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  • Resultados
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  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Resumen

El análisis de los componentes bioactivos presentes en los alimentos y productos naturales se ha convertido en una popular zona de estudio en muchos campos, incluyendo tradicional China medicina y alimentos seguridad/Toxicología. Muchas de las técnicas de análisis clásicas requieren equipo costoso o conocimientos. En particular, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se han convertido en un método emergente para el análisis de alimentos y productos naturales. Este método se basa en la detección de anticuerpo-mediada de los componentes de destino. Sin embargo, como muchos de los componentes bioactivos en productos naturales son pequeños (< 1.000 Da) y no se debe inducir una respuesta inmune, creación de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra ellos es a menudo difícil. En este protocolo, brindamos una explicación detallada de los pasos necesarios para generar mAbs contra moléculas Diana así como los necesarios para crear los asociados indirectos competitiva (ic) ELISA para el análisis rápido del compuesto en muestras múltiples. El procedimiento describe la síntesis del antígeno artificial (es decir, el conjugado hapteno-carrier), inmunización, fusión celular, preparación de hibridomas monoclonal, caracterización de la mAb y la aplicación basada en ELISA del mAb. El conjugado hapteno-carrier fue sintetizado por el sodio periodato método y evaluado por MALDI-TOF-MS. Después de la inmunización, esplenocitos fueron aislados de ratón inmunizado con el más alto título del anticuerpo y se fundió con la hipoxantina-aminopterina-timidina (sombrero) - línea de celular de mieloma de ratón sensible Sp2/0 - Ag14 con un polietilenglicol (PEG)-método basado en. Los hibridomas secretoras de mAbs reactivo para el antígeno de la blanco fueron defendidos por icELISA de especificidad y reactividad cruzada. Además, se aplicó el método de dilución limitante para preparar monoclonales hibridomas. Los mAbs finales se caracteriza por icELISA y entonces utilizados en una aplicación de ELISA para la detección rápida y conveniente de hapteno ejemplo (naringina (NAR)) en productos naturales.

Introducción

Anticuerpos monoclonales (mAbs), también conocido como mono específicos anticuerpos, producidos a partir de un solo clon de linfocitos b y se componen de anticuerpos monovalentes que se unen al mismo epitopo1. En los últimos años, muchos productos naturales derivados de plantas medicinales se han utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades2. De hecho, muchos compuestos moleculares pequeños originalmente derivados de productos naturales se aplican ahora como medicamentos de primera línea, como la artemisinina contra la malaria y paciltaxel (taxol) para cáncer2,3. El estudio de productos naturales ha hecho progreso rápido, en gran parte debido al enorme desarrollo y optimización de técnicas convencionales de análisis, como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas (MS). Sin embargo, todavía existen algunas limitaciones asociadas con estos métodos, como sus protocolos de tratamiento complejos y costes asociados en tiempo, mano de obra/experiencia y requiere instrumentos4.

Recientemente, se han aplicado análisis de mAb-basado enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) cualitativa y cuantitativamente analizar alimentos y productos naturales. De hecho, este método se ha aplicado para el análisis de muestras biológicas y pruebas clínicas y se ha demostrado para ser precisos, sensibles y altamente eficiente, también evitando los tediosos pasos pretratamiento asociados con otros análisis5, 6.

Cuando se utiliza a Elisa mAb-basado para el estudio de productos naturales complejos, preparación de los anticuerpos monoclonales es uno de los pasos fundamentales. Por desgracia, los mAbs específicos de los pequeños componentes bioactivos presentes en estos tipos de sustancias6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 a menudo son limitados en comparación con los antígenos de la proteína. Para evitar este problema, hemos desarrollado un protocolo para generar específicamente mAbs contra pequeños compuestos. El protocolo que presentamos incluye síntesis antígeno artificial, inmunización del ratón, fusión celular, ELISA competitiva indirecto y preparación de hibridomas monoclonal.

En particular, nuestro grupo de investigación ha sido estudiar la formación de mAbs contra pequeños compuestos bioactivos de la medicina tradicional China y sus aplicaciones durante años. En nuestros estudios en curso, hemos desarrollado mAbs contra Baicalina16, puerarin17, ácido glicirrícico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121y muchas otras moléculas pequeñas. Nuestros protocolos de ELISA basadas en estos mAbs se han utilizado en varios estudios para evaluar la farmacocinética de estas pequeñas moléculas, así como sus interacciones con otros compuestos bioactivos. Por otra parte, utilizando estos mAbs, también hemos desarrollado métodos de cromatografía de inmunoafinidad para la separación de análogos estructurales, incluidos los epímeros. Recientemente, hemos preparado un inmunoensayo de flujo lateral utilizando nuestro mAb anti-puerarin que posteriormente fue utilizado para la detección rápida, en el sitio de este compuesto. Nuestros resultados indican que nuestros ensayos de mAb son herramientas indispensables y convenientes para el estudio de la biología y la calidad de los compuestos derivados de productos naturales, particularmente los utilizados en la medicina tradicional China.

Protocolo

Todos los procedimientos animales realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité de revisión ética de la Universidad de Beijing de Medicina China (2016BZYYL00109 número de aprobación).

Nota: Ratones hembra BALB/c (8 semanas) fueron inmunizados con hapteno-portador proteína conjugados. Cuando se utiliza solo, una pequeña molécula (< 1.000 Da) puede provocar una respuesta inmune. Sin embargo, conjugando la molécula pequeña a un portador de la macromolécula los resultados en síntesis del antígeno. En este contexto, la molécula pequeña es etiquetado como un hapteno. Conjugación hapteno es una estrategia necesaria y eficaz para la producción del mAb. Para evitar la reactividad cruzada, dos portadores de diferentes proteínas, como albúmina sérica bovina (BSA) y ovoalbúmina (OVA) o hemocianina de Lapa ojo de la cerradura (KLH) y BSA, debe utilizarse como inmunógenos (para la inmunización animal) y antígenos de capa (para cubrir la placa de detección de suero). BSA y OVA se utiliza como ejemplo en este protocolo.

1. preparación del inmunógeno y antígeno de capa

Nota: Para la síntesis del antígeno artificial, utilice el grupo funcional apropiado (e.g., hidroxilo, carboxilo sulfhidrilo ácido y amino) como el brazo lateral de unión covalente con la proteína transportadora. La conjugación de los métodos incluyen periodato de oxidación, el método de carbodiimida, una reacción de anhídridos mixtos, una reacción del glutaraldehido y el método de succinato. Este protocolo utiliza la naringina (NAR), un glucósido flavanona bien conocido, como un ejemplo de compuesto. NAR es un compuesto pequeño (581 Da) presente en frutas cítricas, así como diversas medicinas tradicionales chinas.

  1. Utilice un procedimiento de oxidación periodate sintetizar conjugados NAR-BSA y OVA de NAR.
    1. Disolver 50 mg de NAR en agua a una concentración final de 1 mg/mL22.
    2. Añadir 100 μl de sodio recién preparada periodato de solución (0.1 M) a 5 mL de la solución NAR. Revolver la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Disolver 4 mg de BSA y OVA en 2,0 mL de tampón de carbonato 50 mM (pH 9.6). Añadir esta proteína solución al NAR/sodio periodato de mezcla de reacción.
  3. Ajuste la mezcla a pH 9 con solución de 1 M Na2CO3 y agitar a temperatura ambiente durante 6-8 h.
  4. Dializan la mezcla de reacción en tampón fosfato salino (PBS) con una membrana de diálisis (MWCO 10 kDa) durante 3 días para el intercambio de la CBS.
  5. Analizar el conjugado hapteno-portador utilizando láser de matriz asistida desorción/ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF)-MS.
    1. 1 10 pmol del conjugado con un 10 la mezcla3-doblar el exceso molar de ácido sinapinic en una solución acuosa que contiene 0,15% de ácido trifluoroacético (TFA). Seque la mezcla sobre una placa de la muestra en aire.
    2. Realizar el análisis usando un MALDI-TOF espectrómetro total equipada con un láser de nitrógeno pulsado operado a 337 nm. Adquisición de espectros de masas de MALDI iones positivos en el modo lineal dentro del rango total (m/z) de 15.000-100.000 como se ha descrito22.

2. inmunización

Nota: Se utilizaron un total de 5 ratones hembra BALB/c (8 semanas): 4 para NAR conjugado inmunización y 1 para la inmunización de control (PBS).

  1. Para la primera vacunación, mezcle 50 μg de conjugado (diluido en 100 μl de PBS) con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA) y emulsione totalmente. Administrar 100 μl de esta mezcla a cada ratón vía dorsal subcutáneo inyección.
  2. Dos semanas más tarde, ofrecen a un refuerzo de vacunación (100 μL) vía inyección subcutánea con la misma cantidad de conjugado mezclado con adyuvante incompleto (IFA).
  3. Extracto de 200 μL de la sangre de la vena de la cola de cada ratón 7 días más tarde para obtener suero.
    1. Centrifugar la sangre a 3.000 x g durante 10 minutos transferir el suero sobrenadante a un tubo nuevo.
    2. Analizar el suero utilizando un ELISA como se describió anteriormente21. Elija el ratón con el más alto título del suero para la fusión de la célula.
  4. En preparación para la fusión de la célula, administrar una inmunización pulsada para el ratón solicitadas mediante inyección intraperitoneal de 50 μg del conjugado en 300 μL de PBS sin adyuvante 3 días antes de la fusión.
    Nota: Este paso puede omitirse si el título es lo suficientemente alto.

3. preparación para la fusión de la célula

  1. Preparación medio de fusión celular
    1. Para el medio selectivo hipoxantina-aminopterina-timidina (sombrero): disolver 50 x suplemento de medios de comunicación de sombrero en 10 mL de RPMI-1640 y añadir esta mezcla a 500 mL de RPMI-1640 que contiene 20% FBS.
      Nota: Cuando se diluyen 10 mL de concentrado 50 x en 500 mL de medio de cultivo, las concentraciones finales de hipoxantina, aminopterina y timidina son 0,4 μm y 100 μm y 16 μm, respectivamente.
    2. Para los medios de comunicación de hipoxantina-timidina (HT): disolver 50 x suplemento de medios de comunicación de HT en 10 mL de RPMI-1640 y añadir esta mezcla a 500 mL de RPMI-1640 que contiene 20% FBS. Las concentraciones finales de hipoxantina y timidina son 100 μm y 16, respectivamente.
  2. Las células Sp2/0-Ag14 de la cultura.
    1. Al menos 7 días antes de la fusión, descongelar rápidamente un frasco de líquido congelado en nitrógeno SP2/0-Ag14 células del mieloma en agua tibia.
    2. Transferir la solución de células en 5 mL de medio de cultivo fresco (RPMI-1640) y centrifugar durante 10 min a 1000 x g.
    3. Después de la centrifugación, eliminar el medio de cultivo y resuspender las células en fresco RPMI-1640 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS).
    4. Transferencia de las células y el medio en un matraz de 25 cm2 e incubar a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2.
    5. Ampliar las celdas 3 o matraces de2 4 75 cm antes de la fusión.
  3. Preparación de células de la capa de alimentador abdominal
    1. Sacrificar un ratón ICR de 12 semanas de edad albino por dislocación cervical 1 día antes de la fusión celular y sumérjalo en el etanol del 75%.
    2. Después de quitar la piel del abdomen con pinzas hemostáticas, desinfectar la zona con etanol al 75%. Cortar la piel exterior para exponer la cavidad abdominal. Inyectar 3 mL de Medio RPMI-1640 estéril en el abdomen y masajear el abdomen para separar células adicionales en la solución. Aspirar la suspensión de células de alimentador en un tubo de centrífuga de 15 mL.
    3. Después de centrifugar la suspensión celular por 10 min a 1000 x g, deseche el sobrenadante y resuspender las células de alimentador en 20 mL de medio selectivo de sombrero.
    4. Transferencia de las células en placas de cultivo celular de 96 pozos (100 μL/pocillo). Incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO2.

4. fusión de la célula

  1. Después de que el elegido inmunizados ratón ha preparado para la fusión de la célula (véase paso 2.4), administrar una inyección intraperitoneal de hidrato de cloral 10% (anestésico) y sacrificar el ratón inmunizado mediante dislocación cervical.
  2. Recoger la sangre adicional desde el corazón (1 mL) y preparar suero como se describe en el paso 2.3.1 para usar como un control positivo durante la selección de hibridomas.
  3. Eliminar el tejido de la piel y el músculo con unas tijeras para exponer el bazo.
  4. Aislar el bazo con las pinzas cuidadosamente y lavar el bazo con RPMI-1640. Trocear el bazo y libra lentamente el bazo a triturate. Preparar una suspensión de células de bazo presionando el tejido del bazo a través de un colador 800 de células en un tubo de centrífuga de 50 mL.
  5. Lavar la suspensión de células de bazo con Medio RPMI-1640. Cosechar las células de bazo por centrifugación (1000 x g y 10 min 4 ° C) y luego descartar el sobrenadante. Repetir este lavado tres veces.
  6. Eliminar las células de mieloma cultivado y amplificada de la incubadora y suavemente tap/agitar los matraces para obtener una suspensión. Lavar esta suspensión con Medio RPMI-1640 dos veces para quitar el FBS.
    Nota: Este es un paso esencial que FBS pueden influir en la fusión celular.
  7. Contar las células y ajustar la concentración antes de mezclar con las células del bazo. La relación final de las células del bazo para células del mieloma debe estar entre 1:5 y 1:10.
  8. Mezclar la célula de bazo células suspensión y mieloma. Centrifugar la mezcla de células (1000 x g y 10 min 4 ° C) y eliminar el sobrenadante.
  9. Añadir 1 mL de solución de 50% de polietilenglicol (PEG) a las células y revuelva suavemente a 37 ° C durante 1 minuto. Dejar reposar durante 30 s.
    Nota: La solución de PEG utilizada en esta etapa debe contener un 50% (p/v) de Polietilenglicol 1500 y 10% (v/v) dimetil sulfóxido (DMSO) en PBS sin calcio (Ca2 +).
  10. Añadir 2 mL de Medio RPMI-1640 por 2 min terminar la reacción. Añadir un adicional 2 mL de Medio RPMI-1640 para otro 1 minuto y luego añadir un adicional 10 mL de Medio RPMI-1640.
  11. Centrifugar las células a 800 x g por 10 min. Después de descartar el sobrenadante, Agregar solución de sombrero y seguir cultivando las células. Luego agregar 100 μl de la suspensión celular en cada pocillo de las placas de capa de alimentador e incubar las placas durante 7 días a 37 ° C, 5% CO2.
    Nota: En estas condiciones, las células sin fundir del myeloma morirán mientras que las células de hibridoma seguirá creciendo en el medio de sombrero. Después de 7 días, hibridoma monoclonal formará como un único grupo de células en el pozo, mientras que pozos que contienen hibridoma policlonal tendrán múltiples racimos de células.
  12. Aspirar el sobrenadante para el análisis y sustituir el medio por medio de HT.
    Nota: Asegúrese de sustituir el medio de sombrero con HT es perjudicial para el hibridoma medio primero como cambiar directamente a medio sin suplemento.

5. indirecta ELISA competitivo (icELISA)

  1. Cubrir una placa de 96 pocillos con NAR-OVA (1 μg/mL, 100 μL/pocillo) e incubar 1 h a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C.
  2. Bloquear la placa con 300 μL de GPBS (PBS con 1% de gelatina de m/v) por 1 h a 37 ° C para evitar la adsorción no específica.
  3. Lave la placa tres veces con TPBS (PBS que contenga 0.05% v/v Tween-20).
  4. Diluir NAR no conjugada en una serie de concentraciones con metanol al 10%. Añadir 50 μl de las diluciones para separar pozos. En los otros pocillos añadir 50 μl de suero o sobrenadante (que contiene mAbs) de hibridoma. Incubar la placa por 1 h a 37 ° C.
  5. Añada 100 μL de marcado con peroxidasa anti-ratón IgG en cada pocillo e incubar durante 1 h adicional.
  6. Después de lavar la placa tres veces con TPBS, añada 100 μl de solución sustrato (0,1 M citrato tampón (pH 4) que contiene 0,015% v/v H2O2 y 2 mg/mL de 3, 3', 5, 5'-tetrametil bencidina (TMB)) a cada uno bien e incubar durante 15 minutos.
  7. Detener la reacción agregando 50 μl de 1 M H2hasta4 en cada pocillo.
  8. Medir la absorbancia utilizando un lector de microplacas a 450 nm. Elegir los hibridomas que secretan las más altas concentraciones de anticuerpos NAR en su sobrenadante para más preparación.

6. preparación de hibridomas Monoclonal

  1. Utilizar el método de dilución limitante para preparar los hibridomas monoclonales.
    1. Después de quitar el medio HT de hibridomas seleccionados (es decir, los positivos para la secreción de anticuerpos NAR), suspender las células en RPMI-1640 y contarlos.
    2. Diluir las células a una concentración de 1 celda y 2 células 4 células por pocillo en 100 μl de RPMI-1640 en una placa de 96 pocillos. Incubar la placa a 37 ° C, 5% CO2.
    3. Después de 7-10 días, detectar los anticuerpos NAR en la cultura sobrenadante utilizando el protocolo de icELISA (paso 5). Transferencia de las células de las que son positivas para anticuerpos NAR para placas de 24 pocillos, 25 cm2 y 75 cm2 para el cultivo de hibridomas.
  2. Criopreservar los hibridomas monoclonales.
    1. Cosecha de las células y transferirlas a tubos de centrífuga.
    2. Después de centrifugar las células (800 x g, 10 minutos), retirar el sobrenadante y resuspender las células en medio (RPMI-1640, suero de ternera fetal 20% (FCS) y 10% DMSO) de congelación. Transferencia de las suspensiones celulares para criotubos.
    3. Almacenar los criotubos en una caja de refrigeración gradiente a-80 ° C durante 24 h. Luego se transfieren los criotubos en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.

Resultados

Generación de hibridomas monoclonales

El peso molecular de la conjugación hapteno-carrier fue confirmado por el análisis por MALDI-TOF-MS. Como se conoce el peso molecular de BSA y el NAR, podría calcularse el número de pequeñas moléculas conjugadas con BSA. La figura 1 muestra resultados representativos espectrales para NAR-BSA22, q...

Discusión

Aquí, presentamos un protocolo para la producción exitosa de mAbs contra moléculas pequeñas derivadas de productos naturales. Los pasos esenciales en el procedimiento han sido descritos, y hemos demostrado la utilidad de este protocolo utilizando NAR como una molécula pequeña de ejemplo. Los espectros de ejemplo, análisis de reactividad y icELISA resultados muestran representante experimental y datos de control que se obtuvieron mediante este protocolo. Imágenes de ejemplo de los hibridomas proporcionan una repre...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (números de concesión 81573573, 81473338 y 81503344) y la clásica receta básica equipo de investigación en la Universidad de Beijing de Medicina China.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
800 mesh (40 μm nylon) filter FALCON352340
24 well culture plateNUNC119567
25 cm2 FlaskLabserv310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)Sigma Aldrich860336 1G
75 cm2 FlaskCorning430720
96 well culture plateNUNC117246
bovine serum albuminAMRESCO332
cell strainerFALCON352340
centrifuge tube 15 mLCorning430645
centrifuge tube 50 mLCorning430828
cryotubes, 1 mL Sigma AldrichV7384-1CS
cultivatorDRP-9082 Samsung
dialysis membrane (10kDa)Heng Hui45-10000D
dimethylsulfoxideSinopharm ChemicalDH105-10
electronic balance BS124-S Sartorius
ELISA plates, 96 wellNUNC655101
ethanol, 96%Sinopharm Chemical
Fetal bovine serumGibco16000-044
fetal calf serumInvitrogen10270106
Freund´s adjuvant, completeSigma AldrichSLBM2183V
Freund´s adjuvant, incompleteSigma AldrichSLBL0210V
GelatinAMRESCO9764-500g
Gradient cooler containerNalgene5100-0001
HAT media supplementSigma AldrichH0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibodyapplygenC1308
HT media supplementSigma AldrichH0137-10VL
Inverted MicroscopeIX73Olympus 
keyhole limpet hemocyaninSigma AldrichH8283
MALDI-TOF-MS Axima-CFR  plus  Axima 
Microplate ReaderBioTexELX-800 
mouseVital River BALB/c
ovalbuminBeijing BIODEE5008-25g
PEGSigma AldrichRNBC6325
Penicillin&Streptomycin solutionHycloneSV30010
Pipette 10 mLCOSTAR4488
Pipette 25 mLFALCON357525
RPMI 1640Corning10-040-CVR
skim milkapplygenP1622
sodium periodateSinopharm ChemicalBW-G0008
Sulfo-GMBSPerbio Science Germany22324
TipOne Tips 1,000 µLStarlabS1111-2021

Referencias

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