JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем новый метод для частичной резекции левой доли печени в неонатальной (день 0) мышах. Этот новый протокол подходит для изучения острого повреждения печени и травмы ответ в параметре новорожденных.

Аннотация

Морфологических орган регенерации после острого ткани потери распространена среди нижних позвоночных, но редко наблюдается в послеродовой жизни млекопитающих. Взрослый регенерации печени после частичной гепатектомии 70% приводит к гипертрофии гепатоцитов с некоторыми репликации в оставшихся лепестков с восстановлением метаболической активности, но с постоянной потери потерпевшего доли морфологии и архитектуры. Здесь мы подробно новый хирургический метод для новорожденных, что оставляет физиологической среды способствуют регенерации. Эта модель предполагает ампутацию левой доли Апекс и последующих консервативное управление режим и не имеет необходимости перевязки крупных сосудов печени или химические травмы, оставляя физиологической среде, где может возникнуть регенерации. Мы расширяем этот протокол к ампутации на несовершеннолетних (P7-14) мышах, во время которых потерпевшее печени переходит от регенерации органов для компенсации роста, гипертрофия. Представлены, краткие 30 мин протокол обеспечивает основу для изучения механизмов регенерации, его возраст связанных снижение млекопитающих и характеристика предполагаемого печеночная стволовых или прародителями.

Введение

Способность к регенерации органа, или для восстановления формы и функции, была мысль в основном потеряли эволюции со временем. Было установлено, что регенеративный потенциал взрослых млекопитающих печени после острых химических или физических травм включают мобилизацию всех оставшихся гепатоцитов, волны гипертрофии и несколько раундов деления клеток, что приводит к функциональным но Архитектурноакустически другой орган1,2,3,4,5. Недавно исследования начали характеризовать восстановительной реакции новорожденных млекопитающих органов травмы в течение первой недели жизни6,,78. Эти исследования показали, что когда травму во время развития новорожденных, некоторых млекопитающих органы реагируют с морфологической регенерации вместо компенсации роста или фиброза7,8.

Недавние исследования показали, что глобальные структуры и функции регенерации во время раннего неонатального периода6,,78. Установленные повреждения печени протоколы включают химические травмы или отправления этанола9,10,11, ацетаминофен12,13,14,15 , тетрахлорид углерода16,,1718,19, 70% частичной гепатектомии4,20,21или удаление слева и Средний лопастями. Химические администрация приводит к гибели клеток гепатоцитов, но часто оставляет нетронутыми микро - и макро структур. Морфологическая регенерации не могут быть изучены легко в этом контексте, как целом печеночная архитектуры был не уничтожены. 70% частичной гепатектомии включает перевязки швов крупных сосудов, которая необходима остановить кровотечение, но оставляет не физиологической среды с постоянным нарушением сосудистую. Кроме того этот метод использовался только на взрослых грызунов, и его применение для новорожденных технически очень сложно. Имея это в виду, мы разработали метод, в котором 20-30% верхушки левой доли удаляется в новорожденного P0 мыши (рис. 1A-1В). Этот метод хирургическим консервативная(ый), минимально инвазивной, технически не сложно и приводит к Валовой убыток морфологии без перевязки сосудистую, оставляя место для регенерации происходит. Результате поэтапного протокол, описанные ниже, позволяет любой исследователь для выполнения частичной гепатектомии лобулярного на новорожденных мышей с целью изучения млекопитающих неонатальной регенерации на ранних стадиях послеродовой жизни. Этот метод также имеет четкие приложений для сравнительных исследований в области регенеративной медицины и биологии стволовых клеток, как он может быть использован в печени на более поздних этапах жизни.

Наиболее общие исследования острой травмы печени являются химически индуцированных повреждений, Взрослый печени ампутации или частичной гепатектомии 70%. Химические повреждения часто предполагает внутривенного, внутрибрюшинного или устное администрации ацетаминофен, четыреххлористый углерод, или этанола и относительно легко и неразрушающего травмы модель. Как уже упоминалось, химическое повреждение приводит к клеточной гибели гепатоцитов, но часто листья стромы и паренхиме структуры нетронутыми, что делает его трудно сделать претензии о морфологической регенерации. Химические повреждения часто центров на печени судов, что делает его полезным методом для изучения сайта и клеток конкретным травм, но также делает его трудным для допроса, на уровне весь орган, другие группы населения, которые могут быть расположены дальше от судов и которые могут способствует регенерации. Несмотря на эти ограничения химических повреждений по-прежнему остается полезным и весьма физиологически соответствующих травмы модель.

Взрослый 70% частичной гепатектомии включает в себя удаление левой и средней долей после перевязки печеночная сосудистую. Ответ на гепатектомии хорошо характеризуется: ампутировали печени 14 дней частичной гепатектомии 70% пост развивается грубо разные архитектуры от того из оригинальной неповрежденной мочку, как гепатоцитов оставшиеся справа и хвостатого лопастями подвергаются гипертрофии и несколько раундов клеточного деления4,5. Это составляет потери массы и функции, но не регенерировать ампутировали две доли и поэтому не заменяет брутто морфологии. В результате травмы ответ на 70% частичной гепатектомии полезно изучить механизмы компенсационного роста с ограниченной регенерацией.

Здесь мы полностью описать протокол для новорожденных частичной гепатектомии лобулярного. Процедура включает в себя соответствующие животных выбор и подготовка, подготовка операционного поля, хирургии и восстановления. Оптимизации и адаптации каждого из этих шагов могут потребоваться для различных видов применения протокола.

Мы активно выступали и оптимизировать этот протокол на дикого типа C57BL/6J щенков (JAX 000664), однако, для изучения различных клеточных популяций и механизмы регенерации, мы также использовали различные трансгенных животных, включая мышей, укрывательство различные КРР и CreERT2 трансгенов и/или стук ins (JAXAxin2CreERT2 018867, и Sox9CreERT2 JAX 018829) в сочетании с флуоресцентные журналистам, как Радуга и mTmG систем (R26VT2/GK3, R26 mT/мг) 22 , 23. Мы нашли не нужно изменить эту методологию для мыши различных штаммов, как не наблюдалось никаких различий в результаты выживания или регенеративного потенциала.

Помимо использования различных животных штаммов, мы также выполняются частичным лобулярного hepatectomies на новорожденных мышей, получавших малых молекул, таких как 4-гидрокси тамоксифен и 5-ethynyl-2′ дезоксиуридина (EdU). Диметилсульфоксид (ДМСО) и этанола были использованы в качестве растворителей, как было установлено, что кукурузное масло было серьёзной причиной заболеваемости. В противном случае, мы обнаружили, что внутрибрюшинное администрации малых молекул не влияет на выживание или регенеративного результатов. Мы предсказывают, что этот протокол будет адаптирована для использования с другими малых молекул допросить различные аспекты регенерации.

Новорожденных мышь операции может быть технически сложным и может потребовать специальных знаний в животных обработки и микроскопических рассечение. Животноводства экспертизы необходимо избегать материнской каннибализм после операции и в течение периода немедленного восстановления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Всех животных эксперименты проводились в строгом соответствии с руководящими принципами, изложенными в ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных международного (AAALAC) и Стэнфордского университета и административной панели на лабораторных животных Уход (APLAC), (номер #10266 протокола) и в Соединенных Штатах, или Европейский закон о благосостояния животных, Директива 2010/63/ЕС. Протокол был одобрен Комитетом по этике животных эксперименты правительства Баварии, Германия и не получил разрешение: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. животных подготовка

  1. Подготовьте пустую клетку с соответствующим постельные принадлежности на грелку.
  2. До прикосновения животных с перчатками, руб матери постельные принадлежности на перчатки.
  3. Удаление всех щенков от их матери и место в пустую клетку. Удалите некоторые матери постельных принадлежностей и поместите его в пустую клетку с щенков.
  4. Место матери в отдельный, чистой, сухой клетке от операционного поля.
  5. Дон новые, чистые стерильные перчатки до подготовки операционного поля.

2. хирургический полевой подготовки

  1. С помощью пипетки 10-мл, 10 мл-фосфатный буфер (PBS) Добавление Петри 10-см.
  2. Пипетка 2 мл раствора Бетадин или эквивалент анти-септических Петри 10-см.
  3. Место рассечения область на операционном поле. Включите рассекает область лампа и отрегулируйте уровень света для хирурга комфорта. Щенок могут быть размещены на операционном поле под рассечения лампа область. Адекватного свет может быть подтверждено отсутствие теней на вентральной поверхности щенка.
  4. Подготовка камеры изофлюрановая анестезии (см. Таблицу материалы) с носовой конус. Камеры должны быть очищены без доказательств мочи или Кала. Место носовой конус и связанных трубы под рассечения область на операционном поле. Отвлечь поток кислорода и изофлюрановая исключительно для носовой конус.
  5. Подготовить зона послеоперационного восстановления с грелку на приблизительно 37 ° C. Послеоперационное восстановление должно состоять из 4 куска Марли, укладывают поверх грелку. Если возможно руб марлевые подушечки в постельных принадлежностей, Кала и мочи для сохранения матери запах матери.
    Примечание: Это нецелесообразным использовать тепла лампы, как это делает его трудным для контроля температуры. Повышенные температуры приведет к смерти новорожденных мышей.
  6. Подготовить и стерилизовать всех хирургических инструментов с автоклаве. Инструменты необходимо включить: микро Рассекающий ножницы, микро Рассекающий щипцы, марля, кровоостанавливающий и леска не рассасывающиеся шовные любого 6-0. Хирургические инструменты могут быть resterilzed с любой стеклянный шарик стерилизатор.

3. частичной гепатектомии лобулярного

  1. Анестезировать щенка, поместив его в носовой конус на его обратно и аккуратно лентой его ноги и руки на месте. Щенок должен получать 5% изофлюрановая кислорода.
    1. Разрешить щенка сидеть за 5 минут или до тех пор, пока надлежащим образом под наркозом, которые могут быть проверены мыс щепотку теста.
    2. Придать 5 мг/кг carprofen подкожно до разреза.
      Примечание: Все операции следует принимать больше не чем беднее результаты 30 мин может наблюдаться у новорожденных, которые находятся под общим наркозом для более чем 30 мин. Принимайте меры предосторожности для сведения к минимуму продолжительность операции путем тщательного поле подготовки и увлажнения кожи до закрытия для сведения к минимуму шовные индуцированной кожи слезы.
  2. Аккуратно счистить задней брюшной стенки с небольшой марлевый тампон смочить Бетадин. Разрешить Бетадин для просушки на 1 мин.
  3. Сделайте левую середину ключицы 0,5 см разрез непосредственно под грудной клеткой с микро Рассекающий ножницы и пинцет. Аккуратно отделить кожу с помощью щипцов и сделать второй глубже разрез в брюшной полости (см. Рисунок 1 c, центр и слева)
  4. Осторожно приложите боковое давление с обеих сторон с помощью обратно, тупым концами микро Рассекающий ножницы и щипцы заставить Апекс левой доли из брюшной полости живота. Левой вершине левой доли должны быть легко визуализировать (рис. 1 c, право).
  5. От вершины ампутировать и взвесить количество ткани, чтобы быть удалены.
    1. С помощью микро Рассечение ножницами, аккуратно ампутировать нужное количество ткани от верхушки левой доли.
    2. Поместите ампутировали ткани в 1,5 мл, заполнены с PBS. Весят ампутировали ткани с помощью аналитического баланса (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Место кусок Марли или бумаги на баланс и тарных его. Затем поместите ампутировали ткани на марлю или бумаге и измерить его массы.
    3. Исправьте ампутировали области в 2% параформальдегида при комнатной температуре в течение 1 ч и место оптимального раскроя температуры (OCT) соединение над сухого льда замороженной Секции анализа. Анализируйте Замороженные разделы резки 7-10 мкм секциями с помощью любого стандартного криостата.
  6. Аккуратно с помощью рулонных кусок Марли, замените левой доли в брюшной полости. Оставьте марлю в полости до остановки кровотечения.
  7. Снять марлю и влажных хирургической сайта и его окрестностях с марлей, пропитанной с PBS.
  8. Закройте Хирургический сайт с 6-0 мононить, не рассасывающиеся швы с работает стежка. Брюшина и кожи должны быть закрыты отдельно.
    Примечание: Осторожно увлажнения кожи с марлей, пропитанной с PBS может минимизировать шовные индуцированной слезы.
  9. Мягко, но тщательно очистить щенка с марлей, пропитанной с PBS и обеспечить не крови или betadine остается. Roll пропитанной марлевый тампон и аккуратно скраб через рану знак счистить любой крови или betadine.
    Примечание: Это особенно важно, поскольку мать может разделать детенышей, если они очищаются недостаточно.
  10. Удаление щенка из носовой конус и поместите его на области восстановления, который включает марлевые подушечки, подвергаются матери калом и мочой. Как только щенок оправится, замените щенка в пустой клетке матери постельных принадлежностей.
    Примечание: Не используйте тепла лампы. Использование тепла лампы может вызвать новорожденного к перегреву.
  11. Повторите процедуру на желаемое количество детенышей. Хотя все щенки могут использоваться, это вообще целесообразно оставить несколько щенков, не действовали на замене вместе с приводом щенков.
  12. Замените все щенки одновременно с их матери постельное белье в материнской клетке.

4. восстановление и анализ

  1. Следуйте на мышей ежедневно.
    1. Проверьте, что раны остается закрытой и удалять любые мертвых детенышей, если он присутствует.
    2. Если рана возобновляет, подготовьте области хирургической сайта и восстановление как ранее описанных и повторите шаги 3,8 до 3.12.
    3. Придать 5 мг/кг carpofen подкожно 24 и 48 ч после процедуры.
    4. Следуйте щенков для 56 дней или больше.
  2. Усыпить животных после желаемое количество послеоперационных суток воздействия диоксида углерода (CO2) и шейки матки дислокации.
    1. Место мыши в индукции / палата эвтаназии и включите CO2 до мышей остановить дыхание.
    2. Обеспечить эвтаназии шейки матки дислокации. Надавите на спинной шею мыши, используя план палец и большой палец и с другой стороны, потяните вниз на хвост.
  3. Удалите весь печени комплектно и взвесить его.
    1. Осторожно отделить каждый лепесток и весят отдельно.
      Примечание: Удалите печень, тщательное вскрытие диафрагмы и печеночными и портал судов. Отделить долей друг от друга, тщательно рассекает каждого лепестка на проксимальной вложений.
  4. Определите степень регенерации путем сравнения массы ампутировали левую доли массы всей печени. Ранен левой доли составляет приблизительно 30% всей печени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1A детали общая Хронология неонатальной частичной гепатектомии лобулярного (схема на рисунке 1B) и ожидаемую продолжительность времени ожидания до тех пор, пока наблюдается регенерации. Тонкие регенерации левой доли может быть ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Острые травмы печени традиционно была изучена с помощью химических (ацетаминофен, этанол, тетрахлорид углерода), или хирургические модели (70% частичной гепатектомии). Регенеративные ответ после частичной гепатектомии 70% характеризуется привлечь глобальных гепатоцитов гипертрофия и н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы имеют не раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим P. Чу для выполнения H & E и гистология; и C. Wang и A. Маккарти за полезные дискуссии. Поддержка исследования осуществлялась путем финансирования из Вирджинии и D. K. Ludwig Фонд исследований рака; Национальный сердца, легких и крови института (R01HL058770 и U01HL099999); и Калифорнийский институт регенеративной медицины (RC1 00354) гранты на ИУ Y.R. был поддержан премии карьеры развития человека пограничной науки программы (CDA00017), Немецкий исследовательский фонд (ри 2787/1), Институт стволовых клеток Siebel и Томас и Стейси Siebel фонд (1119368-104-GHBJI). СГН была поддержана NIH (T32GM007365), национальной премии службы исследований (1F30DK108561) и пол и Дейзи Сорос стипендий для новых американцев.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
NameCompanyCatalog NumberComments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Equipment
Dissecting microscopeZeissZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissorsVannas72932-01
5SF ForcepsDumont11252-00
Straight Kelly forcepsGrainger17-050G
Heating padSunbeam000771-810-000
IsofluraneAbbott Labs0044-5260-05
Rodent Anesthesia SystemKent Scientific1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cmFisher Scientific13-761-52
NameCompanyCatalog NumberComments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tubeEppendorf22363204
6-0 monocryl suturesEthiconMCP489G
Petri dishFisher ScientificS35839
Pipet-Aid, Plain, 110VDrummond4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical BalancesFisher Scientific01-912-402
Low Cost Induction ChamberKent ScientificSOMNO-0730

Ссылки

  1. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
  2. Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881(1890).
  3. Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
  4. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
  5. Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8(2013).
  6. Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
  7. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  8. Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
  9. Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
  10. Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
  11. Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
  12. Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
  13. Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
  14. Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
  15. Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
  16. Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
  17. Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
  18. Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
  19. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
  20. Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
  21. Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
  22. Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
  24. Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
  25. Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены