Hepatectomía parcial lobulado: Un modelo quirúrgico para regeneración hepática morfológico

Resumen

Aquí, presentamos un nuevo método para la resección parcial del lóbulo izquierdo hepático en ratones neonatales (día 0). Este nuevo protocolo es adecuado para el estudio de la lesión del higado aguda y la respuesta de lesiones en el ámbito neonatal.

Resumen

Regeneración de órganos morfológicos después de una pérdida aguda de tejido es común entre los vertebrados inferiores, pero se observa raramente en vida postnatal mamífera. Adultos regeneración hepática después de hepatectomy parcial 70% resulta en hipertrofia de hepatocitos con algunos replicación en lóbulos restantes con la restauración de la actividad metabólica, pero con pérdida permanente de la morfología del lóbulo lesionado y la arquitectura. Aquí detallamos un nuevo método quirúrgico en el recién nacido que sale de un ambiente fisiológico propicias a la regeneración. Este modelo implica la amputación del ápice del lóbulo izquierdo y un régimen de tratamiento conservador posterior y carece de la necesidad de ligadura de grandes vasos sanguíneos hígados o lesión química, dejando un ambiente fisiológico donde puede ocurrir la regeneración. Extendemos este protocolo amputaciones en juveniles ratones (P7-14), durante el cual el hígado lesionado transiciones de regeneración del órgano al crecimiento compensatorio por hipertrofia. El protocolo presentado, breve 30 minutos proporciona un marco para estudiar los mecanismos de regeneración, su declive asociado a la edad en mamíferos y la caracterización de la supuesta madre hepática o progenitores.

Introducción

La capacidad de regenerar un órgano, o para restaurar la forma y función, se ha pensado sobre todo se pierden en el tiempo evolutivo. Se ha encontrado el potencial regenerativo del hígado mamífero adultos después de lesión aguda del químico o físico que implica la movilización de todos los hepatocitos restantes dando lugar a olas de hipertrofia y rondas de división celular, resultando en un funcional pero órgano arquitectónicamente diferentes^1,2,3,4,5. Recientemente, estudios han empezado a caracterizar la respuesta regenerativa de órganos mamíferos neonatales lesiones dentro de la primera semana de vida^6,7,8. Estos estudios han demostrado que cuando se lesionó durante el desarrollo neonatal, ciertos órganos mamíferos responden con regeneración morfológica en vez de compensatoria crecimiento o fibrosis^7,8.

Estudios recientes han demostrado que la regeneración de la estructura global y la función se produce durante el temprano período neonatal^6,7,8. Lesión hepática establecido protocolos involucran daño químico o la administración de etanol^9,10,11, acetaminophen^12,13,14,15 , tetracloruro de carbono^16,17,18,19, 70% hepatectomía parcial^4,20,21o retirada de la izquierda y lóbulos medianos. Administración química conduce a la muerte celular de hepatocitos, pero a menudo deja intactas las estructuras micro y macro. Regeneración morfológica no puede estudiarse fácilmente en este contexto, como la arquitectura en general hepática no fue borrada. La hepatectomía parcial 70% consiste en la ligadura de sutura de los vasos principales, que es necesaria para detener el sangrado, pero deja un ambiente no-fisiológica con la interrupción permanente de la vasculatura. Además, este método ha sido utilizado sólo en roedores adultos y su aplicación a los recién nacidos es técnicamente muy difícil. Con esto en mente, hemos desarrollado un método en el que 20-30% del ápice del lóbulo izquierdo se quita en un ratón recién nacido de P0 (figura 1A-1B). Este método es quirúrgico conservador, mínimamente invasivo, no técnicamente difícil y conduce a pérdida de la morfología sin la ligadura de vasos, dejando espacio para que se produzca la regeneración. El resultante protocolo paso a paso, que se describe a continuación, permite para que cualquier investigador realizar una hepatectomía parcial lobulada en ratones neonatales para estudiar mamífera regeneración neonatal en las primeras etapas de la vida post-natal. Este método también tiene claras aplicaciones a los estudios comparativos en medicina regenerativa y biología de células madre, ya que puede ser utilizado en el hígado durante fases más posteriores de la vida.

Los estudios más comunes de lesión del higado aguda son daños inducida químicamente, amputación de hígado adulto o hepatectomía parcial 70%. Daño químico a menudo implica la administración intravenosa, intraperitoneal u oral de paracetamol, tetracloruro de carbono y etanol y es un modelo relativamente fácil y no invasivo de la lesión. Como anteriormente analizados, resultados de daños químicos en la muerte celular de hepatocitos, pero a menudo hojas de estroma y parénquima estructuras intactas, lo que es difícil hacer afirmaciones sobre regeneración morfológica. Daños químicos a menudo se centra en los vasos hepáticos, lo que es una técnica útil para estudiar el sitio y lesión de la célula-específica, pero también hace que sea difícil de interrogar, en el nivel de órgano entero, otras poblaciones que puede estar situado más lejos de los vasos y que puede contribuir a la regeneración. A pesar de estas limitaciones, daño químico sigue siendo un modelo útil y altamente fisiológicamente relevantes de la lesión.

Adultos 70% hepatectomía parcial consiste en la extirpación de los lóbulos izquierdos y mediales después de la ligadura de la vasculatura hepática. La respuesta a la hepatectomía ha sido bien caracterizada: el hígado amputado 14 días post 70% hepatectomía parcial desarrolla una arquitectura muy diferente de la del lóbulo intacto original, como los hepatocitos de los restantes lóbulos derecho y caudados sufren hipertrofia y unas cuantas rondas de división celular^4,5. Esto hace masa perdida y la función, pero es incapaz de regenerar los dos lóbulos amputados y por lo tanto no reemplaza la morfología gruesa. Como resultado, la respuesta de la lesión a hepatectomía parcial 70% es útil para estudiar mecanismos de crecimiento compensatorio con la regeneración limitada.

Aquí, describimos completamente un protocolo para una neonatal hepatectomía parcial de lobulado. El procedimiento implica la selección adecuada del animal y preparación, preparación del campo quirúrgico, cirugía y recuperación. Optimización y adaptación de cada uno de estos pasos pueden requerir para diferentes aplicaciones del protocolo.

Hemos realizado extensivamente y este protocolo en cachorros de C57BL/6J de tipo salvaje (JAX 000664), sin embargo, para el estudio de diferentes poblaciones celulares y los mecanismos de regeneración, también utilizamos varios animales transgénicos incluyendo ratones albergar varios Cre y CreERT2 transgenes o knock-ins (JAXAxin2^CreERT2 018867, y Sox9^CreERT2 JAX 018829) en combinación con los reporteros fluorescentes, tales como los sistemas de arco iris y mTmG (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. hemos encontrado necesario cambiar esta metodología para las cepas de ratón diferente, como se observó ninguna diferencia en los resultados de supervivencia o potencial regenerativo.

Además del uso de diferentes cepas animales, también realizamos hepatectomías parciales de lobulado en ratones neonatales tratados con moléculas pequeñas, como la 4-hidroxi-tamoxifeno y 5-ethynyl-2 '-desoxiuridina (EdU). Dimetil sulfóxido (DMSO) y el etanol fueron utilizados como disolventes, como se encontró que el aceite de maíz fue una causa importante de morbilidad. De lo contrario nos encontramos con que la administración intraperitoneal de pequeñas moléculas no afectó la supervivencia o los resultados de regeneración. Predecimos que este Protocolo será adaptado para su uso con otras moléculas pequeñas a interrogar a diversos aspectos de la regeneración.

Cirugías de ratón neonatal pueden ser técnicamente difíciles y pueden requerir especiales conocimientos en manejo de animales y la disección microscópica. Experiencia de cría de animales es necesaria para evitar canibalismo maternal después de la cirugía y durante el período de recuperación inmediata.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices establecidas por la Asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care Internacional (AAALAC) y la Universidad de Stanford Panel administrativo en Animal de laboratorio Cuidado (APLAC), (número de protocolo #10266) y en los Estados Unidos, o el Acta de Bienestar Animal Europea, Directiva 2010/63/UE. El protocolo fue aprobado por la Comisión de ética de los experimentos del Animal del gobierno de Baviera, Alemania y recibió el permiso No: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. animal preparación

1. Preparar una jaula vacía con ropa de cama apropiada sobre una almohadilla de calefacción.
2. Antes de tocar animales con guantes, frotar la ropa de cama de la madre en los guantes.
3. Retire todos los cachorros de su madre y su lugar en la jaula vacía. Quite algo de ropa de cama de la madre y colocar en la jaula vacía con los cachorros.
4. Lugar de la madre en una jaula aparte, limpia y seca, lejos del campo quirúrgico.
5. Don guantes nuevos y limpios estériles antes de la preparación del campo quirúrgico.

2. preparar el terreno quirúrgico

1. Con una pipeta de 10 mL, añadir 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) a un plato de Petri de 10 cm.
2. Pipetear 2 mL de solución antiséptica betadine o equivalente en el plato de Petri de 10cm.
3. Lugar un disección alcance en el campo quirúrgico. Encienda la lámpara alcance de disección y ajustar el nivel de luz para comodidad del cirujano. Un cachorro puede colocarse en el campo quirúrgico por debajo de la lámpara alcance disección. Luz adecuada puede confirmarse por la ausencia de sombras en la superficie ventral de la cría.
4. Preparar la cámara de anestesia isoflurano (véase Tabla de materiales) con un cono de nariz. La cámara debe limpiarse sin pruebas de orina o heces. Coloque el cono de nariz y tubos asociados en el ámbito de la disección en el campo quirúrgico. Desviar el flujo de oxígeno y el isoflurane exclusivamente en el cono de nariz.
5. Preparar un área de recuperación postoperatoria con una almohadilla de calefacción a aproximadamente 37 ° C. La recuperación postoperatoria debe consistir de 4 piezas de Gasa colocada sobre la almohada. Si es posible, frote gasas en ropa de cama, heces y orina para conservar el olor de la madre de la madre.
   Nota: Es aconsejable utilizar una lámpara de calor, como es difícil controlar la temperatura. Temperaturas elevadas resultará en la muerte de ratones neonatales.
6. Preparar y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con un autoclave. Las herramientas necesitan incluyen: tijeras disección micro, micro-quirúrgico, gasas, pinza hemostática y cualquier sutura no absorbible de monofilamento 6-0. Instrumentos quirúrgicos pueden ser el caso con cualquier esterilizador de bolas de cristal.

3. parcial Hepatectomy lobulado

1. Anestesiar el cachorro colocando en el cono de nariz en su espalda y suavemente encintado de sus pies y manos en lugar. El cachorro debe recibir 5% isoflurano en oxígeno.
   1. Deje que el cachorro a sentarse por 5 minutos o hasta que adecuadamente anestesiados, que puede ser verificado por una prueba del pellizco del dedo del pie.
   2. Inyecte 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea antes de la incisión.
      Nota: La cirugía completa debe tomar ya no de 30 minutos peores resultados pueden observarse en los recién nacidos que se encuentran bajo anestesia general durante más de 30. Tomar precauciones para reducir al mínimo la duración de la cirugía a través de la preparación de campo exhaustivo y humectante de la piel antes de cierre para minimizar los rasgones de piel sutura inducida.
2. Limpie suavemente la pared abdominal posterior con una pequeña gasa con betadine. Permita que el betadine secar durante 1 minuto.
3. Haga una incisión de mediados de-clavicular izquierdo 0.5 cm inmediatamente por debajo de la caja torácica con la disección micro tijeras y fórceps. Suavemente separa la piel con unas pinzas y hacer una segunda incisión más profunda en la cavidad peritoneal (ver figura 1, izquierda y centro)
4. Suavemente aplique presión lateral de ambos lados del abdomen con la espalda, los extremos embotados de la disección micro tijeras y fórceps para forzar el ápice del lóbulo izquierdo de la cavidad peritoneal. El ápice izquierdo del lóbulo izquierdo debe ser fácilmente visualizadas (figura 1, derecha).
5. Desde el ápice, amputar y pesar la cantidad de tejido a quitar.
   1. Suavemente con las tijeras de disección micro, amputar la cantidad deseada de tejido desde el ápice del lóbulo izquierdo.
   2. Coloque el tejido amputado en un tubo de 1,5 mL con PBS. Pesa el tejido amputado utilizando una balanza analítica (véase Tabla de materiales).
      Nota: Coloque un pedazo de gasa o papel en el equilibrio y lo vicia. Luego colocar el tejido amputado sobre la gasa o papel y medir su masa.
   3. Fijar la zona amputada en paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora y el lugar de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto sobre hielo seco para el análisis de sección congelada. Analizar las secciones congeladas por cortar 7-10 μm secciones usando cualquier estándar criostato.
6. Utilizando un trozo laminado de gasa, vuelva a colocar el lóbulo izquierdo en la cavidad peritoneal. Deje la gasa en la cavidad hasta que el sangrado se detenga.
7. Retire la gasa y humedezca el sitio quirúrgico y el área circundante con una gasa empapada con PBS.
8. Cerrar el sitio quirúrgico con 6-0 monofilamento, suturas no absorbibles con una puntada corriente. El peritoneo y la piel deben ser cerrados por separado.
   Nota: Mojar suavemente la piel con una gasa empapada con PBS puede minimizar sutura inducida por lágrimas.
9. Suavemente pero completamente limpia al cachorro con una gasa empapada con PBS y no Asegúrese de que quede sangre o betadine. Rodillo de la gasa empapada y frote suavemente sobre la muestra de la herida para limpiar sangre o betadine.
   Nota: Esto es especialmente importante que la madre puede canibalizar los cachorros si se limpian adecuadamente.
10. Retirar el cachorro del cono de nariz y colóquelo en el área de recuperación que incluye gasas expuestos a las heces y la orina de la madre. Una vez que el cachorro se recupera, reemplazar el cachorro en la jaula vacía con ropa de cama de la madre.
    Nota: No use una lámpara de calor. El uso de una lámpara de calor puede causar el recién nacido se sobrecaliente.
11. Repita el procedimiento en el número de cachorros. Aunque todos los cachorros pueden ser utilizados, es generalmente recomendable dejar unos cachorros no operados reemplazarse junto con los cachorros funcionados.
12. Reemplazar todos los cachorros al mismo tiempo con ropa de cama de su madre en la jaula de la madre.

4. recuperación y análisis

1. Dar seguimiento a los ratones diariamente.
   1. Comprobar que la herida permanece cerrada y retire cualquier cachorros muertos, si está presente.
   2. Si reabre la herida, preparar el área quirúrgica del sitio y la recuperación como la anteriormente descritos y repetir pasos 3.8 a 3.12.
   3. Inyecte 5 mg/kg de carpofen por vía subcutánea de 24 y 48 h después del procedimiento.
   4. Siga cachorros durante 56 días o más.
2. Eutanasia a los animales después de la cantidad de días de postoperatorios por exposición de dióxido de carbono (CO₂) y la dislocación cervical.
   1. Lugar de ratones en la inducción / eutanasia cámara y encienda el CO₂ hasta ratones dejan de respirar.
   2. Asegúrese de eutanasia por dislocación cervical. Empuje hacia abajo el cuello dorsal del ratón con el dedo delante y el pulgar y con la otra mano, tire de la cola.
3. Quitar el entero hepática en bloque y pésalo.
   1. Cuidadosamente separe cada lóbulo y pesan por separado.
      Nota: Quitar el hígado por la disección cuidadosa de los recipientes del diafragma y hepático y portal. Separar los lóbulos entre sí por disecar con cuidado cada lóbulo en su fijación proximal.
4. Determinar el grado de regeneración mediante la comparación de la masa del lóbulo izquierdo amputado a la masa del hígado entero. Un lóbulo izquierdo ileso es aproximadamente 30% de hígado entero.

Resultados

Figura 1A detalla una cronología general de la hepatectomía lobulado parcial neonatal (esquemática en la figura 1B) y la duración prevista de tiempo de espera hasta que se observa regeneración. Regeneración sutil del lóbulo izquierdo puede ser observado entre 7 y 14 días post cirugía. Regeneración completa se observa a menudo después de 56 días post cirugía. Ratones no deben mostrar ningún signo de anormalidades fis...

Discusión

Lesión hepática aguda tradicionalmente se ha estudiado usando químico (acetaminofen, etanol, tetracloruro de carbono), o modelos quirúrgicos (hepatectomía parcial del 70%). La respuesta regenerativa después de hepatectomy parcial 70% se ha caracterizado para implicar hipertrofia de hepatocitos global y múltiples rondas de división celular^4,5. Para detener la hemorragia, sin embargo, este modelo es limitado, como los vasos principales se deben ligarse deja...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730