Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.

Zusammenfassung

Morphologische Organregeneration nach akuten Gewebeverlust ist häufig bei niedrigeren Wirbeltiere, aber wird selten in Säugetieren postnatale Leben beobachtet. Erwachsenen Leberregeneration nach 70 % teilweise Hepatektomie führt in Hepatozyten Hypertrophie mit einigen Replikation im verbleibenden Lappen mit Wiederherstellung der Stoffwechselaktivität, aber mit dauerhaften Verlust des verletzten Lappens Morphologie und Architektur. Hier zeigen wir eine neue Operationsmethode in der Neugeborenen, die eine physiologische Umgebung förderlich für die Regeneration lässt. Dieses Modell beinhaltet Amputation der linke Lappen Spitze und eine anschließende konservative Verwaltung Regime, und fehlt die Notwendigkeit einer Ligatur der großen Leber Gefäße oder chemischen Verletzungen, so dass eine physiologische Umgebung wo Regeneration stattfinden kann. Wir erweitern dieses Protokoll zu Amputationen an juvenilen (P7-14) Mäusen, bei denen die Geschädigte Leber von Organregeneration in kompensatorischen Wachstum durch Hypertrophie wechselt. Das präsentiert, kurz 30 min-Protokoll sieht einen Rahmen um die Mechanismen der Regeneration, der altersassoziierten Rückgang bei Säugetieren und die Charakterisierung der vermeintlichen hepatische Stiel oder Vorfahren zu studieren.

Einleitung

Die Fähigkeit zur Regeneration eines Organs oder zur Wiederherstellung von Form und Funktion, ist gedacht worden, vor allem über die evolutionäre Zeit verloren. Das regenerative Potential der Erwachsenen Säugetier-Leber nach chemischen oder physikalischen akutverletzung wurde gefunden, um die Mobilisierung der alle verbleibenden Hepatozyten in Wellen von Hypertrophie und einige Runden der Zellteilung, wodurch eine funktionale aber was beinhalten architektonisch verschiedenen Orgel^1,2,3,4,5. Vor kurzem, haben Studien begonnen, die regenerative Reaktion des Neugeborenen Säugetieren Organe auf eine Verletzung innerhalb der ersten Woche des Lebens^6,7,8charakterisieren. Diese Studien haben gezeigt, dass wenn bei Neugeborenen Entwicklung verletzt, bestimmte Säugetiere Organe mit morphologischen Regeneration statt kompensatorische Wachstum oder Fibrose^{7,8 reagieren}.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Regeneration der globalen Struktur und Funktion während der frühen neonatalen Periode^6,7,8auftritt. Etablierten Leberschädigung Protokolle beinhalten chemische Verletzungen oder Verwaltung von Ethanol^9,10,11, Paracetamol^12,13,14,15 , Carbon Titantetrachlorid^16,17,18,19, 70 % teilweise Hepatektomie^4,20,21oder Entfernung der linken und mittlere Lappen. Chemische Verwaltung führt zum Zelltod Hepatozyten, aber oft Mikro und Makro-Strukturen intakt. Morphologische Regeneration kann nicht ohne weiteres in diesem Zusammenhang untersucht werden, wie die insgesamt hepatische Architektur nicht ausgelöscht wurde. Die 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet Naht Ligatur der großen Gefäße, die Blutung zu stoppen notwendig ist, sondern lässt eine nicht-physiologischen Umgebung mit ständigen Unterbrechungen des Gefäßsystems. Darüber hinaus ist nur mit dieser Methode auf Erwachsene Nagetiere, und ihre Anwendung auf das Neugeborene ist technisch äußerst schwierig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, die in dem 20-30 % von der Spitze des linken Lappens, in einer Neugeborenen Maus P0 entfernt wird entwickelt (Abbildung 1A-1 b). Diese Methode ist chirurgisch konservative, minimal-invasive, nicht technisch anspruchsvoll und führt zum Verlust der Morphologie ohne die Unterbindung des Gefäßsystems, lässt Raum für Regeneration auftreten Brutto. Das resultierende Schritt für Schritt-Protokoll, wie unten beschrieben, ermöglicht für jeden Forscher eine partielle Lobuläres Hepatektomie an Neugeborenen Mäusen durchführen, um Säugetiere neonatale Regeneration in den frühen Stadien des postnatalen Lebens zu studieren. Diese Methode hat auch klare Anwendungen zu vergleichende Studien in der regenerativen Medizin und Stammzellbiologie, wie es in späteren Phasen des Lebens in der Leber verwendet werden kann.

Die häufigste akute Leberschädigung Studien sind chemisch induzierten Schäden, adult Leber Amputation oder 70 % teilweise Hepatektomie. Chemische Schäden oft intravenös, intraperitoneal oder orale Verabreichung von Paracetamol, Carbon Titantetrachlorid oder Ethanol beinhaltet, und ist eine relativ einfache und nicht-invasive Verletzung Modell. Wie bereits diskutiert, chemische Schäden Ergebnisse in Hepatozyten Zelltod, aber oft Blätter Stroma und Parenchym Strukturen intakt, macht es schwierig, Aussagen über morphologische Regeneration machen. Chemische Schäden oft konzentriert sich auf die hepatische Schiffe, so dass es eine nützliche Technik, Website und zellspezifische Verletzungen, studieren aber auch erschwert, kann weiter von Schiffen liegen und das mag, Ebene der gesamten Organs, anderen Populationen zu befragen, zur Regeneration beitragen. Trotz dieser Einschränkungen bleibt chemische Schäden noch eine nützliche und sehr physiologisch relevanten Verletzungen-Modell.

Erwachsene 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet die Entfernung der linken und mittleren Lappen nach Ligatur der hepatischen Gefäßsystem. Die Antwort auf Hepatektomie hat gut charakterisiert: die amputierten Leber 14 Tage Post 70 % teilweise Hepatektomie eine grob Architektur von derjenigen der ursprünglichen unbeschädigt Lappen als die Hepatozyten der verbleibenden rechten und caudatus Lappen entwickelt Hypertrophie und ein paar Runden der Zellteilung^4,5zu unterziehen. Dies macht verloren und Funktion, aber schlägt fehl, die beiden amputierten Lappen zu regenerieren und ist daher kein Ersatz für grobe Morphologie. Dadurch eignet sich der Verletzung auf 70 % teilweise Hepatektomie, kompensatorischen Wachstum Mechanismen mit begrenzten Regeneration zu studieren.

Hier beschreiben wir voll und ganz ein Protokoll für eine neonatale teilweise Lobuläres Hepatektomie. Das Verfahren beinhaltet geeignete tierische Auswahl und Vorbereitung, Vorbereitung des Operationsfeldes, Chirurgie und Wiederherstellung. Optimierung und Anpassung der einzelnen Schritte können für verschiedene Anwendungen des Protokolls erforderlich.

Wir haben ausgiebig durchgeführt und optimiert dieses Protokoll auf Wildtyp C57BL/6J Welpen (JAX 000664), jedoch um unterschiedliche Zellpopulationen und Mechanismen der Regeneration zu untersuchen, wir auch verschiedene Transgene Tiere einschließlich Mäuse beherbergen verschiedene Cre verwendet und CreERT2 transgene und/oder Knock-ins (JAXAxin2^CreERT2 018867, und Sox9^CreERT2 JAX 018829) in Kombination mit fluoreszierenden Reporter, wie der Regenbogen und mTmG Systeme (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. fanden wir keine Notwendigkeit, diese Methode für verschiedene Mausstämme ändern, da keine Unterschiede im Überleben Ergebnisse oder regenerative Potenzial beobachtet wurden.

Neben der Verwendung von verschiedener tierischer Stämmen, führten wir auch teilweise lobulären Hepatectomies an Neugeborenen Mäusen mit kleinen Molekülen, wie 4-hydroxy-Tamoxifen und 5-Ethynyl-2 '-Deoxyuridine (EdU) behandelt. Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Ethanol dienten als Lösungsmittel, da festgestellt wurde, dass Mais-Öl war eine wesentliche Ursache für Morbidität. Ansonsten fanden wir, dass intraperitonealer Verabreichung von kleinen Molekülen nicht überleben oder regenerative Ergebnisse beeinflussen. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll für die Verwendung mit anderen kleinen Molekülen zu verschiedenen Aspekten der Regeneration zu verhören angepasst werden.

Neugeborenen Maus Operationen können technisch anspruchsvoll und erfordern spezielles Know-how im Umgang mit Tieren und mikroskopische Dissektion. Tierhaltung-Kompetenz gilt, mütterliche Kannibalismus zu vermeiden nach der Operation und während der sofortigen Wiederaufnahme Periode.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von der Association for Assessment und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) und der Stanford University Verwaltungs-Panel am Versuchstier durchgeführt Pflege (APLAC), (Protokoll-Nummer #10266) und in den Vereinigten Staaten oder dem Europäischen Tierschutzgesetz Richtlinie 2010/63/EU. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen des bayerischen Regierung, Deutschland, genehmigt und erhielt die Genehmigung nicht: 55.2-1-54-2532-150-2015.

(1) tierische Vorbereitung

1. Bereiten Sie eine leere Käfig mit geeigneter Einstreu auf ein Heizkissen.
2. Reiben Sie vor Tieren mit Handschuhen berühren die Mutter Bettzeug auf die Handschuhe.
3. Entfernen Sie alle Welpen von ihrer Mutter und Ihrem Platz in den leeren Käfig. Entfernen Sie einige der mütterlichen Bettwäsche und legen Sie sie in den leeren Käfig mit den Welpen.
4. Die Mutter in einem separaten, sauberen und trockenen Käfig entfernt das OP-Feld zu platzieren.
5. Don neue, saubere sterile Handschuhe vor der Vorbereitung des Operationsfeldes.

(2) op-Feld-Vorbereitung

1. Mit einer 10 mL-Pipette, 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Hinzufügen einer 10 cm Petrischale.
2. Pipette 2 mL Betadine o.ä. antiseptisch-Lösung in der Petrischale 10cm.
3. Legen Sie einen sezierenden Anwendungsbereich auf das Operationsfeld. Sezieren Umfang Lampe schalten Sie und passen Sie die Stufe des Lichts, der Chirurg Komfort. Ein Welpe kann in das OP-Feld unterhalb der sezierenden Umfang Lampe platziert werden. Ausreichend Licht kann durch das Fehlen von Schatten auf der ventralen Oberfläche der Pup bestätigt werden.
4. Vorbereiten die Isofluran-Narkose-Kammer (siehe Tabelle der Materialien) mit einem Prüfkopf. Die Kammer sollte ohne Nachweis von Urin oder Kot gereinigt werden. Legen Sie die bugnase und damit verbundenen Schläuche sezierenden Rahmen im Operationsfeld. Die Strömung von Sauerstoff und Isofluran ausschließlich auf die bugnase abzulenken.
5. Bereiten Sie einen postoperative Recovery-Bereich mit einem Heizkissen gesetzt bei etwa 37 ° C. Die postoperative Erholung sollte bestehen aus 4 Stück Gaze über das Heizkissen platziert. Wenn möglich, reiben Sie Gaze-Pads in der Mutters-Einstreu, Kot und Urin, die Mutter Duft zu bewahren.
   Hinweis: Es ist schlecht beraten, eine Wärmelampe verwenden, da dies es schwierig macht, die Temperatur zu kontrollieren. Erhöhte Temperaturen führt zu den Tod des Neugeborenen Mäusen.
6. Vorbereiten und alle chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven sterilisieren. Die Werkzeuge sind erforderlich: Mikro-sezieren Schere, Mikro-sezieren Zange, Gaze, Gefäßklemme und 6-0 Monofile nicht resorbierbaren Naht. Chirurgische Instrumente können Resterilzed mit jedem Glas Bead Sterilisator.

(3) teilweise Lobuläres Hepatektomie

1. Der Welpe zu betäuben, indem man sie in die bugnase auf seinen zurück und sanft taping, seine Füße und Hände im Ort. Der Welpe sollte 5 % Isofluran in Sauerstoff erhalten.
   1. Lassen Sie den Welpen zum Sitzen für 5 min oder bis ausreichend betäubt, die von einer Zehe kneiftest nachgeprüft werden kann.
   2. 5 mg/kg Carprofen subkutan vor dem Schnitt zu injizieren.
      Hinweis: Die gesamte Operation dauert nicht mehr als 30 min. schlechtere Ergebnisse beim Neugeborenen beobachtet werden können, die unter Vollnarkose für über 30 min stehen. Vorkehrungen Sie zur Minimierung der Länge der Chirurgie durch gründliche Bereich Vorbereitung und Benetzung der Haut vor der Schließung, Naht induzierte Haut Tränen zu minimieren.
2. Mit einem kleinen Tupfer nass mit Betadine der hinteren Bauchwand reinigen Sie sanft. Lassen Sie Betadine 1 min trocknen.
3. Machen Sie einen linken Mitte clavicular 0,5 cm Schnitt direkt unterhalb des Brustkorbs mit dem Mikro-sezieren Scheren und Pinzetten. Sanft die Haut mit einer Pinzette zu trennen und einen zweite tieferen Einschnitt in die Bauchhöhle (siehe Abbildung 1, Links und Mitte) machen
4. Sanft seitlichen Druck von beiden Seiten des Bauches mit der Rückseite, die stumpfen Enden der Mikro-sezieren Scheren und Pinzetten, um die Spitze des linken Lappens aus der Bauchhöhle zu zwingen. Die linke Spitze des linken Lappens sollte leicht visualisiert (Abbildung 1, rechts).
5. Von der Spitze zu amputieren Sie und wiegen Sie die Menge des Gewebes entfernt werden.
   1. Mit der Mikro-Dissektion Schere, sanft amputieren Sie die gewünschte Menge des Gewebes von der Spitze des linken Lappens.
   2. Ort der amputierten Gewebe in ein 1,5-mL-Röhrchen gefüllt mit PBS. Die Amputierte Gewebe mit einer Analysenwaage wiegen (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Legen Sie ein Stück Gaze oder Papier auf die Waage und Tarieren sie. Dann platzieren Sie die Amputierte Gewebe Gaze oder Papier und Messen Sie seine Masse zu.
   3. Befestigen der amputierten Bereich in 2 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 1 h und Ort optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte über Trockeneis für Gefrierschnitte Analyse. Gefrierschnitte abschnittsweise schneiden 7-10 µm mit jedem standard Kryostat zu analysieren.
6. Den linken Lappen mit einem gerollten Stück Gaze, sanft in die Bauchhöhle ersetzt werden. Verlassen Sie die Gaze in den Hohlraum, bis die Blutung aufhört.
7. Entfernen Sie die Gaze und nass der Operationsstelle und Umgebung mit Gaze getränkt mit PBS.
8. Schließen Sie die Operationsstelle mit 6-0 Monofile, nicht resorbierbare Nähte mit einem Running-Stich. Das Peritoneum und die Haut sollte separat geschlossen werden.
   Hinweis: Sanft Benetzung der Haut mit Gaze getränkt mit PBS kann Naht induzierte Tränen minimieren.
9. Sanft aber gründlich reinigen Sie der Welpe mit Gaze getränkt mit PBS und gewährleisten Sie bleibt weder Blut noch Betadine zu. Roll das getränkte Gaze-Pad und sanft über die Wunde Zeichen sauber aus Blut oder Betadine scrub.
   Hinweis: Dies ist besonders wichtig, da die Mutter die Welpen Ausschlachten kann, wenn sie nur unzureichend gereinigt werden.
10. Entfernen Sie den Welpen aus die bugnase und legen Sie es auf die Recovery-Bereich, die enthält die Gaze-Pads, Kot und Urin der Mutters ausgesetzt. Sobald der Welpe erholt, ersetzen Sie der Welpe in den leeren Käfig durch die Mutter Bettzeug.
    Hinweis: Verwenden Sie keiner Wärmelampe. Die Verwendung einer Wärmelampe kann das Neugeborene zu einer Überhitzung führen.
11. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl der Welpen. Obwohl alle Welpen verwendet werden können, ist es im Allgemeinen ratsam, ein paar Welpen nicht operiert, zusammen mit den operierten Welpen ersetzt werden zu lassen.
12. Ersetzen Sie alle Welpen gleichzeitig mit ihrer Mutter Einstreu in der Mutter-Käfig.

4. Erholung und Analyse

1. Follow-up auf den Mäusen täglich.
   1. Überprüfen Sie, dass die Wunde geschlossen ist und entfernen Sie Toten Welpen zu, falls vorhanden.
   2. Wenn die Wunde wieder öffnet, bereiten Sie die op Website und Erholung-Bereich als zuvor beschrieben, und wiederholen Sie Schritte 3,8 bis 3.12.
   3. 5 mg/kg Carpofen subkutan 24 und 48 h nach dem Eingriff zu injizieren.
   4. Welpen für 56 Tage oder länger zu folgen.
2. Die Tiere nach der gewünschten Menge an postoperativen Tagen durch Kohlendioxid (CO₂) Belichtung und zervikale Dislokation einschläfern.
   1. Platzieren Sie Mäuse in der Induktion / Euthanasie Kammer und schalten Sie die CO₂ bis Mäuse aufhören zu atmen.
   2. Euthanasie durch zervikale Dislokation zu gewährleisten. Auf der dorsalen Hals der Maus mit der Vordergrund-Finger und Daumen nach unten drücken Sie und mit der anderen Hand ziehen Sie am Heck.
3. Entfernen Sie die gesamte Leber en bloc und wiegen Sie es.
   1. Sorgfältig trennen Sie jeder Lappen und wiegen Sie getrennt.
      Hinweis: Entfernen Sie die Leber durch sorgfältige Präparation der Zwerchfell und Leber und Portal Schiffe. Die Lappen voneinander zu trennen, jeder Lappen an den proximalen Anhang sorgfältig seziert.
4. Legen Sie den Umfang der Regeneration durch den Vergleich der Mass der amputierten linken Lappen, die Masse der gesamten Leber. Eine unverletzte linke Lappen ist etwa 30 % der gesamten Leber.

Ergebnisse

Abbildung 1A beschreibt eine allgemeine Chronologie der Neugeborenen teilweise Lobuläres Hepatektomie (schematisch in Abbildung 1 b) und die voraussichtliche Zeitdauer zu warten, bis die Regeneration beobachtet wird. Subtile Regeneration der linke Lappen kann beobachteten 7-14 Tage Post op. Volle Regeneration wurde oft beobachtet, nach 56 Tagen-Chirurgie Post. Mäuse sollten keine Anzeichen von physiologischen Auffälligkeiten n...

Diskussion

Akute Leberschädigung ist traditionell mit chemischen (Paracetamol, Ethanol, Carbon Titantetrachlorid) oder chirurgische Modelle (70 % partielle Hepatektomie) untersucht worden. Die regenerative Antwort nach 70 % teilweise Hepatektomie charakterisiert worden ist, um globale Hepatozyten Hypertrophie und mehrfache Umläufe der Zellteilung^4,5einzubinden. Um Blutungen zu stoppen, ist dieses Modell jedoch begrenzt, da die großen Schiffe verlassen eine abnorme Umgebu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730