Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

Résumé

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.

Résumé

L’analyse des composants bioactifs présents dans les aliments et produits naturels est devenu un quartier populaire d’étude dans de nombreux domaines, y compris traditionnelle sécurité/toxicologie chinoise médecine et de la nourriture. Plusieurs des techniques classiques d’analyse nécessitent des équipements coûteux ou des compétences. Notamment, les dosages immuno-enzymatiques (Elisa) sont devenus une méthode nouvelle pour l’analyse des aliments et des produits naturels. Cette méthode est basée sur médiée par les anticorps de détection des composants cible. Cependant, comme de nombreux éléments bioactifs dans les produits naturels sont de petite taille (< 1 000 Da) et ne pas provoquer une réponse immunitaire, la création d’anticorps monoclonaux (ACM) contre eux est souvent difficile. Dans ce protocole, nous fournir une explication détaillée des étapes requises pour générer des ACM contre les molécules cibles ainsi que celles nécessaires pour créer les associés indirects concurrentiel (ic) ELISA pour l’analyse rapide de ce composé dans des échantillons multiples. La procédure décrit la synthèse de l’antigène artificiel (c.-à-d., le conjugué de l’Haptène-carrier), fusion cellulaire, vaccination, préparation d’hybridome monoclonale, caractérisation du Lam et l’application par ELISA de la mAb. Le conjugué de l’Haptène-carrier a été synthétisé par le sodium periodate méthode et évaluées par MALDI-TOF-MS. Après l’immunisation, les splénocytes ont été isolés chez la souris immunisée avec le titre d’anticorps plus élevé et fusionné avec l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) - lignée de cellules d’un myélome de souris sensibles Sp2/0 - Ag14 utilisant un polyéthylène glycol (PEG)-méthode de base. Les hybridomes sécrétant mAbs réagissant à l’antigène cible ont été criblés par icELISA de spécificité et de la réactivité croisée. En outre, la méthode de dilution limite a été appliquée pour préparer les hybridomes monoclonales. Le mAbs final ont été davantage caractérisé par icELISA et ensuite utilisé dans une application par ELISA pour la détection rapide et commode de l’Haptène exemple (naringine (NAR)) en produits naturels.

Introduction

Anticorps monoclonaux (ACM), également connu sous le nom des anticorps mono spécifiques, sont produites à partir d’un seul clone de lymphocyte et sont composés d’anticorps monovalents que tous se lient au même épitope¹. Ces dernières années, de nombreux produits naturels provenant de plantes médicinales ont été utilisés dans le traitement de diverses maladies². En effet, les nombreux petits composés moléculaires initialement dérivés de produits naturels sont maintenant appliquées comme des médicaments de première ligne, tels que de l’artémisinine pour le paludisme et paciltaxel (taxol) pour cancer^2,3. L’étude des produits naturels a rapidement progressé, en grande partie en raison de l’énorme développement et l’optimisation des techniques d’analyse classiques, y compris la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse (MS). Cependant, il y a encore quelques limitations associées à ces méthodes, telles que leurs protocoles complexes de prétraitement et les coûts connexes en ce qui concerne le temps, du travail et des compétences et instruments requis⁴.

Récemment, les analyses axées sur le mAb immuno-enzymatique (Elisa) ont été appliquées pour analyser qualitativement et quantitativement les aliments et produits naturels. En fait, cette méthode a été appliquée pour l’analyse des échantillons biologiques et des tests cliniques et a été montrée pour être précise, sensible et hautement efficace tout en évitant aussi les étapes de prétraitement fastidieux associés à d’autres analyses^{5, 6}.

Lors de l’utilisation de tests Elisa axée sur le mAb pour étudier les produits naturels complexes, préparation des anticorps monoclonaux est une des étapes essentielles. Malheureusement, le mAbs spécifiques aux petits composants bioactifs présents dans ces types de substances^{6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15} sont souvent limitées par rapport aux antigènes protéiques. Pour contourner ce problème, nous avons développé un protocole pour générer précisément mAbs contre petits composés. Le protocole présenté ici comprend la synthèse de l’antigène artificiel, immunisation de souris, fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte et la préparation de l’hybridome monoclonale.

Notamment, notre groupe de recherche a été étudier la formation du mAbs contre petits composés bioactifs des médecines traditionnelles chinoises et développer leurs applications pour des années. Dans nos études en cours, nous avons développé des ACM contre baicaline¹⁶, puerarin¹⁷, acide glycyrrhizique¹⁸, paeoniflorin¹⁹, ginsenoside Re²⁰, ginsenoside Rh1²¹et beaucoup d’autres petites molécules. Nos protocoles d’ELISA basés sur ces mAbs ont été utilisés dans un certain nombre d’études pour évaluer les propriétés pharmacocinétiques de ces petites molécules ainsi que leurs interactions avec d’autres composés bioactifs. En outre, à l’aide de ces ACM, nous avons également développé méthodes de chromatographie d’immunoaffinité pour la séparation des analogues structuraux, y compris les épimères. Récemment, nous avons préparé un immunoessai écoulement latéral à l’aide de notre mAb anti-puerarin qui a ensuite été utilisé pour la détection rapide, sur place de ce composé. Nos résultats indiquent que nos analyses mAb sont des outils indispensables et commodes pour l’étude de la biologie et la qualité de composés dérivés du naturel-produit, en particulier celles utilisées dans les médecines traditionnelles chinoises.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux dans cette étude ont été approuvés par le Comité d’examen éthique à l’Université de Pékin de médecine chinoise (agrément numéro 2016BZYYL00109).

Remarque : La souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été immunisés avec conjugués de protéines Haptène-carrier. Lorsqu’il est utilisé seul, une petite molécule (< 1 000 Da) ne peut pas déclencher une réponse immunitaire. Cependant, conjuguant la petite molécule à un résultats de macromolécule porteuse dans la synthèse de l’antigène. Dans ce contexte, la petite molécule est étiquetée un Haptène. Conjugaison de l’Haptène est une stratégie nécessaire et efficace pour la production de mAb. Pour éviter une réaction croisée, deux transporteurs protéiques, telles que l’albumine sérique bovine (BSA) et l’ovalbumine (OVA) ou l’Hémocyanine de patelle (KLH) et BSA, devrait être utilisé comme l’immunogènes (pour la vaccination animale) et les antigènes de revêtement (pour enduire la plaque pour anti-sérum détection). BSA et ovules sont utilisés à titre d’exemple dans le présent protocole.

1. préparation de l’immunogène et revêtement antigène

NOTE : Pour la synthèse de l’antigène artificiel, utilisez le groupe fonctionnel approprié (par exemple, hydroxyle, sulfhydryle carboxyle acide ou amino) comme le bras de côté pour la liaison covalente à la protéine de transporteur. La conjugaison de méthodes incluent le periodate oxydation, la méthode carbodiimide, une réaction d’anhydrides mixtes, une réaction de glutaraldéhyde et la méthode de succinate. Ce protocole utilise naringine (NAR), un glycoside flavanone bien connus, comme un exemple de composé. NAR est un composé de petit (581 Da) présent dans les agrumes ainsi que divers médicaments traditionnels chinois.

1. Une méthode d’oxydation périodate permet de synthétiser NAR-BSA et NAR-OVA conjugués.
   1. Dissoudre 50 mg de NAR dans l’eau à une concentration finale de 1 mg/mL,²².
   2. Ajouter 100 µL de sodium fraîchement préparé au périodate solution (0,1 M) à 5 mL de la solution de la NAR. Incorporer le mélange à température ambiante pendant 1 h.
2. Dissoudre 4 mg de BSA et ovules dans 2,0 mL de tampon de carbonate de 50 mM (pH 9,6). Ajouter cette protéine solution le NAR/sodium periodate mélange réactionnel.
3. Ajuster le mélange à pH 9 avec la solution 1 M Na₂CO₃ et mélanger à la température ambiante pendant 6 à 8 heures.
4. Dialyser le mélange réactionnel dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une membrane de dialyse (MWCO 10 kDa) pendant 3 jours afin d’échanger les obligations Convertibles.
5. Analyser le conjugué de l’Haptène-carrier à l’aide de matrix assisté laser desorption/ionisation temps de vol (MALDI-TOF)-MS.
   1. Mélanger 1-10 pmol du conjugué avec un 10³-replier un excès molaire de l’acide sinapique dans une solution aqueuse contenant de l’acide trifluoroacétique (TFA) de 0,15 %. Sécher le mélange sur une plaque d’échantillon dans l’air.
   2. Effectuer l’analyse à l’aide d’un MALDI-TOF, spectromètre de masse équipé d’un laser pulsé azote fonctionnant à 337 nm. Acquisition de spectres de masse MALDI ions positifs en mode linéaire dans la gamme de masse (m/z) de 15 000-100 000 comme précédemment décrit²².

2. vaccination

Remarque : Un total de 5 souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été utilisées : 4 pour NAR-conjugue vaccination et 1 pour la vaccination de contrôle (PBS).

1. Pour la première vaccination, mélanger 50 µg de conjugué (dilué dans 100 µL de PBS) avec un volume égal d’adjuvant complet de Freund (ACF) et émulsionner complètement. Administrer 100 µL de ce mélange pour chaque souris via dorsale injection sous-cutanée.
2. Deux semaines plus tard, livrer une dose de rappel de vaccination (100 µL) par injection sous-cutanée avec la même quantité de conjugué mélangé avec adjuvant incomplet (IFA).
3. Extrait 200 µL de sang de la veine caudale de chaque souris 7 jours plus tard pour obtenir le sérum.
   1. Centrifuger le sang à 3 000 x g pendant 10 min. transférer le sérum surnageant dans un nouveau tube.
   2. Analyser le sérum en utilisant une technique ELISA comme décrit précédemment²¹. Choisissez la souris avec le plus haut titre de sérum à utiliser pour la fusion cellulaire.
4. En préparation de la fusion cellulaire, administrer une immunisation pulsée à la souris choisie par injection intrapéritonéale de 50 µg du conjugué dans 300 µL de PBS sans adjuvant 3 jours avant la fusion.
   Remarque : Cette étape peut être omise si le titre est assez élevé.

3. préparation de la Fusion cellulaire

1. Préparation moyenne de fusion de cellules
   1. Pour le milieu sélectif de l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (chapeau) : dissoudre le 50 x supplément de médias HAT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS.
      Remarque : Lorsque les 10 mL de la solution concentrée 50 x sont dilués dans 500 mL de milieu de culture, les concentrations finales de l’hypoxanthine, aminoptérine et thymidine sont 100 µM, 0,4 µM et 16 µM, respectivement.
   2. Pour les médias de l’hypoxanthine-thymidine (HT) : dissoudre le 50 x supplément de médias HT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS. Les concentrations finales de l’hypoxanthine et la thymidine sont de 100 µM et 16 µM, respectivement.
2. La culture des cellules Sp2/0-Ag14.
   1. Au moins 7 jours avant la fusion, décongeler rapidement un flacon de liquide azote gelé SP2/0-Ag14 cellules myélomateuses dans l’eau chaude.
   2. Transvaser la solution de cellule dans 5 mL de milieu de culture fraîche (RPMI-1640) et centrifuger pendant 10 min à 1000 x g.
   3. Après centrifugation, enlevez le milieu de culture et remettre en suspension les cellules fraîches RPMI-1640 additionné de 10 % sérum fœtal (SVF).
   4. Transférer les cellules et le milieu dans un ballon jaugé de 25 cm² et incuber à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO₂.
   5. Développez les cellules 3 ou flacons² 4 75 cm avant la fusion.
3. Préparation de cellules de couche de conducteur abdominale
   1. Sacrifier une souris ICR de 12 semaines albinos par dislocation cervicale 1 jour avant la fusion cellulaire et il immergez-la dans 75 % d’éthanol.
   2. Après avoir enlevé la fourrure de l’abdomen avec une pince hémostatique, désinfecter la zone avec 75 % d’éthanol. Couper la peau extérieure pour exposer la cavité abdominale. Injecter des 3 mL du milieu RPMI 1640 stérile dans l’abdomen et massage de l’abdomen pour détacher des cellules supplémentaires dans la solution. Aspirer la suspension cellulaire de mangeoire dans un tube à centrifuger 15 mL.
   3. Après centrifugation de la suspension cellulaire pendant 10 min à 1000 x g, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules nourricières dans 20 mL de milieu sélectif de chapeau.
   4. Transférer les cellules dans les plaques de culture de cellules de 96 puits (100 µL/puits). Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO₂.

4. la Fusion cellulaire

1. Après l’élu immunisés souris a été établie pour la fusion cellulaire (voir étape 2,4), administrer une injection intrapéritonéale de l’hydrate de chloral 10 % (anesthésique) et sacrifier la souris immunisées par dislocation cervicale.
2. Recueillir le sang supplémentaire du cœur (1 mL) et préparer le sérum comme indiqué au point 2.3.1 à utiliser comme un contrôle positif lors de la sélection des hybridomes.
3. Enlever la peau et le tissu musculaire à l’aide de ciseaux pour exposer la rate.
4. Isoler la rate avec des pincettes avec soin et laver la rate avec RPMI-1640. Couper la rate en morceaux, puis enfoncez lentement la rate à triturer. Préparer une suspension de cellules de rate en appuyant sur le tissu de la rate à travers une passoire à 800 maille cellules dans un tube à centrifuger 50 mL.
5. Laver la suspension de cellules de rate avec milieu RPMI-1640. Récolter les cellules de la rate par centrifugation (1000 x g, 10 min et 4 ° C) et puis jeter le surnageant. Répétez cette étape de laver trois fois.
6. Sortir les cellules myélomateuses cultivées et amplifiés de l’incubateur et doucement robinet/secouer les fioles pour obtenir une suspension de cellules. Lavez cette suspension avec milieu RPMI 1640 deux fois pour enlever la FBS.
   NOTE : Ceci est une étape essentielle car FBS peut influencer la fusion cellulaire.
7. Compter les cellules et ajuster la concentration avant de les mélanger avec les cellules de la rate. Le rapport final des cellules de la rate pour les cellules de myélome doit être de 1:5 à 01:10.
8. Mélanger la cellule rate suspension et myélome des cellules. Centrifuger le mélange de cellules (1000 x g, 10 min et 4 ° C) et éliminer le surnageant.
9. Ajouter 1 mL de solution de 50 % de polyéthylène glycol (PEG) dans les cellules et remuer doucement à 37 ° C pendant 1 min. Laisser reposer pendant 30 s.
   Remarque : La solution de PEG utilisée dans cette étape doit contenir 50 % (p/v) de polyéthylène glycol 1500 et 10 % (v/v) diméthyl sulfoxyde (DMSO) dans du PBS sans calcium (Ca^{2 +}).
10. Ajouter 2 mL de milieu RPMI-1640 pendant 2 min terminer la réaction. Ajouter 2 mL supplémentaire du milieu RPMI 1640 pendant 1 min et puis ajouter 10 mL de milieu RPMI-1640 supplémentaire.
11. Centrifuger les cellules à 800 g pendant 10 min. Après avoir jeté le surnageant, ajouter la solution de chapeau et continuent à cultiver des cellules. Puis ajouter 100 µL de la suspension cellulaire dans chaque loge des plaques de couche de mangeoire et incuber les boîtes pendant 7 jours à 37 ° C, 5 % de CO₂.
    Remarque : Dans ces conditions, les cellules de myélome dont mourront tandis que les cellules hybridomes continuera de croître dans le milieu HAT. Après 7 jours, anticorps monoclonal hybridome formera comme un seul groupe de cellules dans le puits, tandis que puits contenant des hybridomes polyclonaux aura plusieurs amas de cellules.
12. Aspirer le surnageant pour analyse et remplacer le support par support HT.
    Remarque : N’oubliez pas de remplacer le milieu HAT avec HT moyen première comme passer directement au milieu sans additifs est préjudiciable à l’hybridome.

5. indirecte ELISA concurrent (icELISA)

1. Recouvrir une plaque à 96 puits avec NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/puits) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C.
2. Bloquer la plaque avec 300 µL de GPBS (PBS contenant la gélatine de 1 % m/v) pendant 1 h à 37 ° C pour empêcher l’adsorption non spécifique.
3. Laver la plaque trois fois avec TPB (PBS contenant 0,05 % v/v Tween-20).
4. Diluer la NAR en une série de concentrations de méthanol à 10 %. Ajouter 50 µL de ces dilutions à différents puits. Dans les autres puits, ajouter 50 µL de sérum ou d’hybridome surnageante (contenant du mAbs). Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C.
5. Ajouter 100 μL d’antisouris marqué à la peroxydase IgG dans chaque puits et incuber pendant une 1 heure supplémentaire.
6. Après avoir lavé la plaque trois fois avec TPB, ajouter 100 µL de solution de substrat (0,1 M citrate tamponné (pH 4) contenant 0,015 % v/v H₂O₂ et 2 mg/mL de 3, 3', 5, 5'-tétraméthyl benzidine (TMB)) à chaque puits et incuber pendant 15 min.
7. Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de 1 M H₂SO₄ dans chaque puits.
8. Mesurer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 450 nm. Choisissez les hybridomes qui sécrétaient les plus fortes concentrations d’anticorps NAR dans leur surnageant pour davantage de préparation.

6. préparation des hybridomes Monoclonales

1. Utilisez la méthode de dilution limite pour préparer les hybridomes monoclonales.
   1. Après avoir retiré le support HT des hybridomes choisis (c.-à-d. ceux positifs pour la sécrétion d’anticorps NAR), remettre en suspension les cellules en milieu RPMI 1640 et les compter.
   2. Diluer les cellules à une concentration de 1 cellule 2 cellules et 4 cellules / puits dans 100 µL de milieu RPMI 1640 dans une plaque à 96 puits. Incuber les plaques à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   3. Après 7-10 jours, détecter les anticorps NAR dans la culture surnageante à l’aide du protocole d’icELISA (étape 5). Cellules de transfert depuis les hybridomes qui sont positifs aux anticorps anti-NAR plaques 24 puits, 25 cm² flacons et fioles² 75 cm pour la culture.
2. Cryoconservé les hybridomes monoclonales.
   1. Récolter les cellules et de les transférer pour tubes de centrifugeuse.
   2. Après centrifugation des cellules (800 x g, 10 min), retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules de congélation moyen (RPMI-1640, sérum de veau foetal de 20 % (FCS) et 10 % DMSO). Transférer les suspensions cellulaires pour cryotubes.
   3. Stocker les cryotubes dans une glacière thermo-électrique dégradé à-80 ° C pendant 24 h. Puis transférez les cryotubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.

Résultats

Génération des hybridomes monoclonales

Le poids moléculaire du conjugué Haptène-carrier a été confirmé par analyse de MALDI-TOF-MS. Comme le poids moléculaire de BSA et de la NAR sont connus, le nombre de petites molécules conjuguées avec BSA pourrait être calculé. La figure 1 montre les résultats spectrales représentatifs de la NAR-BSA

Discussion

Nous présentons ici un protocole pour le succès de la production du mAbs contre naturels produit dérivé de petites molécules. Les étapes essentielles de la procédure ont été exposées, et nous avons démontré l’utilité du présent protocole à l’aide de NAR comme une petite molécule d’exemple. Les spectres de l’exemple, les analyses de réactivité et icELISA résultats tous montrent représentant expérimental et les données de contrôle qui sont obtenues à l’aide de ce protocole. Images d’exem...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter	FALCON	352340
24 well culture plate	NUNC	119567
25 cm2 Flask	Labserv	310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)	Sigma Aldrich	860336 1G
75 cm2 Flask	Corning	430720
96 well culture plate	NUNC	117246
bovine serum albumin	AMRESCO	332
cell strainer	FALCON	352340
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
cultivator	DRP-9082	Samsung
dialysis membrane (10kDa)	Heng Hui	45-10000D
dimethylsulfoxide	Sinopharm Chemical	DH105-10
electronic balance	BS124-S	Sartorius
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
ethanol, 96%	Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete	Sigma Aldrich	SLBL0210V
Gelatin	AMRESCO	9764-500g
Gradient cooler container	Nalgene	5100-0001
HAT media supplement	Sigma Aldrich	H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
HT media supplement	Sigma Aldrich	H0137-10VL
Inverted Microscope	IX73	Olympus
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
MALDI-TOF-MS	Axima-CFR  plus	Axima
Microplate Reader	BioTex	ELX-800
mouse	Vital River	BALB/c
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG	Sigma Aldrich	RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution	Hyclone	SV30010
Pipette 10 mL	COSTAR	4488
Pipette 25 mL	FALCON	357525
RPMI 1640	Corning	10-040-CVR
skim milk	applygen	P1622
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021