Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה חדשה עבור כריתה חלקית של האונה השמאלית הכבד בעכברים neonatal (יום 0). פרוטוקול חדש זה מתאים ללמוד פציעת כבד חריפה ותגובה פציעה בהגדרת neonatal.

Abstract

התחדשות האיברים מורפולוגי בעקבות איבוד רקמות חריפה נפוצה בקרב בעלי חוליות נמוכים יותר, אבל הוא לעיתים נדירות בחיי כמחנכת יונקים. למבוגרים התחדשות הכבד לאחר 70% hepatectomy חלקית תוצאות היפרטרופיה hepatocyte עם כמה שכפול באונות הנותרים שיקום של פעילות חילוף החומרים, אבל עם אובדן קבוע של אדריכלות ומורפולוגיה של האונה פצועים. כאן, אנו מפרטים שיטה כירורגית חדשה ב neonate זה משאיר סביבה הפיזיולוגיות להצטיינות התחדשות. מודל זה כולל כריתה של האונה השמאלית השיא, משטר ניהול שמרנית עוקבות, חסרה את הצורך מצדו של כלי כבד הגדולות או פגיעה כימית, עוזב סביבה הפיזיולוגיות בו התחדשות עלולה להתרחש. אנו להרחיב את פרוטוקול זה כדי כריתות על ילדותי עכברים (P7-14), שבמהלכו הכבד נפגע המעברים של התחדשות האיברים לצמיחה לפיצוי על ידי היפרטרופיה. פרוטוקול שהוצגו, קצר 30 דקות מספק מסגרת כדי ללמוד על מנגנוני התחדשות שלה ירידה גיל-הקשורים ביונקים, אפיון בשם גזע כבדית או אבות.

Introduction

כבר חשבה את היכולת להתחדש איבר, או לשחזר צורה ותפקוד, ללכת לאיבוד בעיקר לאורך זמן אבולוציונית. פוטנציאל הרגנרציה של הכבד יונקים בוגרים לאחר פגיעה חריפה כימיים או פיזיים נמצאה לערב גיוס כל hepatocytes הנותרים וכתוצאה מכך גלים של היפרטרופיה כמה סיבובים של חלוקת התא, וכתוצאה מכך אך פונקציונלי איברים שונים מבחינה ארכיטקטונית^1,2,3,4,5. לאחרונה, מחקרים החלו לאפיין את התגובה הרגנרציה של איברים יונקים neonatal לפגיעה בתוך השבוע הראשון של החיים-^6,-^7,-⁸. מחקרים אלה הראו כי כאשר נפגע במהלך הפיתוח neonatal, איברים יונקים מסוימים להגיב עם התחדשות מורפולוגי במקום לתת פיצוי הצמיחה או פיברוזיס^7,8.

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חידוש עולמי מבנה ותפקוד מתרחשת במהלך^7,התקופה neonatal^6,מוקדמת⁸. פגיעה בכבד הוקמה פרוטוקולים כרוכה פגיעה כימית או מנהלה של אתנול^9,10,11, פרצטמול^12,13,14,15 , tetrachloride פחמן^16,17,18,19, 70% hepatectomy חלקי^4,20,21או הסרה של השמאל, אונות החציוני. ניהול כימי מובילה למוות תא hepatocyte, אבל לעתים קרובות משאיר מיקרו-מאקרו-מבנים שלמים. התחדשות מורפולוגיות לא יכול להילמד ברצון בהקשר זה, כפי הארכיטקטורה הכוללת הכבד לא יצורים שנכחדו. Hepatectomy חלקית 70% כרוך מצדו בתפר של כלי מרכזי, אשר יש צורך לעצור את הדימום, אבל משאיר סביבה שאינם הפיזיולוגיות עם הפרעה קבועה של להערכת. יתר על כן, שיטה זו שימש רק על מכרסמים למבוגרים, היישום שלה כדי neonates טכנית קשה מאוד. עם זאת, פיתחנו שיטת עבודה שבו יוסר 20-30% השיא של האונה השמאלית של עכבר P0 היילוד (איור 1A-1B). שיטה זו בניתוח השמרני, פולשנית, לא באופן טכני מאתגר, ומוביל ברוטו אובדן של מורפולוגיה בלי מצדו של להערכת, השארת מקום התחדשות להתרחש. פרוטוקול צעד אחר צעד וכתוצאה מכך, המתוארים להלן, מאפשרת לכל חוקר לביצוע של hepatectomy lobular חלקית על עכברים neonatal ללימוד בתרבית של התחדשות neonatal בשלבים המוקדמים של החיים אחרי לידה. בשיטה זו יש גם יישומים ברורים השוואתי רפואה רגנרטיבית וביולוגיה תאי גזע, זה יכול לשמש בכבד במהלך ובשלבים מאוחרים יותר של החיים.

המחקרים פציעת כבד חריפה הנפוצים ביותר הם נזק בהשפעת כימיקלים, קטיעה הכבד למבוגרים או 70% hepatectomy חלקית. נזק כימי לעתים קרובות כרוך הניהול תוך ורידי, בקרום הבטן או אוראלי של פרצטמול, tetrachloride פחמן או אתנול, מודל פגיעה קלה יחסית, לא פולשנית. כפי שכבר שוחחנו, גורמת נזק כימי מוות של תאים hepatocyte, אבל לעתים קרובות עלים משתית parenchyma מבנים שלמים, ומקשה על טענות על התחדשות מורפולוגיות. נזק כימי לעיתים קרובות מרכזי על כלי הכבד, שהופך אותו טכניקה שימושית ללמוד באתר תא ספציפי פציעה, אבל גם מקשה לחקור, ברמת כל האיבר, אוכלוסיות אחרות זה יכול להיות ממוקם רחוק יותר מכלי, זה ייתכן לתרום התחדשות. למרות מגבלות אלו, נזק כימי נשאר עדיין מודל שימושי ורלוונטי מאוד מבחינה פיזיולוגית פציעה.

למבוגרים 70% hepatectomy חלקית כרוכה הסרת האונות החציוני ושמאלה בעקבות מצדו של להערכת הכבד. מאפיין היטב בתגובה hepatectomy: הכבד הקטוע 14 ימים פוסט 70% hepatectomy חלקית מפתחת ארכיטקטורת בגסות שונה מזו של האונה ניזוק המקורי, כמו hepatocytes של האונות המזונבת וימינה הנותרים עוברים היפרטרופיה, כמה. סיבובים של חלוקת התא^4,5. זה מפצה לאיבוד מסת ותפקוד, אך נכשל להתחדש שתי האונות הקטוע, ולכן אינו מהווה תחליף מורפולוגיה ברוטו. כתוצאה מכך, התגובה פציעה hepatectomy חלקי 70% שימושי ללמוד מנגנוני פיצוי צמיחה התחדשות מוגבלת.

כאן, באופן מלא נתאר עבור hepatectomy lobular חלקית neonatal פרוטוקול. ההליך כרוך הבחירה בעלי חיים המתאים, הכנה, הכנה דימומים, ניתוח ושחזור. אופטימיזציה והתאמה של כל אחד מהצעדים הללו ייתכן שתידרש עבור יישומים שונים של הפרוטוקול.

לנו יש בהרחבה לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה פראי סוג C57BL/6J הגורים (ג'אקס 000664), לעומת זאת, במחקר אוכלוסיות תאים שונים ומנגנונים של התחדשות, השתמשנו גם חיות הטרנסגניים שונות לרבות עכברים מחסה Cre שונים, CreERT2 transgenes ו/או טוק-in (ג'אקסAxin2^CreERT2 018867, ו Sox9^CreERT2 ג'אקס 018829) בשילוב עם כתבים פלורסנט, כגון מערכות הקשת ו- mTmG (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. מצאנו אין צורך לשנות מתודולוגיה זו עבור זנים העכבר שונים, כאשר אין הבדלים תוצאות ההישרדות או פוטנציאל הרגנרציה נצפו.

בנוסף לשימוש זנים בעלי חיים שונים, אנחנו גם לבצע hepatectomies lobular חלקית על neonatal עכברים שטופלו מולקולות קטנות, כגון 4-הידרוקסי-טמוקסיפן ו- 5-ethynyl-2 ′-deoxyuridine (אדו). דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ואתנול שימשו ממיסים, כפי נמצא שכי שמן תירס היה מטרה משמעותית של תחלואה. אחרת מצאנו כי הממשל בקרום הבטן של מולקולות קטנות לא השפיע על הישרדות או תוצאות משובי. אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה מותאם לשימוש עם מולקולות קטנות אחרות לחקור היבטים שונים של התחדשות.

העכבר neonatal ניתוחים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, מחייבות מומחיות מיוחדת לטיפול בבעלי חיים, ניתוח מיקרוסקופי. גידול בעלי חיים מומחיות יש צורך להימנע קניבליזם אימהית בעקבות הניתוח, במהלך תקופת ההחלמה מיידית.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המנחים שנקבעו על ידי האגודה מגוונת פאנל ניהול הסמכה של מעבדה חיה אכפת הבינלאומי (AAALAC) ואת אוניברסיטת סטנפורד על חיות מעבדה טיפול (APLAC), (פרוטוקול מס ' #10266), ארצות הברית, או חוק האירופית בעלי חיים רווחה, דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי. הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של ממשלת בוואריה, גרמניה, וקיבל את ההרשאה לא: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. הכנה בעלי חיים

1. הכן של כלוב ריק עם מצעים המתאימים על כרית החימום.
2. לפני מגע חיות עם כפפות, לשפשף המצעים של האם אל הכפפות.
3. הסר כל הגורים שלהם אמא ומקום לתוך הכלוב ריק. להסיר חלק מצעים של האם ולמקם אותו בכלוב ריק עם הגורים.
4. מקם את האמא בכלוב נפרד, נקי, יבש מהשדה כירורגי.
5. דון כפפות חדש, נקי סטרילי לפני ההכנה דימומים.

2. דימומים הכנה

1. באמצעות פיפטה של 10-mL, להוסיף 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) צלחת פטרי 10-ס מ.
2. פיפטה 2 מ של פתרון ואנטיספטיות betadine או שווה ערך הפטרי ס מ-10.
3. במקום טווח ויבתר על השדה הכירורגי. להפעיל לנתח היקף המנורה ולהתאים את רמת האור כדי לנחם את המנתח. גור ניתן להציב בשטח כירורגית מתחת למנורה היקף ויבתר. אור נאותה יכול להיות מאושרות על ידי העדר של צללים על המשטח הגחון של הכלבלב.
4. הכינו את תא הרדמה איזופלוריין (ראה טבלה של חומרים) עם קונוס האף. החדר צריך לנקות ללא עדות שתן או צואה. מקם את האף חרוט ואת צינורות המשויך מתחת למיקרוסקופ ויבתר בשטח כירורגית. להטות את זרימת החמצן ואת איזופלוריין אך ורק כדי קונוס האף.
5. הכנת אזור ההחלמה שלאחר הניתוח עם כרית חימום להגדיר כ 37 מעלות צלזיוס. ההחלמה לאחר הניתוח צריכה להכיל 4 חתיכות של גזה הממוקמת מעל כרית החימום. במידת האפשר, לשפשף תחבושות גזה מצעים של האם, צואה, שתן כדי לשמר את הריח של האם.
   הערה: זה לא נבונה להשתמש מנורת חימום, כמו זה מקשה לשלוט בטמפרטורה. טמפרטורות גבוהות תגרום למותם של עכברים neonatal.
6. להכין ולחטא את כל מכשירי ניתוח עם החיטוי. הכלים הדרושים כוללים: מספריים לנתח מיקרו מלקחיים לנתח מיקרו, גזה, עוצר דימום, תפרים נספגים monofilament כל 6-0. מכשירי ניתוח יכול להיות resterilzed עם כל מעקר חרוז זכוכית.

3. חלקית Hepatectomy Lobular

1. עזים ומתנגד הכלבלב זה, האף חרוט על שלה בחזרה ובעדינות מקליטה את הרגליים והידיים, במקום להניח. הגורים אמורים לקבל איזופלוריין 5% חמצן.
   1. לאפשר הכלבלב לשבת במשך 5 דקות או עד שלמאחה מרדימים, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי בדיקת קורט הבוהן.
   2. להזריק 5 מ"ג/ק"ג של carprofen subcutaneously לפני החיתוך.
      הערה: כל הניתוח לא דרושות יותר מאשר תוצאות עניים 30 דקות עלולים להיות שנצפו ב- neonates הנמצאות תחת הרדמה כללית במשך יותר מ 30 דקות. לנקוט אמצעי זהירות כדי לצמצם את משך הניתוח דרך הכנה יסודית שדה, הרטבה של העור לפני הסגר כדי למזער את התפר המושרה העור דמעות.
2. לנקות בעדינות הבטן מהקיר האחורי עם כרית קטנה גאזה רטוב עם betadine. לאפשר את הבטאדין לייבוש על 1 דקות.
3. עושים חתך אמצע-בריחי השמאלי 0.5 ס מיד מתחת הצלעות עם מספריים לנתח מיקרו, מלקחיים. בעדינות להפריד את העור באמצעות מלקחיים, עושים חתך עמוק השני לתוך חלל הצפק (ראה איור 1C, מרכז ושמאלה)
4. בעדינות לרוחב ללחוץ משני צידי הבטן באמצעות חזרה, מסתיים בוטה של לנתח מיקרו מספריים, מלקחיים כדי לאלץ את השיא של האונה השמאלית מתוך חלל הצפק. השיא השמאלי של האונה השמאלית צריך להיות מטמיעים בקלות (איור 1C, נכון).
5. מהקודקוד, לקטוע ולשקול את כמות רקמת יוסרו.
   1. בעדינות בעזרת המספריים ניתוח מיקרו, לקטוע את הכמות הרצויה של רקמות מן השיא של האונה השמאלית.
   2. המקום הרקמה הקטוע לתוך צינור 1.5-mL מלא PBS. שוקל הרקמה הקטוע באמצעות איזון האנליטי (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: מניחים חתיכת גזה או נייר על האיזון, להקרע זה. ואז למקם את הרקמה הקטוע גזה או נייר ולמדוד את המסה.
   3. לתקן אזור הקטוע ב- 2% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 1 h ומקום טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) המורכב על קרח יבש לניתוח באזור הקפואים. לנתח את סעיפים קפוא על ידי חיתוך 7-10 מיקרומטר למקטעים באמצעות כל cryostat רגיל.
6. בעדינות באמצעות פיסת גזה מגולגלת, להחליף האונה השמאלית לתוך חלל הצפק. להשאיר את הגזה בחלל עד התחנות דימום.
7. הסר את הגזה, רטוב באתר כירורגית והסביבה עם גזה ספוגה PBS.
8. לסגור את האתר כירורגית עם 6-0 monofilament, תפרים נספגים עם תפר פועל. צפק ו העור צריך להיות סגור בנפרד.
   הערה: הרטבת בעדינות את העור עם גזה ספוגה PBS עשוי למזער תפר המושרה דמעות.
9. בעדינות אך ביסודיות לנקות את הגור עם גזה ספוגה PBS וודאו כי לא נשאר בדם או betadine. לגלגל את פד גזה ספוגים, לשפשף בעדינות מעל השלט הפצע כדי לנקות דם או betadine כלשהם.
   הערה: זה חשוב במיוחד כמו האם ייתכן משמידה את הגורים אם הם מנוקים כראוי.
10. להסיר את הכלבלב קונוס האף ומניחים אותו על האזור השחזור הכולל את תחבושות גזה, חשופים צואה ושתן של האם. ברגע הכלבלב מתאושש, החלף את הגור בכלוב ריק עם המצעים של האם.
    הערה: אין להשתמש מנורת חימום. השימוש של מנורת חימום יכול לגרום את neonate להתחמם יתר על המידה.
11. חזור על הפעולות על המספר הרצוי של הגורים. למרות כל הגורים ניתן להשתמש, זה בדרך כלל רצוי להשאיר מספר הגורים לא ניתחתי להחליפו יחד עם הגורים המופעלים.
12. החלף כל הגורים בו זמנית מצעים של אמם בכלוב של האם.

4. שחזור וניתוח

1. מעקב על העכברים מדי יום.
   1. בדוק הפצע נותר סגור ולהסיר כל הגורים מתים, אם קיים.
   2. אם הפצע יפתח, להכין את האזור הכירורגי של האתר ושחזור בעבר המתואר, חזור על צעדים 3.8 ל 3.12.
   3. להזריק 5 מ"ג/ק"ג של carpofen subcutaneously 24 ו 48 h בעקבות ההליך.
   4. בצע הגורים 56 ימים או יותר.
2. המתת חסד החיות לאחר הסכום הרצוי של ימים לאחר הניתוח על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO₂) נקע בצוואר הרחם.
   1. הכנס עכברים אינדוקציה / המתת חסד קאמרית, הפעל את ה-CO₂ עד עכברים מפסיק לנשום.
   2. ודא המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. לוחץ על הצוואר הגבי של העכבר באמצעות ביטוי-אצבע האגודל, בעזרת היד השנייה, למשוך למטה על הזנב.
3. הסר את כל הכבד en bloc , שוקל אותה.
   1. בזהירות להפריד בין האונה כל ולשקול בנפרד.
      הערה: להסיר את הכבד על ידי ניתוח זהיר של כלי הסרעפת ואת ולשננו פורטל. הפרד בין האונות אחד מהשני על ידי בזהירות לנתח כל אונה-מצורף proximal שלה.
4. לקבוע את מידת ההתחדשות על ידי השוואה בין המסה של האונה השמאלית הקטוע למסה של הכבד כל. האונה השמאלית שציווית הוא כ-30% כל הכבד.

תוצאות

איור 1A מפרט כללי ציר זמן של neonatal חלקית lobular hepatectomy (סכמטי של איור 1B), ואת אורך זמן לחכות עד התחדשות נצפית הצפוי. התחדשות עדין של האונה השמאלית יכול להיות שנצפו 7-14 ימים שלאחר ניתוח. התחדשות מלא לעתים קרובות נצפתה לאחר 56 ימים לתגובה. עכברים צריך...

Discussion

פגיעה כבדית חריפה באופן מסורתי נחקרה באמצעות חומר כימי (פרצטמול, אתנול, פחם tetrachloride), או מודלים כירורגי (70% hepatectomy חלקית). התגובה הרגנרציה לאחר 70% hepatectomy חלקי מאפיין לערב היפרטרופיה hepatocyte הכללית, מספר סיבובים של חלוקת התא^4,5. לעצירת דימום, עם זאת, מודל זה היא מוגב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730