبعة): حل 50 x هات الملحق وسائل الإعلام في 10 مل من RPMI 1640 وأضف هذا الخليط إلى 500 مل RPMI 1640 الذي يحتوي على 20% FBS.
      ملاحظة: عندما يتم المخفف 10 مل الركاز 50 x في 500 مل من الثقافة المتوسطة، تركيزات النهائي هيبوكسانثيني وأمينوبتيرين و thymidine هي 100 ميكرومتر و 0.4 ميكرون و 16 ميكرومتر، على التوالي.
   2. لوسائل الإعلام هيبوكسانثيني-thymidine (HT): حل 50 × الملحق الإعلامي HT في 10 مل من RPMI 1640 وأضف هذا الخليط إلى 500 مل RPMI 1640 الذي يحتوي على 20% FBS. تركيزات النهائي هيبوكسانثيني و thymidine هي 100 ميكرومتر و 16 ميكرومتر، على التوالي.
2. ثقافة الخلايا Sp2/0-Ag14.
   1. سرعة ذوبان 7 أيام على الأقل قبل الانصهار، قنينة من سائل النيتروجين المجمدة SP2/0-Ag14 الورم النخاعي الخلايا في المياه الدافئة.
   2. نقل الحل خلية إلى 5 مل من جديد الثقافة المتوسطة (ربمي-1640) وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1000 x ز.
   3. بعد الطرد المركزي، إزالة المتوسطة الثقافة وريسوسبيند خلايا جديدة ربمي-1640 تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
   4. نقل الخلايا والمتوسطة في قارورة² 25 سم واحتضان في 37 درجة مئوية في جو من أول أكسيد الكربون 5%₂.
   5. توسيع نطاق الخلايا إلى 3 أو 4 75 سم² قوارير قبل الانصهار.
3. إعداد تغذية البطن طبقة الخلايا
   1. التضحية ماوس الممثل المدني الدولي ألبينو عمرها 12 أسبوع بخلع عنق الرحم قبل الانصهار خلية يوم 1 وتغرق في الإيثانول 75%.
   2. وبعد إزالة الفراء من البطن مع ملقط مرقئ، تطهير المنطقة مع الإيثانول 75%. قطع الجلد الخارجي لفضح تجويف البطن. حقن 3 مل متوسط RPMI 1640 العقيمة في البطن وتدليك البطن لفصل خلايا إضافية إلى الحل. نضح تغذية تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 15 مل.
   3. بعد سينتريفوجينج بتعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ز، تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا المغذية في 20 مل من قبعة المتوسطة انتقائية.
   4. نقل الخلايا في خلية 96-جيدا ثقافة لوحات (100 ميليلتر في البئر). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂.

4-خلية الانصهار

1. بعد تحصين المختار الفأر قد أعد لخلية الانصهار (راجع الخطوة 2، 4)، إدارة حقن داخل 10% كلورال هيدرات (مخدر) والتضحية بالماوس المحصنين التفكك عن طريق عنق الرحم.
2. جمع الدم إضافية من القلب (1 مل)، وإعداد مصل كما هو موضح في الخطوة 2.3.1 لاستخدامه كعنصر إيجابي أثناء اختيار هيبريدوما.
3. إزالة أنسجة العضلات والجلد باستخدام مقص لفضح الطحال.
4. عزل الطحال مع ملاقط بعناية، وغسل الطحال مع ربمي-1640. قطع الطحال إلى قطع والجنيه الطحال تريتوراتي ببطء. إعداد تعليق خلية طحال بضغط أنسجة الطحال من خلال مصفاة مش 800 خلية في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي.
5. أغسل تعليق خلية الطحال مع المتوسط RPMI 1640. حصاد الخلايا الطحال بالطرد المركزي (1000 x ز، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية)، ومن ثم تجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة الغسيل ثلاث مرات.
6. إزالة الخلايا المزروعة وتضخيم الورم النخاعي من الحاضنة ولطف الصنبور/هزة قوارير للحصول على تعليق خلية. أغسل هذا التعليق مع المتوسط RPMI 1640 مرتين لإزالة FBS.
   ملاحظة: هذا خطوة أساسية كما قد تؤثر FBS خلية الانصهار.
7. عد الخلايا وضبط التركيز قبل الاختلاط مع خلايا الطحال. ينبغي أن تكون نسبة خلايا الطحال لخلايا الورم النخاعي النهائي بين 1:5 و 01:10.
8. مزيج الخلية الطحال الخلايا تعليق والورم النخاعي. الطرد المركزي الخليط خلية (1000 x ز، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية)، وإزالة المادة طافية.
9. أضف 1 مل من محلول 50% البولي إثيلين غليكول (شماعة) إلى الخلايا ويقلب بلطف في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. اسمحوا الوقوف لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: الحل شماعة المستخدمة في هذه الخطوة ينبغي أن تحتوي على 50% (w/v) البولي إيثيلين غليكول 1500 و 10% (v/v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم (Ca^{2 +}).
10. إضافة 2 مل متوسط RPMI 1640 لمدة 2 دقيقة إنهاء رد فعل. إضافة 2 مل إضافية في المتوسط RPMI 1640 لآخر 1 دقيقة، ثم قم بإضافة 10 مل إضافية في المتوسط RPMI 1640.
11. الطرد المركزي الخلايا في 800 x ز لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة طافية، إضافة هات الحل والاستمرار في زراعة الخلايا. ثم إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية لكل بئر من ألواح الطبقة المغذية واحتضان اللوحات لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂.
    ملاحظة: في ظل هذه الظروف، ستموت خلايا المايلوما أونفوسيد بينما خلايا هيبريدوما سوف يستمر في النمو على المديين المتوسط وقبعة. بعد 7 أيام، ستشكل هيبريدوما [مونوكلونل] ككتلة واحدة من الخلايا بشكل جيد، بينما سيكون الآبار التي تحتوي على هيبريدوما [بولكلونل] لمجموعات متعددة من الخلايا.
12. نضح المادة طافية للتحليل واستبدالها المتوسطة المتوسطة HT.
    ملاحظة: تأكد من استبدال المتوسطة قبعة مع تقنية HT الأولى المتوسطة كالتبديل مباشرة إلى متوسط أونسوبليمينتيد يلحق الضرر هيبريدوما.

5-غير مباشر أليسا التنافسية (إيسيليسا)

1. معطف صفيحة 96-جيدا مع البويضات نار (1 ميكروغرام/مل، 100 ميليلتر/حسنا) واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. كتلة اللوحة مع 300 ميليلتر من جببس (برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% m/v الجيلاتين) ح 1 في 37 درجة مئوية لمنع الامتزاز غير محددة.
3. أغسل لوحة ثلاث مرات مع TPBS (برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% v/v توين-20).
4. تمييع نار أونكونجوجاتيد إلى سلسلة من تركيزات مع 10 ٪ الميثانول. إضافة 50 ميليلتر لتخفيف هذه لفصل الآبار. في آبار أخرى، إضافة 50 ميليلتر من المصل المضاد أو هيبريدوما طافية (التي تحتوي على مابس). احتضان لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية.
5. إضافة 100 ميكروليتر من المسمى البيروكسيديز المضادة الماوس مفتش في كل بئر واحتضانها ح 1 إضافية.
6. بعد الغسيل لوحة ثلاث مرات مع TPBS، إضافة 100 ميليلتر من الركازة الحل (0.1 M سترات المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 4) تحتوي على 0.015% v/v ح₂س₂ و 2 ملغ/مل من 3, 3 ', 5, 5'-ميثيل بنزيدين (TMB)) إلى كل خير واحتضان لمدة 15 دقيقة.
7. وقف رد الفعل بإضافة 50 ميليلتر من م 1 ح₂حتى₄ لكل بئر.
8. قياس امتصاص استخدام قارئ ميكروسكوبية في 450 نانومتر. اختر هيبريدوماس التي تفرز تركيزات أعلى من الأجسام المضادة نار في تلك المادة طافية لزيادة إعداد.

6-إعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]

1. استخدام أسلوب تمييع الحد لإعداد هيبريدوماس [مونوكلونل].
   1. بعد إزالة المتوسطة HT من هيبريدوماس المحددة (أي، تلك الإيجابية لإفراز جسم نار)، ريسوسبيند الخلايا في RPMI 1640 والاعتماد عليها.
   2. تمييع الخلايا بتركيز 1 الخلايا والخلايا 2 4 خلايا كل بئر في 100 ميليلتر من 1640 ربمي في صفيحة 96-جيدا. احتضان اللوحة على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂.
   3. بعد 7-10 أيام، كشف الأجسام المضادة نار في ثقافة طافية باستخدام بروتوكول إيسيليسا (الخطوة 5). نقل الخلايا من هيبريدوماس التي إيجابية للأجسام المضادة نار إلى لوحات 24-جيدا و 25 سم² قوارير قوارير² 75 سم لزراعة.
2. كريوبريسيرفي هيبريدوماس [مونوكلونل].
   1. حصاد الخلايا ونقلها للطرد المركزي أنابيب.
   2. وبعد سينتريفوجينج الخلايا (800 x ز، 10 دقيقة)، إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في تجميد المتوسطة (ربمي-1640 ومصل العجل الجنين 20% (FCS) و [دمس] 10%). نقل تعليق الخلية إلى كريوتوبيس.
   3. تخزين في كريوتوبيس في مربع تبريد تدرج في-80 درجة مئوية ح 24. ثم نقل كريوتوبيس للنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

النتائج

جيل هيبريدوماس [مونوكلونل]

وأكد الوزن الجزيئي المتقارن الناقل هابتين تحليل استخدام TOF-مللي ثانية. كما هي معروفة الوزن الجزيئي لجيش صرب البوسنة والنار، يمكن حساب عدد الجزيئات الصغيرة مترافق مع جيش صرب البوسنة. ويبين

Discussion

نقدم هنا، بروتوكولا للنجاح في إنتاج مابس ضد الجزيئات الصغيرة الطبيعية المستمدة من المنتج. وقد أوجزت الخطوات الأساسية في الإجراء، وإننا قد أثبتت فائدة هذا البروتوكول استخدام نار كجزيء صغير مثال. المثال الأطياف وتحليلات مفاعليه، ونتائج إيسيليسا جميع إظهار الممثل التجريبية وبيانات التحكم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter	FALCON	352340
24 well culture plate	NUNC	119567
25 cm2 Flask	Labserv	310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)	Sigma Aldrich	860336 1G
75 cm2 Flask	Corning	430720
96 well culture plate	NUNC	117246
bovine serum albumin	AMRESCO	332
cell strainer	FALCON	352340
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
cultivator	DRP-9082	Samsung
dialysis membrane (10kDa)	Heng Hui	45-10000D
dimethylsulfoxide	Sinopharm Chemical	DH105-10
electronic balance	BS124-S	Sartorius
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
ethanol, 96%	Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete	Sigma Aldrich	SLBL0210V
Gelatin	AMRESCO	9764-500g
Gradient cooler container	Nalgene	5100-0001
HAT media supplement	Sigma Aldrich	H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
HT media supplement	Sigma Aldrich	H0137-10VL
Inverted Microscope	IX73	Olympus
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
MALDI-TOF-MS	Axima-CFR  plus	Axima
Microplate Reader	BioTex	ELX-800
mouse	Vital River	BALB/c
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG	Sigma Aldrich	RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution	Hyclone	SV30010
Pipette 10 mL	COSTAR	4488
Pipette 25 mL	FALCON	357525
RPMI 1640	Corning	10-040-CVR
skim milk	applygen	P1622
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021