针对天然产物的单克隆抗体的产生

摘要

本文提供了一个详细的方案, 用于制备和评价用于各种免疫检测的天然产品单克隆抗体。该程序包括免疫接种、细胞融合、用于阳性克隆筛选的间接竞争性 ELISA 和单克隆杂交瘤制剂。还提供了使用 maldi TOF-MS 和 ELISA 分析进行抗体表征的规范。

摘要

对食品和天然产品中存在的生物活性成分的分析已成为中医药、食品安全毒理学等多个领域的热门研究领域。许多经典的分析技术需要昂贵的设备和专业知识。值得注意的是, 酶联免疫吸附法 (Elissa) 已成为分析食品和天然产品的一种新方法。该方法基于抗体介导的目标成分检测。然而, 由于天然产品中的许多生物活性成分很小 (和 lt;1,000 的含量), 不会诱发免疫反应, 因此对其产生单克隆抗体往往很困难。在本协议中, 我们详细解释了针对目标分子生成 mAbs 所需的步骤, 以及创建相关的间接竞争 (ic) ELISA 以快速分析多个样品中的化合物所需的步骤。该程序描述了人工抗原 (即, 随体共轭) 的合成、免疫、细胞融合、单克隆杂交瘤制剂、mab 的表征以及 mab 的基于 elisa 的应用。采用钠周期法合成了伴随载体共轭, 并用 aldi TOF-MS 进行了评价。免疫后, 用聚乙二醇 (peg) 基方法从抗体滴度最高的免疫小鼠中分离出脾细胞, 并与低黄嘌呤-氨基铂-胸苷 (HAT) 敏感的小鼠骨髓瘤细胞系 Sp2/0-ag14 熔融。用 icELISA 对对靶抗原进行了 Mabs 反应性的杂交瘤的特异性和交叉反应性筛选。此外, 还采用极限稀释法制备单克隆杂交瘤。最后的 mAbs 进一步被特征的 icELISA, 然后在 elisa 为基础的应用程序中用于快速和方便地检测示例阿平 (naringin (NAR)) 在自然产品中。

引言

单克隆抗体 (mAbs), 也称为单特异性抗体, 由单个 b 淋巴细胞克隆产生, 由单卵形抗体^组成, 所有抗体都与同一表位1结合。近年来, 许多药用植物衍生的天然产品被用于各种疾病的治疗.事实上, 许多最初从天然产物中提取的小分子化合物现在被用作一线药物, 如疟疾青蒿素和 2,³种癌症^的紫杉醇 (紫杉醇)。天然产物的研究取得了较快的进展, 这在很大程度上是由于传统分析技术的巨大发展和优化, 包括高效液相色谱 (HPLC) 和质谱 (MS)。然而, 这些方法仍然存在一些限制, 例如其复杂的预处理方案以及在时间、劳动力专门知识和所需文书^方面的相关费用4。

近年来, 基于 mabs 的酶联免疫吸附法 (Elissa) 已被应用于食品和天然产物的定性和定量分析。事实上, 这种方法已被应用于生物样品分析和临床试验, 并已被证明是准确的, 敏感的, 高效的, 同时也避免了繁琐的预处理步骤与其他分析 5^{, 6}。

当使用基于 mabs 的 Elisa 研究复杂的天然产物时, 单克隆抗体的制备是核心步骤之一。不幸的是, 这些类型的物质中存在的小生物活性成分^的mabs^{6、7、8、9}、^{10、11、12与}蛋白质抗原相比,^{13、14、15 通常}是有限的。为了规避这个问题, 我们开发了一个协议, 专门生成针对小化合物的 mAbs。这里介绍的方案包括人工抗原合成、小鼠免疫接种、细胞融合、间接竞争 ELISA 和单克隆杂交瘤制剂。

值得注意的是, 我们的研究小组多年来一直在研究针对中药中的小生物活性化合物形成 mAbs 的问题, 并开发其应用。在我们正在进行的研究中, 我们开发了针对黄芪^{苷 16}、葛根^{素 17}、甘草酸¹⁸、paeoniflorin¹⁹、人参皂苷 re 20、人参皂苷 Rh1 等许多小分子的 mabs.我们基于这些 mAbs 的 ELISA 协议已被用于许多研究, 以评估这些小分子的药代动力学及其与其他生物活性化合物的相互作用。此外, 利用这些 mAbs, 我们还开发了免疫亲和层析方法来分离结构类似物, 包括表皮。最近, 我们准备了一个侧流免疫分析使用我们的抗葛根素 mAb, 随后用于快速, 现场检测这种化合物。我们的研究结果表明, 我们基于 mabs 的检测方法对于研究天然产品衍生化合物的生物学和质量, 特别是中药中使用的化合物的生物学和质量, 是不可或缺的、方便的工具。

研究方案

本研究中进行的所有动物程序都已得到北京中专大学伦理审查委员会的批准 (批准号 2016BZYL00109)。

注: 雌性 balb1 小鼠 (8周大) 接受了带携带蛋白结合物的免疫。单独使用时, 一个小分子 (lt;1,000 的大分子) 不能引起免疫反应。然而, 将小分子与载体大分子结合会导致抗原合成。在这种情况下, 小分子被标记为触觉。采用辅助共轭是一种必要而有效的 mAb 生产策略。为避免交叉反应, 应使用两种不同的蛋白质载体, 如牛血清白蛋白 (BSA) 和卵白蛋白 (OVA) 或锁孔限制血青素 (KLH) 和 BSA, 作为免疫原 (用于动物免疫) 和涂衣抗原 (覆盖板上的抗血清检测)。在本协议中, BSA 和 OVA 用作示例。

1. 免疫原和涂料抗原的制备

注: 对于人工抗原合成, 使用适当的官能团 (例如, 羟基、磺酰基羧酸或氨基) 作为与载体蛋白共价结合的侧臂。共轭方法包括环空氧化法、卡二酰亚胺法、混合酸酐反应、戊二醛反应和琥珀酸法。该协议使用纳林素 (NAR), 一个著名的黄酮糖苷, 作为一个例子化合物。NAR 是柑橘类水果和各种中药中存在的一种小化合物 (581 达)。

1. 使用环期氧化过程合成 AR-BSA 和 NAR-OVA 共轭。
   1. 在最终浓度为 1 mgml 22 的情况下, 在水中溶解50毫克的 nar。
   2. 在 NAR 溶液中加入100Μl 的新鲜制备的钠周期溶液 (0.1 M)。在室温下搅拌混合物1小时。
2. 在2.0 毫升的碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中溶解4毫克 BSA 和 OVA。将这种蛋白质溶液添加到 nar·钠骨胶反应混合物中。
3. 用 1m Na 2co3 溶液将混合物调整到 ph 值 9, 并在室温下搅拌6-8。
4. 用透析膜 (MWCO 10 kDa) 将反应混合物透析为磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 3天, 以交换 CBS。
5. 利用矩阵辅助激光分离 (MALDI-TOF)-ms 分析了光载波共轭。
   1. 将共轭的 1-10-10 pmol 与 10 3倍的鼻窦比酸的摩尔混合在含有0.15 的三氟乙酸 (tfa) 的水溶液中。将混合物在样品板上的空气中干燥。
   2. 使用配备脉冲氮气激光器的 ALDI-TOF 质谱仪进行分析, 操作在337纳米。如前面所述 22, 在15000-1000000 的质量范围内, 以线性模式获得正离子 M/Z 质谱.

2. 免疫接种

注: 共使用了 5只 balb1 雌性小鼠 (8周大): 4 例用于 NAR 共轭免疫, 1 例用于对照免疫 (PBS)。

1. 对于第一次疫苗接种, 将50微克的共轭 (在100μl 的 PBS 中稀释) 与相同体积的 Freund 的完整佐剂 (CFA) 混合, 并完全乳化。通过背皮注射将这种混合物的100Μl 涂给每只小鼠。
2. 两周后,通过皮下注射提供强化疫苗接种 (100μl), 并与不完全佐剂 (ifa) 混合相同数量的共轭。
3. 7天后从每只小鼠的尾静脉中提取200μl 的血液, 以获得血清。
   1. 以 3, 000 x 克的速度将血液离心 10分钟, 将血清上清液转移到新鲜的试管中。
   2. 使用酶联免疫吸附法分析血清, 如前面所述²¹。选择血清滴度最高的小鼠用于细胞融合。
4. 在准备细胞融合时, 通过腹腔注射50μg 的 PBS 共轭,在融合前3天对所选择的小鼠进行脉冲免疫接种, 而无需佐剂。
   注: 如果滴度足够高, 则可以省略此步骤。

3. 细胞融合的制备

1. 细胞融合介质制剂
   1. 对于下黄嘌呤-氨基肽-胸苷 (HAT) 选择性培养基: 溶解 rpmi-1640 10 毫升中 50x hat 介质的补充, 并将该混合物添加到含有 20% FBS 的 500ml rpmi-1640 中。
      注: 当50x 精矿中的10毫升在500毫升培养基中稀释时, 次黄嘌呤、氨基吡啶和胸苷的最终浓度分别为100Μm、0.4μm 和16Μm。
   2. 对于下黄嘌呤-胸腺胺 (HT) 介质: 溶解 rpmi-1640 10 毫升中 50x HT 介质的补充, 并将这种混合物添加到含有 20% FBS 的 RPMI-1640 的500毫升中。亚黄嘌呤和胸苷的最终浓度分别为100μm 和16μm。
2. 培养 Sp2/0-Ag14 细胞。
   1. 在融合前至少 7天, 在温水中迅速解冻一小瓶液体氮冷冻 sp2变-ag14 骨髓瘤细胞。
   2. 将细胞溶液转化为5毫升的新鲜培养基 (RPMI-1640) 和离心机 10分钟, 在 1000 x g。
   3. 离心后, 去除培养基, 重新悬浮新鲜 rpmi-1640 中的细胞, 辅以10% 的胎牛血清 (FBS)。
   4. 将细胞和培养基转移到25厘米的2瓶^中, 在5°c 的大气中孵育.
   5. 融合前, 将细胞扩大到3或 4 75 厘米²瓶。
3. 腹式给料层细胞的制备
   1. 在细胞融合前1天通过宫颈脱位产膜下1周岁的白化病 icr 小鼠, 并将其浸入75% 乙醇中。
   2. 用止血钳从腹部取出毛皮后, 用75% 乙醇对该部位进行消毒。切割外皮, 露出腹腔。将3毫升的无菌 RPMI-1640 培养基注入腹部, 按摩腹部, 将额外的细胞分离到溶液中。将给料器细胞悬浮液浸入15毫升离心管中。
   3. 在 1000 x g 离心细胞悬浮液10分钟后, 在 HAT 选择性介质20毫升中丢弃上清液并重新悬浮进料细胞。
   4. 将细胞转移到96孔细胞培养板 (100Μl/well) 中。在 37°c 5% co 2 下将板材连夜培育.

4. 细胞融合

1. 在选择免疫小鼠制备细胞融合 (见步骤 2.4) 后, 进行腹腔注射10% 的水合氯醛 (麻醉剂), 并通过宫颈脱位牺牲免疫小鼠。
2. 从心脏收集额外的血液 (1 毫升), 并准备血清, 如步骤2.3.1 中所述, 在杂交瘤选择过程中用作阳性对照。
3. 用剪刀去除皮肤和肌肉组织, 露出脾脏。
4. 用推子仔细隔离脾脏, 用 RPMI-1640 清洗脾脏。把脾脏切成碎片, 慢慢地把脾脏打得三头。通过800目细胞过滤器将脾脏组织压入50毫升离心管, 准备脾脏细胞悬浮液。
5. 用 RPMI-1640 培养基清洗脾脏细胞悬浮液。通过离心 (1000 x 克、10分钟和 4°c) 采集脾脏细胞, 然后丢弃上清液。重复此清洗步骤三次。
6. 从孵化器中取出培养和扩增的骨髓瘤细胞, 轻轻摇晃烧瓶以获得细胞悬浮液。用 RPMI-1640 介质清洗此悬浮液两次, 以卸下 FBS。
   注: 这是一个重要的步骤, 因为 FBS 可能会影响细胞融合。
7. 在与脾脏细胞混合之前, 先对细胞进行计数, 并调整浓度。脾脏细胞与骨髓瘤细胞的最终比例应在1:5 和 1:10 之间。
8. 将脾脏细胞悬浮液和骨髓瘤细胞混合。离心细胞混合物 (1000 x 克, 10分钟和 4°c), 并去除上清液。
9. 在电池中加入1毫升50% 的聚乙二醇 (PEG) 溶液, 在37°c 下轻轻搅拌1分钟。让我们站30秒。
   注: 此步骤中使用的 PEG 溶液应包含 50% (w/v) 聚乙二醇1500和 10% (v/v) 二甲基亚硫酸 (DMSO) 在无钙 (Ca^{2 +}) 的 pbs 中。
10. 加入2毫升的 RPMI-1640 介质, 2分钟终止反应。添加额外的2毫升 RPMI-1640 介质, 再增加 1分钟, 然后再添加10毫升的 RPMI-1640 介质。
11. 以 800 x g 离心细胞10分钟。丢弃上清液后, 加入 HAT 溶液, 继续培养细胞。然后在进料层板的每口井中加入100Μl 的细胞悬浮液, 在 37°c 5% co 2 下孵育板 7天.
    注: 在这些条件下, 未融合的骨髓瘤细胞将死亡, 而杂交瘤细胞将继续生长在 HAT 介质中。7天后, 单克隆杂交瘤将形成为井中的单个细胞群, 而含有多克隆杂交瘤的井将有多个细胞群。
12. 吸收上清液进行分析, 用 HT 培养基代替该培养基。
    注: 一定要先用 HT 介质代替 HAT 介质, 因为直接切换到未补充介质对杂交瘤有害。

5. 间接竞争 ELISA (icELISA)

1. 涂上96孔板, 配有 NAR-OVA (1μgml, 100μl), 在37°c 孵育 1小时, 在4°c 下孵育1小时。
2. 在37°c 下, 用300μl 的 GPBS (含有 1% m/v 明胶的 PBS) 将板材块在1小时内, 以防止非特异性吸附。
3. 用 TPBS 清洗三次板材 (PBS 含有0.05% 的 Weben-20)。
4. 将未共轭的 NAR 稀释为含有10% 甲醇的一系列浓度。在分离的井中加入50Μl 的稀释剂。在其他井中, 加入50μl 的抗血清或杂交体上清液 (含 mAbs)。在37°c 下将板材孵化1小时。
5. 在每口井中加入100μl 的过氧化物酶标记的抗小鼠 IgG, 并孵育1小时。
6. 用 TPBS 清洗板三次后, 在每口井上加入100μl 底物溶液 (0.1 M 柠檬酸缓冲_{液 (} ph 4), 其中含有 0.015 vvh2o 2 和 2 Mg/ml, 分别为3、3 '、5 '-四甲基联胺 (tmb), 孵育 15分钟.
7. 通过在每口井中加入50Μl 的 1M H2so4 来停止反应.
8. 使用 450 nm 的微板读取器测量吸收率。选择将最高浓度的 NAR 抗体分泌到上清液中进行进一步制备的杂交瘤。

6. 单克隆杂交瘤的制备

1. 采用极限稀释法制备单克隆杂交瘤。
   1. 从选定的杂交瘤 (即nar 抗体分泌呈阳性的杂交瘤) 中去除 ht 培养基后, 重新悬浮 rpmi-1640 中的细胞并对其进行计数。
   2. 在96孔板中, 在100μl 的 RPMI-1640 中, 将细胞稀释到每个孔1个细胞、2个细胞和4个细胞的浓度。在 37°c, 5% co₂下培养板材。
   3. 7-10 后, 使用 icELISA 协议 (第5步) 检测培养上清液中的 NAR 抗体。将对 NAR 抗体呈阳性的杂交瘤细胞转移到24孔板、25厘米²瓶和75厘米2瓶进行培养 。
2. 冷冻储备单克隆杂交瘤。
   1. 收集细胞并将其转移到离心管中。
   2. 在离心细胞 (800 x 克, 10分钟) 后, 取出上清液并在冷冻培养基 (RPMI-1640, 20% 胎儿小牛血清 (FCS) 和 10% DMSO) 中重新悬浮细胞。将细胞悬浮液转移到低温管中。
   3. 将低温管存放在-80°c 的梯度冷却箱中24小时。然后将低温管转移到液氮中进行长期储存。

结果

单克隆杂交瘤的产生

通过 aldi-TOF-MS 分析, 确定了伴随载体共轭的分子量。由于 BSA 和 NAR 的分子量都是已知的, 因此可以计算出与 BSA 结合的小分子的数量。图 1 显示了 nar-bsa²²具有代表性的光谱结果, 该结果在7, 058 m/zz 处显示一个宽峰值。由于 BSA 的平均分...

讨论

在这里, 我们提出了一个协议, 成功地生产 mAbs 对天然产品衍生的小分子。该过程中的基本步骤已经概述, 我们已经证明了这个协议的效用使用 NAR 作为一个例子小分子。实例谱、反应性分析和 icELISA 结果均显示了该协议获得的具有代表性的实验和控制数据。杂交瘤的示例图像提供了研究人员在区分单克隆和多克隆杂交圆顶时应该寻找的内容的视觉表示。总之, 我们已经证明, 这里介绍的 mAb 生产、?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter	FALCON	352340
24 well culture plate	NUNC	119567
25 cm2 Flask	Labserv	310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)	Sigma Aldrich	860336 1G
75 cm2 Flask	Corning	430720
96 well culture plate	NUNC	117246
bovine serum albumin	AMRESCO	332
cell strainer	FALCON	352340
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
cultivator	DRP-9082	Samsung
dialysis membrane (10kDa)	Heng Hui	45-10000D
dimethylsulfoxide	Sinopharm Chemical	DH105-10
electronic balance	BS124-S	Sartorius
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
ethanol, 96%	Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete	Sigma Aldrich	SLBL0210V
Gelatin	AMRESCO	9764-500g
Gradient cooler container	Nalgene	5100-0001
HAT media supplement	Sigma Aldrich	H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
HT media supplement	Sigma Aldrich	H0137-10VL
Inverted Microscope	IX73	Olympus
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
MALDI-TOF-MS	Axima-CFR  plus	Axima
Microplate Reader	BioTex	ELX-800
mouse	Vital River	BALB/c
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG	Sigma Aldrich	RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution	Hyclone	SV30010
Pipette 10 mL	COSTAR	4488
Pipette 25 mL	FALCON	357525
RPMI 1640	Corning	10-040-CVR
skim milk	applygen	P1622
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021