ظهرت مفصص الجزئي: نموذج جراحية لتجديد الكبد مورفولوجك

Summary

نقدم هنا، طريقة جديدة لاستئصال جزئي للفص الكبدي الأيسر في الفئران حديثي الولادة (يوم 0). هذا البروتوكول الجديد مناسبة لدراسة إصابة الكبد الحاد والإصابة وردا في إعداد المواليد.

Abstract

تجديد الجهاز المورفولوجية عقب فقدان الأنسجة الحادة شيوعاً بين الفقاريات أقل، ولكن نادراً ما يلاحظ في الحياة بعد الولادة الثدييات. تجديد الكبد الكبار بعد 70% الجزئية ظهرت النتائج في تضخم تتمثل مع بعض النسخ المتماثل في الفصوص المتبقية مع استعادة النشاط الأيضي، ولكن مع خسارة دائمة للفص المصاب في مورفولوجيا والهندسة المعمارية. هنا، نحن بالتفصيل أسلوب جراحية جديدة في الوليد أن يترك بيئة الفسيولوجية المؤدية إلى التجديد. هذا النموذج يتضمن بتر ابيكس الفص الأيسر ونظام إدارة محافظ لاحقة، ويفتقر إلى ضرورة ربط السفن الكبد الرئيسية أو الإصابة الكيميائية، ترك بيئة الفسيولوجية التي قد تحدث فيها تجديد. أننا نقدم هذا البروتوكول إلى بتر الأطراف في الأحداث (P7-14) الفئران، خلالها التحولات الكبد المتضرر من تجديد الجهاز إلى النمو التعويضي بتضخم. ينص البروتوكول على 30 دقيقة قصيرة وقدم إطارا لدراسة آليات التجديد وتدنيها المرتبطة بالعمر في الثدييات، ووصف الجذعية الكبدية المفترضة أو فروعه.

Introduction

القدرة على إعادة تكوين جهاز، أو لاستعادة الشكل والوظيفة، وقد كان من المعتقد أن يضيع معظمها على مر الزمن التطوري. تم العثور على إمكانات التجدد في الكبد الثدييات الكبار بعد الإصابة الحادة الكيميائية أو الفيزيائية تشمل تعبئة جميع خلايا الكبد المتبقية مما أدى إلى موجات تضخم وجولات قليلة من انقسام الخلية، نتج عنه ولكن الوظيفية الجهاز معماريا مختلفة^1،2،3،،من⁴⁵. في الآونة الأخيرة، بدأت الدراسات لوصف استجابة أجهزة الثدييات الولدان التجديدي للإصابة خلال الأسبوع الأول من الحياة^6،،من⁷⁸. وقد أظهرت هذه الدراسات أن عندما أصيب بجروح أثناء تنمية الأطفال حديثي الولادة، تستجيب بعض أجهزة الثدييات مع التجدد المورفولوجية بدلاً من^7،النمو أو التليف التعويضي⁸.

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تجديد البنية العالمية والدالة يحدث خلال أوائل الفترة الوليدية^6،7،8. تتضمن البروتوكولات المتبعة إصابة الكبد الإصابة الكيميائية أو إدارة الإيثانول^9،،من¹⁰¹¹، أسيتامينوفين^12،،من^1314،15 ، رابع كلوريد الكربون^16،17،،من¹⁸¹⁹، 70% ظهرت الجزئية^4،،من²⁰²¹، أو إزالة لليسار و الفصوص الوسيط. يؤدي إلى موت الخلية تتمثل إدارة المواد الكيميائية، ولكن كثيرا ما يترك هياكل الجزئي والكلى سليمة. تجديد مورفولوجك لا سهولة دراستها في هذا السياق، كما كان عدم طمس بنية الكبد عموما. ظهرت الجزئي 70% ينطوي على ربط خياطة الأوعية الرئيسية، هو أمر ضروري لوقف النزيف، ولكنه يترك بيئة غير الفسيولوجية بالانقطاع الدائم للمفرج. وعلاوة على ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب فقط على القوارض الكبار، وتطبيقه لحديثي الولادة من الناحية التقنية صعبة للغاية. مع هذا في الاعتبار، قمنا بتطوير أسلوب الذي يتم إزالة 20-30 في المائة ذروة الفص الأيسر في ماوس P0 حديثي الولادة (الشكل 1A-1B). هذا الأسلوب هو المحافظ جراحيا، مينيملي، لا من الناحية التقنية الصعبة، ويؤدي إلى إجمالي الخسارة مورفولوجيا دون الربط للمفرج، مما يترك مجالاً للتجديد بحيث تحدث. يسمح البروتوكول خطوة بخطوة الناتجة، المبينة أدناه، لأي باحث لأداء ظهرت مفصص جزئي على الفئران حديثي الولادة من أجل دراسة الثدييات التجدد الولدان في المراحل الأولى من الحياة بعد الولادة. هذا الأسلوب أيضا بتطبيقات واضحة للدراسات المقارنة في الطب التجديدي، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، كما يمكن استخدامه في الكبد خلال المراحل اللاحقة من الحياة.

الدراسات إصابة الكبد الحاد الأكثر شيوعاً هي الأضرار التي يسببها كيميائيا أو بتر الكبد الكبار، أو ظهرت الجزئي 70%. الأضرار الكيميائية غالباً ما ينطوي على الإدارة عن طريق الحقن الوريدي أو داخل الفم من الاسيتامينوفين، ورابع كلوريد الكربون، أو الإيثانول، وهو نموذج إصابة سهلة نسبيا وغير الغازية. كما نوقش سابقا، نتائج الأضرار الكيميائية في موت الخلية تتمثل، ولكن كثيرا ما يترك سدى ولحمة هياكل سليمة، مما يجعل من الصعب تقديم ادعاءات حول تجديد السمات. الأضرار الكيميائية غالباً ما تدور حول الأوعية الكبدية، مما يجعل من تقنية مفيدة لدراسة الموقع وإصابة خلية على حدة، ولكن أيضا يجعل من الصعب على استجواب، على مستوى الجهاز كله، السكان الأخرى التي قد يقع أبعد عن السفن، والتي قد المساهمة في التجديد. وعلى الرغم من هذه القيود، الأضرار الكيميائية لا يزال نموذج إصابة مفيدة وهامة جداً من الناحية الفسيولوجية.

الكبار 70% الجزئية ظهرت ينطوي على إزالة الفصوص اليمين والوسط بعد عملية ربط المفرج الكبد. اتسمت الاستجابة لظهرت أيضا: الكبد المبتورة 14 يوما وظيفة جزئية 70% ظهرت يطور بنية مختلفة صارخ عن الفص غير التالفة الأصلي، كخلايا الكبد الفصوص الحق وكودات المتبقية الخضوع لتضخم وبضع جولات من انقسام الخلية^4،5. هذا يجعل الكتلة المفقودة ووظيفة، ولكن فشل لتجديد الفصوص المبتورة اثنين، ولذلك لا يحل محل مورفولوجيا الإجمالي. نتيجة لذلك الاستجابة الإصابة إلى 70% ظهرت جزئية مفيدة لدراسة آليات النمو التعويضي مع التجديد محدودة.

هنا، نحن تماما وصف بروتوكول لظهرت مفصص جزئي الأطفال حديثي الولادة. ويشمل الإجراء اختيار الحيوان المناسب والتحضير وإعداد الحقل الجراحي والجراحة والانتعاش. التحسين والتكيف لكل خطوة من هذه الخطوات قد تكون مطلوبة من أجل تطبيقات مختلفة للبروتوكول.

لدينا يقوم على نطاق واسع والأمثل هذا البروتوكول في البرية نوع C57BL/6J الجراء (جاكس 000664)، ومع ذلك، لدراسة آليات التجدد والسكان خلية مختلفة، كنا أيضا مختلف الحيوانات المحورة وراثيا بما في ذلك الفئران التي تأوي العرقية المختلفة و CreERT2 المتسلسلات و/أو تدق الوظائف الإضافية (جاكسAxin2^CreERT2 018867، وجاكس Sox9^CreERT2 018829) في تركيبة مع الصحفيين الفلورية، مثل نظم قوس قزح ومتمج (R26^VT2/GK3، R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}-وجدنا لا حاجة لتغيير هذه المنهجية لسلالات مختلفة من الماوس، كما لم يلاحظ أي اختلاف في نتائج البقاء على قيد الحياة أو إمكانات التجدد.

بالإضافة إلى استخدام سلالات حيوانية مختلفة، أجرينا أيضا هيباتيكتوميس مفصص الجزئي على الفئران حديثي الولادة تعامل مع جزيئات صغيرة، مثل 4-هيدروكسي-تاموكسيفين و 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو). الإيثانول وثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) استخدمت كمذيبات، حيث تبين أن زيت الذرة كان سببا مهما للإصابة بالأمراض. وإلا وجدنا أن الإدارة داخل جزيئات صغيرة لا تؤثر على نتائج التجدد أو البقاء على قيد الحياة. ونتنبأ بأن هذا البروتوكول سيتم تكييف للاستخدام مع جزيئات أخرى صغيرة استجواب مختلف جوانب التجديد.

يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية والعمليات الجراحية الماوس الولدان وقد تتطلب خبرة خاصة في التعامل مع الحيوانات والتشريح المجهري. خبرة تربية الحيوان ضروري لتجنب الأم أكل لحوم البشر بعد الجراحة، وخلال فترة الانتعاش الفوري.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات طبقاً للمبادئ التوجيهية التي وضعتها الرابطة للتقييم والاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية الدولية (آآلاك) وجامعة ستانفورد الفريق الإداري في "الحيوانات المختبرية" الرعاية (أبلاك)، (رقم بروتوكول #10266) وفي الولايات المتحدة، أو قانون رعاية الحيوان الأوروبية، التوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي. البروتوكول أقرته لجنة "أخلاقيات التجارب الحيوانية" من "حكومة بافاريا"، ألمانيا، وحصل على إذن لا: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1-إعداد الحيوان

1. إعداد أقفاص فارغة مع الأسرة المناسبة على لوحة تدفئة.
2. قبل لمس الحيوانات مع القفازات، فرك الأسرة الأم على القفازات.
3. إزالة جميع الجراء من أمهم ومكان في قفص فارغ. قم بإزالة بعض من الأسرة الأم ووضعه في قفص فارغ مع الجراء.
4. تضع الأم في قفص منفصل ونظيفة وجافة بعيداً عن ميدان العمليات الجراحية.
5. ارتداء قفازات معقمة نظيفة وجديدة قبل إعداد الحقل الجراحي.

2-إعداد الميدان الجراحي

1. استخدام ماصة 10 مل، إضافة 10 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS) إلى طبق بتري 10 سم.
2. "الماصة؛" 2 مل من محلول المضادة الصرف الصحي، تدين أو ما يعادلها، في طبق بتري 10 سم.
3. ضع نطاق تشريح في مجال الجراحة. بدوره على تشريح مصباح نطاق وضبط مستوى الضوء للراحة للجراح. يمكن وضع جرو في مجال الجراحة تحت مصباح نطاق تشريح. يمكن تأكيد الضوء الكافي بسبب غياب الظلال على السطح البطني ألجرو.
4. إعداد قاعة التخدير إيسوفلوراني (انظر الجدول للمواد) مع مخروط الآنف. يجب تنظيف الدائرة بدون أدلة من البول أو البراز. وضع مخروط الآنف والأنابيب المرتبطة بها ضمن نطاق تشريح في مجال الجراحة. تحويل تدفق الأكسجين و isoflurane لمخروط الآنف فقط.
5. تعد منطقة التعافي بعد العمليات الجراحية بوسادة تدفئة في حوالي 37 درجة مئوية. الانتعاش بعد العمليات الجراحية يتكون من 4 قطع من الشاش وضعت على رأس لوحة تدفئة. إذا كان ذلك ممكناً، فرك منصات شاش في الفراش والبراز والبول للحفاظ على رائحة الأم الأم.
   ملاحظة: أنها غير حكيمة لاستخدام مصباح حرارة، وهذا يجعل من الصعب التحكم في درجة الحرارة. سيؤدي إلى درجات حرارة مرتفعة في موت الفئران حديثي الولادة.
6. تحضير وتعقيم جميع الأدوات الجراحية مع اﻷوتوكﻻف. وتشمل الأدوات اللازمة: مقص تشريح الصغرى وملقط تشريح الصغرى وشاش، هيموستات وأي خياطة غير الامتصاص شعيرات 6-0. يمكن أن تكون الأدوات الجراحية ريستيريلزيد مع أي معقم حبة الزجاج.

3-الجزئية ظهرت مفصص

1. تخدير ألجرو بوضعه في مخروط الآنف على بالعودة لطف تسجيل به القدمين واليدين في المكان. ينبغي أن يكون تلقي ألجرو isoflurane 5% في الأوكسجين.
   1. تسمح ألجرو للجلوس لمدة 5 دقائق، أو حتى على نحو كاف تخديره، التي يمكن التحقق منها باختبار قرصه أخمص القدمين.
   2. حقن 5 ملغ/كغ والايبوبروفين تحت الجلد قبل شق.
      ملاحظة: عملية جراحية كاملة ينبغي إلا يستغرق الأمر أكثر مما يمكن ملاحظة النتائج الأكثر فقراً 30 دقيقة في حديثي الولادة التي تحت التخدير العام لأكثر من 30 دقيقة. اتخاذ الاحتياطات اللازمة للتقليل من طول الجراحة عن طريق إعداد الحقل دقيق وترطيب الجلد قبل الإغلاق للتقليل من الدموع خياطة الجروح الناجمة عن الجلد.
2. نظيفة بلطف من جدار البطن الخلفي مع وسادة صغيرة من شاش الرطب مع تدين. السماح بتدين لتجف لمدة 1 دقيقة.
3. جعل شق الأيسر منتصف العضدي 0.5 سم أسفل القفص الصدري مباشرة مع تشريح الصغير مقص وملقط. فصل الجلد باستخدام الملقط بلطف وجعل شق ثان أكثر عمقاً في التجويف الصفاقى (انظر الشكل 1، اليسار والوسط)
4. تطبيق الضغط الأفقي بلطف من كلا الجانبين من البطن استخدام مرة أخرى، نهايات حادة مقص وملقط تشريح الجزئي لقوة تتويجا للفص الأيسر من التجويف الصفاقى. يجب أن تكون قمة اليسار من الفص الأيسر بسهولة تصور (الشكل 1، حق).
5. من ذروة، بتر وتزن كمية الأنسجة المراد إزالتها.
   1. برفق باستخدام مقص التشريح الجزئي، بتر المبلغ المطلوب من الأنسجة من قمة الفص الأيسر.
   2. ضع الأنسجة المبتورة في أنبوب 1.5 مل مليئة ببرنامج تلفزيوني. وزن الأنسجة المبتورة استخدام رصيد التحليلي (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: ضع قطعة من الشاش أو الورق على التوازن وتغليف ذلك. ثم وضع الأنسجة المبتورة على الشاش أو الورق وقياس كتلته.
   3. إصلاح منطقة المبتورة في بارافورمالدهيد 2% في درجة حرارة الغرفة ح 1 ومكان في قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مجمع على الثلج الجاف لتحليل القسم المجمد. تحليل الأجزاء المجمدة بقطع 7-10 ميكرون أقسام استخدام أي كريوستات القياسية.
6. برفق باستخدام قطعة تدحرجت من الشاش، استبدال الفص الأيسر في التجويف الصفاقى. ترك الشاش في التجويف حتى يتوقف النزف.
7. إزالة الشاش والرطب الموقع الجراحي والمنطقة المحيطة بها مع شاش غارقة ببرنامج تلفزيوني.
8. إغلاق موقع الجراحية مع شعيرات 6-0، خيوط غير الامتصاص مع غرزة على التوالي. يجب إغلاق الصفاق والجلد بشكل منفصل.
   ملاحظة: ترطيب الجلد بلطف مع شاش غارقة ببرنامج تلفزيوني قد تقليل الدموع خياطة الجروح التي يسببها.
9. بلطف ولكن دقة تنظيف ألجرو مع شاش غارقة ببرنامج تلفزيوني وضمان لا بقايا الدم أو تدين. لفة وسادة شاش غارقة وفرك بلطف فوق علامة الجرح لتنظيف قبالة أي الدم أو تدين.
   ملاحظة: هذا أهمية خاصة كالأم قد تفكيك الجراء إذا يتم تنظيفها غير كافية.
10. إزالة ألجرو من مخروط الآنف ووضعه في مجال استرداد يتضمن منصات شاش مكشوف للبول والبراز للأم. استبدال حالما يسترد ألجرو، ألجرو في قفص فارغ مع الأسرة الأم.
    ملاحظة: لا تستخدم مصباح حرارة. يمكن أن يسبب استخدام مصباح الحرارة الوليد إفراط.
11. تكرار الإجراء على العدد المطلوب من الجراء. على الرغم من أن يمكن استخدام جميع الجراء، فمن المستحسن عموما ترك بعض الجراء لا تعمل على استبدال جنبا إلى جنب مع الجراء تعمل.
12. استبدال جميع الجراء في نفس الوقت مع الأسرة الأم في قفص الأم.

4-استعادة وتحليل

1. متابعة في الفئران يوميا.
   1. تحقق من أن الجرح لا تزال مغلقة وإزالة أي الجراء الميت، إذا كان موجوداً.
   2. إذا فتح الجرح، تعد منطقة الموقع والإنعاش الجراحي كما سبق وصفه، وكرر الخطوات من 3.8 إلى 3.12.
   3. حقن 5 ملغ/كغ كاربوفين تحت الجلد 24 و 48 ساعة في الإجراء التالي.
   4. اتبع الجراء لمدة 56 يوما أو أكثر.
2. Euthanize الحيوانات بعد المبلغ المطلوب من أيام بعد العمليات الجراحية بالتعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون (CO₂) والتفكك عنق الرحم.
   1. وضع الفئران في استحثاث/دائرة القتل الرحيم وتشغيل CO₂ حتى الفئران توقف التنفس.
   2. ضمان القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. دفع إلى الأسفل على الرقبة الظهرية من الماوس باستخدام إصبع الصدارة والإبهام واستخدام اليد الأخرى، سحب الذيل.
3. إزالة أكمله الكبد كتلة وتزن عليه.
   1. فصل كل الفص وتزن كل على حدة بعناية.
      ملاحظة: إزالة الكبد بتشريح دقيق من السفن الحجاب الحاجز والكبد وبوابة. فصل الفصوص عن بعضها البعض بعناية تشريح كل فلقة في تمسكه الدانية.
4. تحديد مدى التجديد عن طريق مقارنة كتلة الفص الأيسر المبتورة إلى كتلة الكبد كله. فص الأيسر يصب هو حوالي 30% الكبد كله.

النتائج

تفاصيل الشكل 1A زمني عام الولدان ظهرت مفصص الجزئي (التخطيطي في الشكل 1B)، والطول المتوقع لوقت الانتظار حتى يتم ملاحظة التجديد. ويمكن تجديد خفية من الفص الأيسر الملاحظة 7-14 يوما بعد الجراحة. وكثيراً ما لوحظ التجديد الكامل بعد 56 يوما بعد الجراح...

Discussion

إصابة الكبد الحاد تقليديا ودرست استخدام المادة الكيميائية (أسيتامينوفين، الإيثانول، ورابع كلوريد الكربون)، أو نماذج الجراحية (70% ظهرت الجزئي). قد اتسم رد التجدد بعد 70% ظهرت جزئية إشراك تضخم تتمثل العالمية وجولات متعددة من انقسام الخلية^4،5. لوقف النزف، هذا ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730