天然物に対するモノクローナル抗体の作製

要約

準備および様々 なイムノアッセイ用天然物に対するモノクローナル抗体の評価のための詳しいプロトコルを説明します。この手順には、予防接種、細胞融合、スクリーニング、肯定的なクローンとモノクローナルハイブリドーマ準備のため間接競合 elisa 法が含まれています。MALDI TOF MS と ELISA 解析を使用して抗体の特性の仕様もあります。

要約

食品や天然物の生理活性成分の分析は、伝統的な中国医学や食品安全/毒物学を含む多くの分野で研究の人気のエリアになっています。古典的な分析の技術の多くは高価な機器や専門知識を必要とします。特に、酵素抗体法 (Elisa) 食品や天然物の分析のための新たな方法となっています。このメソッドは、ターゲット コンポーネントの抗体検出に基づいています。しかし、天然の生理活性成分の多くが小さい (< 1,000 Da) と免疫反応を誘発しない、それらに対するモノクローナル抗体 (Mab) を作成するは困難です。このプロトコルでは、複数のサンプルの化合物の迅速分析に関連する間接競争 (ic) ELISA を作成に必要なものだけでなく、標的分子に対する抗体を生成するために必要な手順の詳細な説明を提供します。手順では、(すなわち、ハプテン キャリア共役) 人工抗原の合成、免疫、細胞融合、モノクローナルハイブリドーマ準備、モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションと mAb の elisa 法を用いたアプリケーションについて説明します。ハプテン キャリア共役はナトリウムによって合成されたメソッドを過ヨウ素酸し、MALDI TOF MS によって評価されます。予防接種後脾細胞が最も高い抗体価と免疫マウスから分離したし、ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) - 敏感なマウス骨髄腫細胞ライン Sp2/0 - Ag14 と融合、ポリエチレング リコール (PEG) を使用しての手法します。ターゲット抗原に対する反応性抗体産生ハイブリドーマの特異性と交差反応性の icELISA で上映されました。さらに、限界希釈法は、モノクローナル ハイブリドーマの準備に適用されました。最終的な Mab icELISA によってさらに特徴づけられる、天然の例ハプテン (ナリンギン (NAR)) の迅速で簡便な検出のための elisa 法を用いたアプリケーションのために用いられる。

概要

モノクローナル抗体 (Mab)、として知られているモノラル特異的抗体、単一 b リンパ球クローンから生成され、すべてが同じエピトープ¹にバインドすると 1 価の抗体で構成されています。近年、多く薬用植物由来の天然物は、様々 な病気の²の治療に使用されています。確かに、もともと天然物から派生した多くの小さな分子の化合物が癌^2,3paciltaxel (タキソール) ・ マラリアのアルテミシニンなどの最初の行薬として適用されます。天然物の研究は主に途方もない開発と高速液体クロマトグラフィー (HPLC) や質量分析法 (MS) など、従来の解析手法の最適化のための急速な進歩をしました。ただし、まだ複雑な前処理プロトコルや時間、労働/専門知識、および必要な楽器⁴に関して関連するコストなど、これらの方法に関連付けられているいくつかの制限があります。

最近では、モノクローナル抗体を用いた酵素抗体法 (Elisa) は、定性的・定量的分析食品や天然物に適用されています。実際には、このメソッドの生体試料分析と臨床検査の両方に適用されているし、も関連付けられているその他の解析^{5、面倒な前処理手順を回避しながら、正確、敏感、かつ高効率に示されています。 6}。

モノクローナル抗体を用いた Elisa を使用して、複雑な天然物を研究する、モノクローナル抗体の調製は、主な手順の 1 つです。残念ながら、Mab は小さな生物活性成分物質^{6,7,8,9,10、11,12 のこれらのタイプの存在に固有 ,13,14,15}蛋白質の抗原と比較して限られています。この問題を回避するためには、具体的には小さな化合物に対して抗体を生成するプロトコルを開発しました。ここで提示されたプロトコルには、人工抗原の合成には、マウス免疫には、細胞融合には、間接競合 ELISA にはモノクローナルハイブリドーマ準備が含まれます。

特に、我々 の研究グループは中国の伝統薬から小さな生理活性物質に対するモノクローナル抗体の形成を勉強と長年彼らのアプリケーションを開発されています。当社の継続的研究では、baicalin¹⁶、puerarin¹⁷グリチルリチン酸¹⁸、ペオニフロリン¹⁹、ジンセノ サイド Re²⁰、ジンセノ サイド Rh1²¹、および他の多くの小さい分子に対して抗体を開発しました。これらの Mab に基づいて私達の ELISA のプロトコルは、その他の生理活性物質との相互作用と同様に、これらの小さな分子の薬物動態を評価する多くの研究で使用されています。さらに、これらのモノクローナル抗体を使用して、構築した immunoaffinity クロマトグラフィー法黒淵を含む構造の類似物の分離。最近では、この化合物、敷地内に急速な検出のために使用されました私たちの抗 puerarin モノクローナル抗体を用いた側方流動免疫測定法をご用意しました。モノクローナル抗体アッセイが生物学と伝統的な中国薬で使用される特にそれら天然由来製品化合物の質を研究するための不可欠なツールであることが示唆されました。

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プロトコル

本研究で動物の手続きのすべては、中国医学 (承認番号 2016BZYYL00109) の北京大学の倫理審査委員会によって承認されています。

注: 女性 BALB/c マウス (8 週齢) はハプテン キャリア蛋白抱合体で免疫しました。単独で、使用する小分子 (< 1,000 Da) 免疫反応を引き出すことはできません。しかし、抗原の合成高分子キャリアに小さな分子を活用します。この文脈では、小さな分子は、ハプテンにラベルを付けます。ハプテン共役は、モノクローナル抗体の生産のために必要かつ効果的な戦略です。ウシ血清アルブミン (BSA) や卵白アルブミン (OVA) 鍵穴カサガイ ヘモシアニン (KLH) など、2 つの異なる蛋白質キャリア交差反応を避けるために、(コート用プレートに (動物の予防接種) の混合とコーティング抗原として使用する BSA、抗血清の検出)。BSA と卵子は、このプロトコルの例として使用されます。

1. 免疫およびコーティングの抗原の準備

注: 人工抗原の合成の適切な機能グループ (例えば、ヒドロキシル基、スルフヒ カルボキシル基酸、またはアミノ酸) のとして使用側の腕にキャリア蛋白と共有結合。活用方法には、過ヨウ素酸酸化、カルボジイミド法、混合酸無水物の反応、グルタルアルデヒド反応コハク酸法。このプロトコルは、例の化合物としてナリンギン (NAR)、有名のフラバノン配糖体を使用します。NAR は小さなコンパウンド (581 Da) 様々 な漢方薬と同様に、柑橘系の果物に存在です。

1. 過ヨウ素酸酸化プロシージャを使用して、NAR BSA と NAR-卵子複合体を合成します。
   1. 最終濃度 1 mg/mL²²で水に NAR の 50 mg を溶解します。
   2. 作りたてのナトリウムの 100 μ L は、NAR 溶液 5 mL にソリューション (0.1 M) を過ヨウ素酸を追加します。混合物を 1 時間室温で攪拌します。
2. 2.0 mL の 50 mM 炭酸バッファー (pH 9.6) BSA の OVA 4 mg を溶解します。このタンパク質を加える NAR/ナトリウムの解決策は、反応混合物を過ヨウ素酸。
3. 1 M Na₂CO₃溶液を pH 9 混合比を調整し、6-8 時間室温で攪拌します。
4. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 3 日間透析膜 (MWCO 10 kDa) を使用して、CBS を交換するで反応混合物を dialyze します。
5. マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI tof) 時を使用してハプテン キャリア共役を分析-MS。
   1. 共役の 10 の 1-10 pmol のミックス³-0.15% トリフルオロ酢酸 (TFA) を含む水溶液中の sinapinic 酸のモル超過分を折る。空気中サンプル皿に混合物を乾燥させます。
   2. パルス窒素レーザー装備質量運営 337 MALDI TOF を使用して分析を行う nm。15,000 100,000 として前述の²²の質量範囲 (m/z) 内で線形モードで正イオン MALDI マススペクトルを取得します。

2. 予防接種

注: 5 BALB/c マウス (8 週齢) の合計が使用されて: nar 4 共役予防接種とコントロール (PBS) 予防接種のための 1。

1. 最初の予防接種の Freund 完全アジュバント (CFA) の等量を (100 μ L の PBS で希釈) 共役の 50 μ g を混合し、完全に乳化します。この混合物を 100 μ L を各マウス経由で背側皮下注射に管理します。
2. 2 週間後は、同じ不完全なアジェバント (IFA) と混合共役量とブースターの皮下注射によるワクチン接種 (100 μ L) を提供します。
3. 200 μ L の血液のすべてのマウスの尾静脈から 7 日後に抽出血清を入手します。
   1. 10 分間遠心分離機 3,000 x g で血は新鮮なチューブに上清の血清を転送します。
   2. 前述の²¹として ELISA を用いた血清を分析します。細胞融合に使用する最高の血清抗体価とマウスを選択します。
4. 細胞融合の準備で、融合前に 3 日間 300 μ L の PBS 補助なしで共役の 50 μ g の腹腔内注入を介して選択したマウスにパルス予防接種を管理します。
   注: 力価は十分に高い場合は、この手順を省略できます。

3. 細胞融合のための準備

1. セル融合中準備
   1. ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) の選択的な媒体のため: RPMI 1640 の 10 mL の帽子メディア サプリメント x 50 を溶かし RPMI 1640 の 500 mL にこの混合物を追加して 20% を含む政府短期証券。
      注: 50 倍濃縮の 10 mL は、500 mL の培地で希釈されて、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンの最終濃度が 0.4 μ M、100 μ M、16 μ M それぞれ。
   2. ヒポキサンチン チミジン (HT) メディア: RPMI 1640 の 10 mL で HT メディア サプリメント x 50 を溶かし RPMI 1640 の 500 mL にこの混合物を追加して 20% を含む政府短期証券。ヒポキサンチンとチミジンの最終濃度は、それぞれ 100 μ M と 16 μ M です。
2. Sp2/0-Ag14 細胞を培養します。
   1. 融合、前に少なくとも 7 日間は急速に液体窒素凍結 SP2/0-Ag14 骨髄腫細胞に暖かい水の入った瓶を解凍します。
   2. 新鮮な培地 (RPMI 1640 年) 5 mL、1000 × g で 10 分間遠心する携帯ソリューションに転送します。
   3. 遠心分離の後培養培地を削除し、新鮮な RPMI 1640 年 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した細胞を再懸濁します。
   4. 25 cm²フラスコに細胞と培地を転送し、37 ° c 5% CO₂の大気中で孵化させなさい。
   5. 3 または 4 75 cm²フラスコ融合前にセルを展開します。
3. 腹部フィーダー層細胞の調製
   1. 頚部転位前日細胞融合によってアルビノ 12 週齢 ICR マウスを犠牲に、75% エタノールで水没します。
   2. 止血鉗子で腹部から毛を除去した後、エタノール 75% と領域を消毒します。腹腔内を公開する外側の皮膚をカットします。腹部に RPMI 1640 生殖不能媒体の 3 mL を注入し、ソリューションに追加のセルをデタッチするのには腹部をマッサージします。15 mL 遠心管にフィーダー細胞懸濁液を吸い出しなさい。
   3. 1000 × g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心分離後上澄みを廃棄し、帽子選択培地 20 mL にフィーダー細胞を再懸濁します。
   4. 96 ウェルの細胞培養皿 (100 μ L/ウェル) にセルを転送します。一晩で 37 ° C、5% CO₂版を孵化させなさい。

4. 細胞融合

1. マウスがセル融合のため準備されている選択された接種後 (ステップ 2.4 を参照)、10% 抱水クロラール (麻酔薬) の腹腔内注射し、頚部転位を介して免疫マウスを犠牲に。
2. (1 mL)、心の底から追加の血液を収集し、手順 2.3.1 ハイブリドーマ選択中に肯定的な制御として使用する血清を準備します。
3. 脾臓を公開するはさみを使用して皮膚や筋肉組織を削除します。
4. 慎重にピンセットで脾臓を分離し、RPMI 1640 と脾臓を洗ってください。脾臓を切るし、ゆっくりカップ刻んだ脾臓をポンドします。50 mL の遠心管にセルにある、800 メッシュのストレーナを脾臓組織を押すことによって脾臓細胞懸濁液を準備します。
5. RPMI 1640 媒体と脾臓細胞懸濁液を洗います。遠心 (1000 × g、10 分、4 ° C) で脾臓細胞を収穫し、その後、上澄みを廃棄します。この洗浄工程を 3 回繰り返します。
6. インキュベーターから栽培し、増幅された骨髄腫細胞を除去し、軽くタップ/シェイク フラスコ細胞懸濁液を取得します。この懸濁液、FBS を削除する 2 回 RPMI 1640 中を洗ってください。
   注: これは、不可欠なステップ FBS 細胞融合に影響を与える可能性があります。
7. セルをカウントし、脾臓細胞と混合する前に濃度を調整します。骨髄腫細胞に対する脾臓細胞の最終的な比率は、1:5、1:10 の間でなければなりません。
8. 脾臓細胞懸濁液および骨髄腫細胞をミックスします。セルの混合物 (1000 × g、10 分、4 ° C) を遠心し、上清を除去します。
9. セルに 50% ポリエチレング リコール (PEG) 溶液の 1 mL を追加し、優しく 1 分の 37 ° C で攪拌します。放置 30 秒。
   注: この手順で使用される止め釘の解決が 50% (w/v) ポリエチレング リコール 1500 を含める必要があります、10% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO) PBS のカルシウム (Ca^{2 +}) なし。
10. おかなければ、反応を終了する 2 分の 2 mL を追加します。別の 1 分に RPMI 1640 媒体の追加 2 mL を追加し、RPMI 1640 媒体の追加 10 mL を追加します。
11. 10 分間 800 x g で細胞を遠心します。上清を廃棄後帽子ソリューションを追加し、セルを育成し続けます。フィーダー層プレートの各ウェルに細胞懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° C、5% CO₂で 7 日間の版を孵化させなさい。
    注: これらの条件下で縮合骨髄腫細胞は死亡し、ハイブリドーマ細胞が HAT 培地で成長を続けるでしょう。7 日後モノクローナルハイブリドーマはポリクローナル ハイブリドーマを含む井戸がセルの複数のクラスターを持っているだけでなく、細胞の 1 つのクラスターとして形成します。
12. 分析の上清を吸引し、HT 媒体に媒体を置き換えます。
    注: する帽子の中に置き換えてください HT 培培地に直接切り替え中最初はハイブリドーマ培養に有害であります。

5. 間接競合 elisa 法 (icELISA)

1. NAR OVA (1 μ g/mL、100 μ L/ウェル) と 96 ウェル プレートをコートし、37 ° c または一晩 4 ° C で 1 時間インキュベート
2. 非特異吸着を防ぐために 37 ° C で 1 時間 GPBS (1 %m/v ゼラチンを含む PBS) の 300 μ L でプレートをブロックします。
3. TPBS (0.05 %v/v トゥイーン 20 を含む PBS) を 3 回洗浄します。
4. 10% メタノール濃度のシリーズに非 NAR を希釈します。井戸を分離するこれらの希釈の 50 μ L を追加します。他の井戸の抗血清またはハイブリドーマ培養上清 (Mab を含む) の 50 μ L を追加します。37 ° C で 1 時間の版を孵化させなさい
5. ペルオキシダーゼ標識抗マウス igg 抗体を各ウェルに 100 μ L を追加し、さらに 1 時間インキュベートします。
6. TPBS に板を 3 回洗浄した後追加基板の解決の 100 μ L (0.1 M クエン酸バッファー (pH 4) 含む 0.015 %v/v H₂O₂と 2 mg/mL 3, 3', 5, 5'-テトラメチル ベンジジン (TMB)) それぞれにも、15 分間インキュベートします。
7. だから 1 M H₂の 50 μ L の追加によって反作用を停止を各ウェル₄ 。
8. 測定吸光度をマイクロ プレート リーダーを使用して 450 nm。さらに準備のため、清にナール抗体の濃度が高い分泌ハイブリドーマを選択します。

6. モノクローナル ハイブリドーマの作製

1. 限界希釈法を使用してモノクローナル ハイブリドーマを準備します。
   1. 選択したハイブリドーマから HT 培地を除去した後 (すなわち、それらはナール抗体の分泌の肯定的な) RPMI 1640 年に細胞を再懸濁します、それらを数えます。
   2. 1 つのセル、2 セル、および 100 μ L RPMI 1640 の 96 ウェル プレートでの井戸あたり 4 細胞の濃度に細胞を希釈します。37 ° c、5% CO₂プレートを孵化させなさい。
   3. 7 ~ 10 日後に、icELISA プロトコル (手順 5) を使用して上清の文化で NAR 抗体を検出します。24 ウェル プレート、25 cm²フラスコおよび耕作のための 75 cm²フラスコにナール抗体陽性ハイブリドーマからセルを転送します。
2. モノクローナル抗体のハイブリドーマを凍結します。
   1. セルを収穫し、チューブを遠心分離機にそれらを転送します。
   2. (800 × g, 10 分) 細胞を遠心分離後上澄みを除去し、凍結中 (RPMI 1640、20% 牛胎児血清 (FCS)、および 10 %dmso) で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を cryotubes に転送します。
   3. -80 ° c 24 時間勾配冷却ボックスに、cryotubes を格納します。長期保存用液体窒素、cryotubes を転送します。

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結果

モノクローナル ハイブリドーマの生成

Hapten-キャリアの複合体分子の重量は、MALDI TOF 質量分析によって確認されました。BSA と NAR の分子量は知られている、BSA を用いた共役分子の数を計算する可能性があります。図 1には、代表的なスペクトル NAR BSA²² m...

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ディスカッション

ここでは、自然製品由来の低分子抗体の巧妙な生産のためのプロトコルを提案する.重要な手順が記載されているし、我々 は例小分子として NAR を使用してこのプロトコルの有用性を示しています。例スペクトル、反応性の解析と icELISA の結果は、代表実験と、このプロトコルを使用して取得コントロール データを表示します。ハイブリドーマの例の画像は、どのような研究者を探していな?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter	FALCON	352340
24 well culture plate	NUNC	119567
25 cm2 Flask	Labserv	310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)	Sigma Aldrich	860336 1G
75 cm2 Flask	Corning	430720
96 well culture plate	NUNC	117246
bovine serum albumin	AMRESCO	332
cell strainer	FALCON	352340
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
cultivator	DRP-9082	Samsung
dialysis membrane (10kDa)	Heng Hui	45-10000D
dimethylsulfoxide	Sinopharm Chemical	DH105-10
electronic balance	BS124-S	Sartorius
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
ethanol, 96%	Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete	Sigma Aldrich	SLBL0210V
Gelatin	AMRESCO	9764-500g
Gradient cooler container	Nalgene	5100-0001
HAT media supplement	Sigma Aldrich	H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
HT media supplement	Sigma Aldrich	H0137-10VL
Inverted Microscope	IX73	Olympus
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
MALDI-TOF-MS	Axima-CFR  plus	Axima
Microplate Reader	BioTex	ELX-800
mouse	Vital River	BALB/c
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG	Sigma Aldrich	RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution	Hyclone	SV30010
Pipette 10 mL	COSTAR	4488
Pipette 25 mL	FALCON	357525
RPMI 1640	Corning	10-040-CVR
skim milk	applygen	P1622
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021