Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Resumo

Aqui, apresentamos um novo método para ressecção parcial do lobo esquerdo hepático em camundongos neonatais (dia 0). Este novo protocolo é apropriado para estudar a resposta de lesão no cenário neonatal e lesão hepática aguda.

Resumo

Regeneração morfológica do órgão após perda de tecido aguda é comum entre vertebrados inferiores, mas é raramente observada em mamíferos vida pós-natal. Regeneração hepática adulta após hepatectomy parcial 70% resulta em hipertrofia do hepatócito com alguns replicação em lóbulos remanescentes com a restauração da atividade metabólica, mas com perda permanente de lóbulo ferido morfologia e arquitetura. Aqui, detalhamos um novo método cirúrgico no recém-nascido que deixa um ambiente fisiológico conducente à regeneração. Este modelo envolve a amputação do ápice do lobo esquerdo e um regime de tratamento conservador subsequentes e não possui a necessidade de ligadura dos vasos sanguíneos do fígado ou lesão química, deixando um ambiente fisiológico onde regeneração pode ocorrer. Estendemos este protocolo para amputações no juvenis ratos (P7-14), durante o qual o fígado lesionado transita de regeneração do órgão para crescimento compensatório por hipertrofia. O protocolo apresentado, breve 30 min fornece uma estrutura para estudar os mecanismos de regeneração, seu declínio idade-associadas em mamíferos e a caracterização dos putativo hepático tronco ou progenitoras.

Introdução

A capacidade de regenerar um órgão, ou para restaurar a forma e função, foi pensada para ser principalmente perdido ao longo do tempo evolutivo. O potencial regenerativo do fígado dos mamíferos adulto após lesão aguda de química ou física foi encontrado para envolver a mobilização de todos os hepatócitos restantes, resultando em ondas de hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular, resultando em um funcional, mas arquitetonicamente diferente órgão^1,2,3,4,5. Recentemente, estudos começaram a caracterizar a resposta regenerativa dos órgãos de mamíferos neonatais a lesão na primeira semana de vida^6,7,8. Estes estudos têm mostrado que, quando feridos durante o desenvolvimento neonatal, certos órgãos de mamíferos respondem com regeneração morfológica em vez de compensação crescimento ou fibrose^7,8.

Estudos recentes demonstraram que a regeneração da estrutura global e a função ocorre durante o início período neonatal^6,7,8. Lesão hepática estabelecidos protocolos envolvem lesão química ou administração de etanol^9,10,11, paracetamol^12,13,14,15 , tetracloreto de carbono^16,17,18,19, 70% hepatectomy parcial^4,20,21ou remoção da esquerda e lóbulos medianos. Administração química leva à morte de células do hepatócito, mas muitas vezes deixa o micro e macroestruturas intactas. Regeneração morfológica não pode prontamente ser estudada neste contexto, como a arquitetura hepática em geral não se extinguiu. A hepatectomy parcial 70% envolve a ligadura da sutura dos vasos grandes, que é necessária para parar o sangramento, mas deixa um ambiente não-fisiológica com interrupção permanente da vasculatura. Além disso, esse método só tem sido utilizado em roedores adultos, e sua aplicação para neonatos tecnicamente é extremamente difícil. Com isto em mente, desenvolvemos um método em que 20-30% do ápice do lobo esquerdo é removido em um recém-nascido mouse P0 (figura 1A-1B). Este método é cirurgicamente conservador, minimamente invasivo, não tecnicamente desafiador e leva à perda da morfologia sem a ligadura da vasculatura, deixando espaço para a regeneração ocorra de efectivação. O protocolo resultante do passo a passo, descrito abaixo, permite a qualquer pesquisador realizar uma hepatectomy parcial lobular em ratos neonatais para estudar mamíferos regeneração neonatal nas fases iniciais de vida pós-natal. Esse método também tem aplicações claras para estudos comparativos em medicina regenerativa e biologia de células-tronco, como ele pode ser usado no fígado durante as fases posteriores da vida.

Os estudos mais comuns de lesão hepática aguda são quimicamente induzida dano, amputação de fígado adulta ou hepatectomy parcial de 70%. Dano químico muitas vezes envolve a administração intravenosa, intraperitoneal ou oral de paracetamol, tetracloreto de carbono ou etanol e é um modelo de lesão relativamente fácil e não-invasiva. Como já discutido, resultados de dano químico na morte de celular do hepatócito, mas muitas vezes folhas estroma e parênquima estruturas intactas, tornando-se difícil fazer afirmações sobre regeneração morfológica. Dano químico muitas vezes gira em torno dos vasos hepáticos, tornando-se uma técnica útil para estudar o local e a lesão de células específicas, mas também dificulta a interrogar, no nível do órgão inteiro, outras populações que pode situar-se longe dos navios e que podem contribui para a regeneração. Apesar dessas limitações, dano químico continua a ser um modelo de lesão altamente fisiologicamente relevantes e úteis.

Adulto hepatectomy parcial de 70% envolve a remoção dos lobos esquerdos e medianos após ligadura da vascularização hepática. A resposta a hepatectomy tem sido bem caracterizada: o fígado amputado 14 dias pós 70% hepatectomy parcial desenvolve uma arquitetura grosseiramente diferente do lobo original intacto, como os hepatócitos dos lobos direito e caudados restantes submeter-se hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular^4,5. Isto torna-se massa perdida e função, mas falha regenerar os dois lobos amputados e, portanto, não substitui a morfologia bruta. Como resultado, a resposta da lesão a hepatectomy parcial 70% é útil para estudar os mecanismos de crescimento compensatório com regeneração limitada.

Aqui, descrevemos totalmente um protocolo para um hepatectomy lobular parcial neonatal. O procedimento envolve a seleção apropriada de animais e preparação, preparação do campo cirúrgico, cirurgia e recuperação. Otimização e adaptação de cada uma dessas etapas podem ser necessárias para diferentes aplicações do protocolo.

Temos amplamente realizada e otimizado este protocolo sobre filhotes de C57BL/6J de tipo selvagem (JAX 000664), no entanto, para estudar populações de células diferentes e mecanismos de regeneração, também usamos vários animais transgénicos, incluindo ratos, abrigando diversos Cre e CreERT2 transgenes e/ou bater-ins (JAXAxin2^CreERT2 018867, e Sox9^CreERT2 JAX 018829) em combinação com repórteres fluorescentes, tais como sistemas de arco-íris e mTmG (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. não encontramos nenhuma necessidade de mudar esta metodologia para as estirpes de mouse diferente, como não nos resultados de sobrevivência ou potencial regenerativo foram observadas diferenças.

Além de usar diferentes estirpes animais, realizamos também parcial hepatectomies lobular em neonatais ratos tratados com pequenas moléculas, tais como 4-hidroxi-tamoxifeno e 5-ethynyl-2-desoxiuridina (EdU). Dimetilsulfóxido (DMSO) e etanol foram usados como solventes, como verificou que o óleo de milho era uma importante causa de morbidade. Caso contrário encontramos que a administração intraperitoneal de pequenas moléculas não afetou sobrevivência ou resultados regenerativos. Podemos prever que o presente protocolo será adaptado para uso com outras moléculas pequenas para interrogar os vários aspectos da regeneração.

Cirurgias de rato neonatal podem ser tecnicamente desafiadoras e podem exigir conhecimentos especiais na manipulação de animais e de dissecação microscópica. Experiência de criação de animais é necessária para evitar o canibalismo materno após a cirurgia e durante o período de recuperação imediata.

Protocolo

Todos os animais foram realizados experimentos em estrita conformidade com as directrizes estabelecidas pela Associação de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta internacional (AAALAC) e da Universidade de Stanford painel administrativo em animais de laboratório Cuidados (APLAC), (número de protocolo #10266) e nos Estados Unidos, ou o Europeu Animal Welfare Act, Directiva 2010/63/UE. O protocolo foi aprovado pelo Comité de ética de experimentos Animal do governo da Baviera, Alemanha e recebeu a permissão não: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. preparação animal

1. Prepare uma gaiola vazia com roupa de cama adequada sobre uma almofada de aquecimento.
2. Antes de tocar os animais com luvas, esfrega da cama da mãe para as luvas.
3. Remova todos os filhotes da sua mãe e coloque na gaiola vazia. Remover algumas das roupas de cama da mãe e colocá-lo na gaiola vazia com os filhotes.
4. Coloca a mãe em uma gaiola separada, limpa e seca, longe do campo cirúrgico.
5. Don luvas novas, limpo, estéril antes da preparação do campo cirúrgico.

2. preparação do campo cirúrgico

1. Utilizando uma pipeta de 10 mL, adicione 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS) para um prato de Petri de 10 cm.
2. Pipete 2 mL da solução de antiséptica betadine ou equivalente na prato de Petri de 10cm.
3. Coloque um escopo dissecação no campo cirúrgico. Ligue dissecando lâmpada de escopo e ajustar o nível de luz para conforto do cirurgião. Um filhote pode ser colocado no campo cirúrgico sob a lâmpada de escopo a dissecação. Luz adequada pode ser confirmada pela ausência de sombras na superfície ventral do filhote.
4. Preparar a câmara de anestesia de isoflurano (ver Tabela de materiais) com um cone de nariz. A câmara deve ser limpa sem evidências de urina ou fezes. Coloque o cone de nariz e tubagem associada no âmbito dissecação no campo cirúrgico. Desvie o fluxo de oxigênio e isoflurano exclusivamente para o cone de nariz.
5. Preparar uma área de recuperação pós-operatória com uma almofada de aquecimento, situado a aproximadamente 37 ° C. A recuperação pós-operatória deve consistir em 4 pedaços de gaze colocada em cima da almofada de aquecimento. Se possível, esfrega a gaze no fundamento, fezes e urina para conservar o perfume da mãe da mãe.
   Nota: É aconselhável usar uma lâmpada de calor, como isso torna difícil controlar a temperatura. Temperaturas elevadas resultará na morte de camundongos neonatais.
6. Preparar e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com uma autoclave. As ferramentas necessárias incluem: microdissecando tesouras, pinças microdissecando, gaze, pinça hemostática e qualquer sutura não absorvível de monofilamento de 6-0. Instrumentos cirúrgicos podem ser reesterilizados em com qualquer esterilizador de grânulo de vidro.

3. parcial Hepatectomy Lobular

1. Anestesia o filhote, colocando-o no nariz cone em sua volta e suavemente a gravar seus pés e mãos no lugar. O filhote deve receber 5% de isoflurano em oxigênio.
   1. Permitir que o filhote se sentar por 5 min ou até devidamente anestesiado, que pode ser verificado por um teste do beliscão do dedo do pé.
   2. Injete 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea, antes da incisão.
      Nota: A cirurgia toda deveria ser não mais do que 30 min. resultados mais pobres podem ser observados em recém-nascidos que estão sob anestesia geral para mais de 30 min. Tome precauções para minimizar a duração da cirurgia através da preparação de campo minuciosa e umectação da pele antes da sutura para minimizar a sutura induzida pele lágrimas.
2. Limpe suavemente a parede abdominal posterior com uma pequena gaze molhada com betadine. Permitir que o betadine secar por 1 min.
3. Faça uma incisão de esquerdo médio-clavicular 0,5 cm imediatamente abaixo da caixa torácica com o microdissecando tesoura e pinça. Delicadamente, separar a pele usando fórceps e efectue uma segunda incisão mais profunda na cavidade peritoneal (ver Figura 1, esquerda e centro)
4. Aplica suavemente a pressão lateral de ambos os lados do abdome usando as costas, extremidades sem corte da tesoura e pinça microdissecando para forçar o ápice do lobo esquerdo fora da cavidade peritoneal. O ápice esquerdo do lobo esquerdo deve ser facilmente visualizado (Figura 1, direito).
5. Partir do ápice, amputar e pesar a quantidade de tecido a ser removido.
   1. Usando a tesoura de micro-dissecção, delicadamente ampute a quantidade desejada de tecido a partir do ápice do lobo esquerdo.
   2. Cheio o tecido amputado em um tubo de 1,5 mL de PBS. Pesar o tecido amputado usando uma balança analítica (ver Tabela de materiais).
      Nota: Coloque um pedaço de gaze ou papel sobre a balança e tare-lo. Depois, coloque o tecido amputado na gaze ou papel e medir sua massa.
   3. Corrigi a área amputada em 2% paraformaldeído na temperatura ambiente durante 1 h e lugar no ideal da temperatura de corte (OCT) composto sobre gelo seco para análise de biópsia. Analise seções congeladas por corte 7-10 µm as seções usando qualquer padrão criostato.
6. Usando um pedaço de laminado de gaze, delicadamente substitua o lobo esquerdo na cavidade peritoneal. Deixe a gaze na cavidade até o sangramento parar.
7. Retire a gaze e molhar o local cirúrgico e a área circundante com gaze embebida com PBS.
8. Feche o local cirúrgico com monofilamento de 6-0, suturas não absorvíveis com um corrido. O peritônio e a pele devem ser fechadas separadamente.
   Nota: Molhar suavemente a pele com gaze embebida com PBS pode minimizar as lágrimas de sutura induzida.
9. Delicadamente mas completamente limpa o filhote com gaze embebida com PBS e garantir que não há restos de sangue ou betadine. Rolo da gaze embebida e esfregue suavemente sobre o sinal de ferida para limpar qualquer sangue ou betadine.
   Nota: Isto é especialmente importante como a mãe pode canibalizar os filhotes, se são limpos inadequadamente.
10. Retire o filhote do cone do nariz e coloque-o sobre a área de recuperação que inclui a gaze exposta a fezes e urina da mãe. Uma vez que o filhote se recupera, substitua o filhote na gaiola vazia com roupa de cama da mãe.
    Nota: Não utilize uma lâmpada de calor. O uso de uma lâmpada de calor pode causar o neonato a superaquecer.
11. Repita o procedimento para o número desejado de filhotes. Embora todos os filhotes podem ser usados, é geralmente aconselhável deixar alguns filhotes não operadas a ser substituído junto com os filhotes operados.
12. Substitua todos os filhotes simultaneamente com roupa de cama da sua mãe na gaiola da mãe.

4. recuperação e análise

1. Acompanhar diariamente nos ratos.
   1. Verifique que a ferida permanece fechada e remova qualquer filhotes mortos, se houver.
   2. Se reabre a ferida, prepare a área local e recuperação cirúrgica como anteriormente descritas e repita as etapas 3.8 a 3.12.
   3. Injete 5 mg/kg de carpofen por via subcutânea de 24 e 48 h após o procedimento.
   4. Acompanhar os filhotes para 56 dias ou mais.
2. Eutanásia dos animais após a quantidade desejada de dias pós-operatórios por exposição de dióxido de carbono (CO₂) e deslocamento cervical.
   1. Coloque os ratos na indução / câmara de eutanásia e ativar o CO₂ até ratos param de respirar.
   2. Certifique-se de eutanásia por deslocamento cervical. Empurre para baixo no pescoço dorsal do mouse usando o fore-dedo e o polegar e usando a outra mão, puxe para baixo na cauda.
3. Remover o todo fígado em bloco e pesá-lo.
   1. Com cuidado, separe cada lóbulo e pesar separadamente.
      Nota: Remova o fígado por dissecção cuidadosa dos vasos diafragma e hepática e portal. Separe os lóbulos do outro por dissecar cuidadosamente cada lóbulo na sua fixação proximal.
4. Determine a extensão da regeneração, comparando a massa do lobo esquerdo amputado à massa do fígado inteiro. Um lobo esquerdo ileso é aproximadamente 30% do fígado inteiro.

Resultados

Figura 1A detalha um cronograma geral da hepatectomy lobular parcial neonatal (esquemática na figura 1B) e a duração prevista do tempo de espera até a regeneração é observada. Regeneração sutil do lobo esquerdo pode ser observada 7-14 dias pós-cirurgia. Regeneração total observou-se muitas vezes após 56 dias pós cirurgia. Os ratos devem não mostra sinais de anormalidade fisiológica após a cirurgia.

Discussão

Lesão hepática aguda tem sido tradicionalmente estudado usando química (paracetamol, etanol, tetracloreto de carbono), ou modelos cirúrgicos (70% hepatectomy parcial). A resposta regenerativa após hepatectomy parcial 70% tem sido caracterizada a participação global hepatócito hipertrofia e várias rodadas de divisão celular^4,5. Para parar a hemorragia, no entanto, este modelo é limitado, como os principais vasos devem ser ligados, deixando um ambiente a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730