إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Summary

وترد أداة وأساليب لإعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة مجهر إلكتروني. أية خطوات ورقة النشاف مطلوبة، وبالتالي تجنب العواقب الضارة وهذا يمكن أن يكون للبروتينات، إلى حد كبير الحد من فقدان عينة وتمكين تحليل خلية مفردة ليساتي البروتيوميات البصرية.

Abstract

نظراً للتقدم التكنولوجي الأخيرة، الميكروسكوب الإلكتروني cryo (cryo-م) سرعان ما أصبح أسلوب قياسي للتحليل الهيكلي للبروتين المجمعات للقرار الذري. ومع ذلك، تظل البروتين العزلة تقنيات وأساليب إعداد نموذج لطب الطوارئ اختناق. عدد صغير نسبيا (100,000 إلى بضعة ملايين) من جزيئات البروتين الفردية بحاجة إلى تصويرها لتحليل البروتينات ذات الدقة العالية بالجسيمات واحد نهج م، مما يجعل عينة المنمنمة التعامل مع التقنيات والمبادئ موائع جزيئية ممكناً.

ويرد المنمنمة، ورقة النشاف خالية من م شبكة إعداد طريقة لتكييف قبل عينة وفتيلة شبكة م ومرحلة ما بعد المعالجة الذي يستهلك فقط نانولتر-حجم العينة. يستخدم الأسلوب الاستغناء عن نظام بدقة نانولتر الفرعية لامتصاص السائل التحكم وفتيلة الشبكة م، ومنصة للتحكم في درجة الحرارة الشبكة وبالتالي تحديد الرطوبة النسبية فوق الشبكة م، واختيار--يغرق-إليه للعينة التزجيج. للبرد-م، يتم وضع شبكة م في مرحلة التحكم في درجة الحرارة ويستنشق العينة إلى شعري. تلميح الشعرية هو المتمركزة بالقرب من سطح الشبكة، يتم تحميل الشبكة مع العينة وفائض يستنشق إعادة إلى ميكروكابيلاري. وفي وقت لاحق، استقر الفيلم عينة وضعفت قليلاً بتبخر المياه التي تسيطر عليها وينظم الإزاحة في درجة حرارة النظام الأساسي بالنسبة نقطة الندى. في نقطة معينة يتم تشغيل إليه اختيار ويغرق، سرعة نقل الشبكة م معبي في الإيثان السائل التزجيج عينة. وبدلاً من ذلك، تتوفر طرق تكييف نموذج إعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة لوصمة سلبية (NS) م.

المنهجيات إلى حد كبير الحد من استهلاك عينة وتجنب النهج يمكن أن تكون ضارة للبروتينات، مثل النشاف ورق الترشيح المستخدمة في الطرق التقليدية. وعلاوة على ذلك، يسمح كمية ضئيلة من العينة المطلوبة استراتيجيات تجريبية الرواية، مثل عينة سريعة التكييف، مع تحلل الخلايا المفردة ل "البصرية البروتيوميات"، أو "ضياع" إعداد العينة الإجمالية للتحليل الكمي نماذج معقدة.

Introduction

الأجهزة والبرامج للتحليل الهيكلي للبروتين المجمعات مجهر إلكتروني (TEM) تقدما هائلا خلال السنوات الأخيرة. التحسينات التي أدخلت على مهد الطريق إلى "قرار ثورة"^1،2 ، وتغيرت جذريا الهيكلي للبحث. وبدأت الثورة مع ظهور البرد-إلكترون مجهرية (cryo-م)^3،4، مما يتيح إعداد العينات البيولوجية تحت قريبة من الظروف الفسيولوجية في حين تناقص الحساسية الإشعاعية ومنع تبخر العينة في فراغ عالية من المجهر الإلكتروني انتقال⁵. في السنوات التالية، وزيادة التقدم التكنولوجي المتزايد تدريجيا أن القرار قابل للتحقيق. وكان من بين هذه الابتكارات تطبيق المدافع الميدانية-الانبعاثات^6،7، وفي الآونة الأخيرة، تحسنت خوارزميات تحليل البيانات، مثل الحد الأقصى لاحتمال أساليب^8،9. إلكترون مباشرة كاشف كاميرات^10،11،،من¹²¹³، تصوير فيلم-الوضع ومصاحبة البرمجيات التطورات^{14،15، 16 ,} قدم ¹⁷، اختراق النهائية المطلوبة لتحقيق القرار الذري للعينات البيولوجية بتحليل الجسيمات واحد (لأنظر استعراض تشنغ، جريجوريف, et al. ¹⁸)-أهمية cryo-م اعترف مؤخرا بمنح جائزة نوبل للكيمياء لثلاثة من الرواد.

الصورة في عينة بيولوجية من تيم، الطريقة المستخدمة في تحميل الشبكة م مع العينة (يشار إليها فيما بعد "إعداد الشبكة") يجب أن تضمن توفير طبقة العينة الناتجة (ط) رقيقة ما يكفي (< 100 nm) تجنب الضوضاء واسعة بغير مرن أو ضرب المتناثرة الإلكترونات، (ثانيا) يقاوم الفراغ عالية من المجهر الإلكتروني، ويحمي (الثالث) الجزيئات الحيوية من أضرار الإشعاع. وتستخدم اثنين من الأساليب الرئيسية للوفاء بهذه التحفيزية: وصمة سلبية(NS)^19،20 الإجراءات (الشكل 1أ) الجسميات العينة لفيلم الكربون رقيقة، وتضمين الجزيئات الحيوية في المعادن الثقيلة غير متبلور، ثم السماح للجمعية لتجف في الهواء. هذا بسيط وسريع، والشبكات م تحميل (يشار إليها فيما بعد "نموذج الشبكات") سهلة لتخزين ويمكن أن تبقى لفترات طويلة من الزمن (عادة السنوات). في تيم، الأعمال التحضيرية معرض عالية التباين بسبب NS وتتسامح مع الجرعات إلكترون من البرد-الأعمال التحضيرية، ولكن القرار يقتصر على حوالي 20 Å Cryo-م إجراءات تدعم (الشكل 1ب) توظيف الكربون المخرمة. طبقة رقيقة من الحل عينة وامتدت عبر الثقوب والشبكة م وسقطت في كريوجين، الإيثان السائل عادة، لتهدئة سرعة أنها أقل-150 درجة مئوية. والنتيجة غير متبلور، الشركة إنتاج، 50 إلى 100 نانومتر سميكة السينمائي للحل في الثقوب الدعم. هذا الفيلم رقيقة، غير متبلور يقاوم الفراغ عالية في المجهر الإلكتروني، وفي الحالة المثالية، يحافظ على الهياكل البيولوجية في حالتها الأصلية. الإجراء الذي يسمح للعينات البيولوجية تصويرها في الاستبانة. ومع ذلك، الشبكة عينة يجب الاحتفاظ في درجات الحرارة أدناه-150 درجة مئوية في جميع الأوقات لتجنب ديفيتريفيكيشن. فإنه يمكن تصويرها باستخدام جرعات الإلكترون عالية نسبيا بسبب درجة الحرارة المنخفضة، ولكن على النقيض ومع ذلك نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة. ولذلك، تستخدم تقنيات حساب المتوسط لزيادة التباين، وشريطة أن يتم تصويرها العينة من زوايا مختلفة، ويمكن إعادة بنائها مخطط ثلاثي الأبعاد (3D) عالية الدقة. الأكثر شيوعاً وهي طريقة ناجحة للغاية للتعمير 3D حتى الآن النهج الجسيمات واحد. لاستعراض أجرى مؤخرا، راجع تشنغ في al.¹⁸.

وصمة سلبية تيم (م-م) مهم لفحص ومراقبة الجودة، وعند الحاجة إلى عالي التباين، أو عندما تتوفر كميات محدودة فقط من عينة (الامتزاز بالكربون الفيلم يركز عموما العينة). واحد الجسيمات cryo-م هو الأسلوب معيار الذهب إذا كانت تستهدف إعادة البناء ثلاثي الأبعاد عالية الدقة لهيكل البروتين ل.

الشكل 1: إعداد الشبكة "مبادئ تيم" والمقارنة بين نهج موائع جزيئية (لوحة ج، د) والكلاسيكي (لوحة أ، ب). A) م NS الكلاسيكية إعداد الشبكة: هي بيبيتيد عن 3 ميليلتر من العينة باليد على شبكة م مغطاة بفيلم الكربون مستمر (يشار إليها فيما بعد شبكة NS-م) (ط). بعد حضانة لما يقارب 10 ق، ورق الترشيح يستخدم للطخة بعيداً من السائل الزائد من الجانب (ثانيا)، ترك في الممتزة الجزيئات الحيوية في فيلم مياه رقيقة. وفي وقت لاحق، هو المحتضنة البروتين في الحل الملح المعادن الثقيلة، مثلخلات اليورانيل 2%، مقابل 20 s (ثالثا)، ومرة أخرى السائل يتم إزالة بواسطة النشاف من الجانب باستخدام ورق الترشيح (رابعا). وأخيراً، يتم ترك م-الشبكة لتجف في الهواء. ب) م البرد الكلاسيكية إعداد الشبكة: هي بيبيتيد عن 3 ميليلتر من العينة يد على فيلم الكربون المخرمة. تشكيل فيلم عينة رقيقة، تتم إزالة السائل الفائض من الورق النشاف الوجه-على من أحد أو كلا الجانبين (ثانيا). وأخيراً، سقطت الشبكة سرعة الإيثان السائل التزجيج (ثالثا). ج) NS-م إعداد الشبكة باستخدام الإعداد كريووريتير: nL 5 ألف وحدة التخزين ويستنشق من المخزون العينة باستخدام ميكروكابيلاري (ط). لتكييف عينة، هو مغمورة نصيحة ميكروكابيلاري في الحل تكييف، مثلاً، خلات الأمونيوم 2%. ويتم تبادل الأيونات والجزيئات الصغيرة التي نشرها (ثانيا). علما بأن أبعاد ميكروكابيلاري ضمان أن العملية برمتها نشر مدفوعة. البروتينات كثير ثوابت نشر أقل من أيونات الملح وهي لم تفقد إلى حد كبير²⁴. وأخيراً، العينة المتوافرة على الشبكة ويسمح الجاف (ثالثا). د) مبادئ cryo-م إعداد الشبكة باستخدام الأسلوب القائم على كريووريتير: الشبكة EM مغطاة بفيلم المخرمة الكربون هو وضعها على سطح منصة التحكم في درجة الحرارة وعقدت بملاقط. يتم التحكم في درجة الحرارة من المنصة في إزاحة من درجة حرارة نقطة الندى لبيئة الشبكة. يتم نقل الشبكة بالنسبة ميكروكابيلاري التي تحتوي على العينة وخفضت ميكروكابيلاري حتى يتم عدد قليل ميكرومتر أعلاه الشبكة. وفي وقت لاحق، الاستغناء نانوليتيرس عدد قليل من عينة منه بينما يتم نقل المرحلة في نمط دوامة؛ السائل الزائد إعادة يستنشق (ط). بعد م الشبكة فتيلة، يتم سحب ميكروكابيلاري وتظل الشبكة على منصة التحكم درجة الحرارة (المشار إليه فيما بعد مرحلة نقطة الندى (DP)) لفترة قصيرة للسماح لكمية التي تسيطر عليها من العينة تتبخر. ليغرق تجميد، الشبكة سرعة انسحبت من مرحلة استخدام الملقط (ثانيا)، وانقلبت 90 ° إلى الموضع العمودي، وسقطت في حمام كريوجين (iii) (يشار إليها فيما بعد إليه 'بيك ويغرق'). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ولسوء الحظ، أساليب إعداد الشبكة يستخدم NS والبرد-م لم تتحسن إلى حد كبير نظراً لأنها اخترعت. العيوب الحالية هي استهلاك عينة عالية (حوالي 3 ميليلتر من البروتين 1 ملغ/مل) وخسرت مبلغ كبير (> 99%) من عينة (الشكل 1أ، ب). وعلاوة على ذلك، الطريقة الكلاسيكية التي استخدمت لإعداد شبكات للبرد-م إجراءات قاسية للبروتينات: أولاً، أنها تنطوي على واسعة الوجه على ورق النشاف خطوة (الشكل 1ب، والثاني)، وثانيا، يتعرض البروتين إلى واجهة الهواء والماء قدرا كبيرا من الوقت²¹. هنا، يرد أسلوب بديل لنموذج قبل التكييف، نموذج الشبكة إعداد وتجهيز (شبكة التجفيف أو التزجيج) NS-م (الشكل 1ج) أو البرد-م (الشكل 1د). يستخدم برنامج الإعداد بني داخلية، تسمى "كريووريتير"، عينة المنمنمة التعامل مع التكنولوجيا وموائع جزيئية مبادئ نضح، الشرط والاستغناء عن عينة، تجنب الورق النشاف تماما، وتوفير طرق بديلة لعينات رقيقة م البرد. أنها إلى حد كبير يقلل من الاستهلاك عينة ويحسن عنصر تحكم المستخدم على إعداد العينة ككل. وعلاوة على ذلك، يسمح الأسلوب رواية تطبيقات تجريبية؛ مثل إعداد المكونات البيولوجية معزولة من خلايا فردية في إطار نهج يسمى "خلية مفردة البروتيوميات البصرية"^22،،من^2324،25.

Protocol

"كريووريتير" (الشكل 2؛ وانظر التفاصيل السابقة العمل^24،،من²⁶²⁷) أو ما يعادل الأجهزة مطلوب للبروتوكولات التالية. وترد قائمة بالموردين للأجزاء الرئيسية والمواد الاستهلاكية في الجدول للمواد.

1-السلبية إعداد الشبكة وصمة عار (NS)

1. قم بتشغيل الأداة وبدء تشغيل البرنامج. تهيئة جميع الوحدات اللازمة (المحقن مضخة تحكم ومراحل الآلية وكاميرات المراقبة ومرحلة نقطة الندى).
2. كول دعم عينة ومرحلة نقطة الندى. إذا لزم الأمر، تأكد من أن ينظم درجة حرارة نقطة الندى المرحلة 1-2 درجة مئوية فوق نقطة الندى.
   ملاحظة: يتم تبريده المرحلة بجهاز بلتيير تجارية مع وحدة تحكم PID.
3. إعداد NS بتعبئة من 100 أو 200 ميليلتر بكر أنبوب مع 100-150 ميليلتر من NS (مثلاً، المتاحة تجارياً تنغستات ميثيلاميني 2%). ضع الأنبوب على دعم تبريد عينة من الصك.
4. موقف العينة.
   1. وضع العينة (0.5-1 ميكرومتر) في أنبوب بكر ميليلتر 100 أو 200. إذا كان أقل من 50 ميكروليتر من عينة متوفراً، قطع الجزء السفلي من أنبوب PCR مع شفرة حلاقة واستخدامها كعينة بشكل جيد. وهذا سيضمن أن ميكروكابيلاري ويمكن الوصول بسهولة إلى العينة.
      ملاحظة: فمن الأسهل نضح عينات من 100 أو 200 أنابيب PCR ميليلتر، نظراً لأن ميكروكابيلاري استخدامها في وقت لاحق نضح العينة هو يميل قليلاً واتجاه محور ع السفر-ارتفاع محدود.
   2. مكان بكر الأنبوب/الحاوية على دعم تبريد العينة في الصك لمنع التبخر. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يستنشق عينات من لوحات جيدا في مرحلة مجهر الحاضنة أعلى في درجة حرارة الغرفة؛ لم يتم تطبيق التبريد للوحات جيدا.
5. تحديد المواقف. استخدام جويستيك كريووريتير الذي يتحكم في مرحلة xy يجهز وأزرار التحكم في البرمجيات لخطى x، y-، ومحور ع مراحل لتحديد موضع في ميكروكابيلاري. استخدام الكاميرا للتحقق من موقف شعري.
   1. الانتقال ميكروكابيلاري إلى الخزان عينة. تزج نصيحة في عينة السائل وحفظ هذا الموقف "عينة".
   2. الانتقال ميكروكابيلاري إلى أنبوب NS PCR وتزج نصيحة في الحل NS وحفظ هذا الموقف "وصمة عار".
   3. ضع ميكرومتر تقريبا 100 ميكروكابيلاري أعلاه وسط الفتحة حيث سيتم وضع الشبكة م وحفظ هذا الموقف "grid_save".
6. نضح عينة وحالة فإنه ل NS-م.
   1. إذا لم تكن بالفعل تثبيت، جبل حقنه 10 ميليلتر (0.46 مم القطر الداخلي) على مضخة الحقن دقة.
   2. الصق نهاية واحد 30 سم ميكروكابيلاري طويلة فوسيد السليكا (القطر الخارجي 360 ميكرومتر، القطر الداخلي 150 ميكرومتر) إلى منفذ المحاقن.
   3. الاتصال ميكروكابيلاري نهاية ميكروكابيلاري لفترة قصيرة (5 سم) طويل مدبب الأخرى عبر موصل تتناسب مع الصحافة. أشكال طرف مدبب ميكروكابيلاري قصيرة الحافة الاستغناء عن.
   4. ملء المحاقن مع يطرد مزدوجة المقطر المياه (ddH₂س؛ نظام السائل)، وتجنب تكوين فقاعات الهواء.
   5. الاستغناء عن بضع عشرات من نانوليتيرس السائلة النظام وإزالة أي قطرات من ميكروكابيلاري مع أنسجة خالية من الوبر.
   6. انقر نقراً مزدوجاً فوق موضع العينة المحفوظة. هذه المواقف في ميكروكابيلاري في العينة جيدا. حين تتحرك الشعرية، الاستغناء عن 3 × 0.5 nL السائل النظام قبل تلميح ميكروكابيلاري هو منغمسين في العينة لمنع فقاعة هواء من الوقوع هناك (انظر الملاحظة 2 أدناه).
   7. NL أسبيراتي 5 من عينة.
   8. انقر نقراً مزدوجاً فوق موضع NS المحفوظة. ميكروكابيلاري سحب من حاوية العينة ونقلها إلى خزان NS تلقائياً. حين تتحرك الشعرية، الاستغناء عن يدوياً 3 × 0.5 nL من عينة السائل قبل مغمور في التلميح إلى الخزان للتأكد من أن هناك لا الهواء فقاعات (انظر الملاحظة 2 أدناه).
      ملاحظة: هام: (1) عند التبديل من التطلع إلى الاستغناء عن وضع أو العكس بالعكس، هناك خسارة صغيرة في السكتة الدماغية مكبس الواجب رد فعل في التروس مضخة الحقن. ووفقا للشركة المصنعة، يكمن رد فعل عنيف من وحدة جديدة بين 7 و 12 ميكرومتر. لحقنه لدينا يبلغ قطرها برميل 0.46 ملم، وهذا يترجم إلى هولندا 1-2. ولذلك، nL 1-2 يمكن أن يكون "الاستغناء عن"، قبل عينة هو الاستغناء عن الواقع. عادة، يبدأ قطرات صغيرة للخروج من طرف ميكروكابيلاري بعد 0.5 الثالثة nL الاستغناء عن الخطوة. (2) حدوث فقاعة هواء المحاصرين أعلاه/أدناه العينة يجعل الاستغناء عن أقل دقة ومنع تكييف نموذج قبل نشرها.
   9. ترك ميكروكابيلاري مغمورة لمدة دقيقة 3-12، اعتماداً على عينة المخزن المؤقت والهندسة فوهة.
      ملاحظة: ارتفاع الملح و/أو فوسفات التركيز في المخزن المؤقت، ويعد الوقت الغمر المطلوبة. (بسرعة نسبيا) ينشر NS في سد عينة بينما الأملاح المخزن المؤقت (سريعة نسبيا) والبروتين (أبطأ بكثير) منتشر خارج. وهذا يقلل من تركيز الأملاح المخزن المؤقت في العينة منعهم من بلورة عندما يجف تحميل الشبكة. علاوة على ذلك، يميل الفوسفات لتشكيل متسرعا في تركيبة مع NS.
7. إعداد شبكة وإيداع بقعة من العينة مكيفة.
   1. بينما يجري مشروطة العينة، تأخذ قطعة من شريط لاصق وكتلة PDMS وتنظيف الجانب العلوي PDMS عن طريق تطبيق وإزالة الشريط اللاصق التأكد من أنه لا يوجد أي الغبار. وضع كتلة PDMS طبق بيتري.
      ملاحظة: كتل PDMS جديدة مأخوذة من غرفة نظيفة.
   2. تلتقط بدقة شبكة (مثلاً، الاتحاد الجمركي، ومش 200 أو 400 المغلفة مع الفيلم بارلوديون/ج). تأكد من لمس فقط على حافة الشبكة مع الملقط. وضعه على كتلة PDMS نظيفة مع الفيلم الكربون التي تواجه صعودا.
   3. مكان كتلة PDMS مع الشبكة بوحدة وهج-تفريغ الهواء وتوهج الوفاء ل 20 ق مع 100 W السلطة على 0.4 [مبر]. تخزين الشبكة في طبق بتري مغلقة. توهج التفريغ أوقات أطول عموما يؤدي إلى انتشار أكبر من حجم العينة المودعة في الشبكة. نتيجة لذلك يصبح أرق طبقة وصمة عار (وصمة عار الأضعف).
   4. 1 دقيقة قبل الوقت الغمر، فهم الشبكة خرج توهج مع ملاقط كريووريتير. تأكد من تشغيل المغناطيس الكهربائي؛ وإلا قم بتشغيله في البرنامج. جبل الملاقط على المغناطيس الكهربائي واستخدام المسمار ميكرومانيبولاتور اليدوي لمحاذاة الشبكة شقة في مرحلة نقطة الندى، الكربون الفيلم الجانب الأعلى. تأكد من أن ينظم درجة حرارة نقطة الندى المرحلة 1-2 درجة مئوية فوق نقطة الندى الحد من معدل التبخر بعد تحميل نموذج.
   5. عندما يحين الوقت الغمر أعلى، انقر نقراً مزدوجاً فوق "grid_save". نصيحة ميكروكابيلاري سوف توضع فوق سطح الشبكة بأمان. إحضار تلميح ميكروكابيلاري اتصال مع الشبكة يدوياً. رفع الفوهة من 10 ميكرون ووضعه فوق المركز.
      تنبيه: وتميل بعض العينات التي تحتوي على المنظفات تحريك لأعلى على طول السطح الخارجي ميكروكابيلاري عندما يتم الاستغناء عن السائل بسبب التوتر السطحي أقل. من المهم أن تكون جداً قريبة من السطح الشبكة لمنع مثل هذه الخسائر.
   6. الاستغناء عن 5 nL عينة على الشبكة. في يوم جاف، عندما يحدث التبخر السريع على طرف ميكروكابيلاري، واحد ببطء أيضا الاستغناء عن حتى تكون العينة في تلميح جداً، وثم بسرعة الاستغناء عن 5 nL.
   7. سحب ميكروكابيلاري واسمحوا مكيفة العينة الجافة ببطء على مرحلة نقطة الندى (DP-المرحلة).
   8. مرة واحدة قد جفت الحال عينة، إزالة الشبكة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في مربع شبكة أو طبق بيتري.
   9. الاستغناء عن 500 nL السائل النظام من ميكروكابيلاري وإزالته مع أنسجة خالية من الوبر. تدفق شعري 5 مرات مع أما الإيثانول أو المنظفات أو 1 م هيدروكسيد الصوديوم. وهذا ينظف ميكروكابيلاري يسمح لها بأن تستخدم مع عينة مختلفة.

2-إعداد الشبكة البرد

1. لإعداد الصك وعينه، اتبع الخطوات 1.1 إلى 1.5 الموصوفة أعلاه. إذا كان غير مطلوب NS، تجاهل الخطوات 1.3 و 1.5.2. تبادل المخزن المؤقت الذي عينة أو شرط العينة للبرد-م بالغسيل الكلوي، مثلاً، خفض تركيز المخزن المؤقت الأملاح أو إدخال إضافات (مثلاً، تريهالوسي، والمنظفات) استخدام المخزن المؤقت المطلوب بدلاً من NS في الخطوات 1-3 و 1.5.2.
2. تحضير الإيثان السائل في حاوية قياسية من البرد.
   1. تجميع كأس الإيثان، حامل مربع البرد، والعنكبوت، وتعبئة الحاوية كريوجين مملوءة بالنيتروجين السائل؛ وعادة ما يتطلب حوالي 200 مل. انتظر لبضع دقائق حتى يبرد بكأس الإيثان وخال من النتروجين السائل.
   2. فتح زجاجة غاز الإيثان واسمحوا تيار الغاز ببطء في كوب الإيثان. وليكن ملء مع الإيثان السائل حتى يصبح المستوى 2-3 مم أدناه الجزء العلوي؛ وهذا يستغرق بضع دقائق، ويتطلب حوالي 5 مل من سائل الإيثان.
   3. مربع البرد ووضعه في فتحه مجاناً في الحاوية كريوجين.
   4. إزالة العنكبوت ووضع غطاء بوليستيرول على أعلى ومكان الحاوية كريوجين على المتصاعدة في كريووريتير.
3. توهج أداء شبكة م.
   1. يأخذ قطعة من شريط لاصق وكتلة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، وتنظيف الجانب العلوي PDMS بتطبيق وإزالة الشريط اللاصق (يزيل أي الغبار). وضع كتلة PDMS طبق بيتري.
   2. بعناية اختيار شبكة من مربع الشبكة. تأكد من لمس فقط على حافة الشبكة مع الملقط. وضعه على كتلة PDMS نظيفة مع الفيلم الكربون المخرمة التي تواجه صعودا.
   3. المكان PDMS كتلة مع الشبكة في بلازما أنظف والبلازما-تنظيف سطح الشبكة (مثل استخدام 75% Ar/25% ح_2، السلطة 50 ث، متور الضغط 25). وضع كتلة PDMS مع الشبكة خرج توهج في طبق بتري.
4. موقف الشبكة في الصك
   1. فهم الشبكة خرج توهج مع ملاقط كريووريتير. تأكد من تشغيل المغناطيس الكهربائي؛ وإلا قم بتشغيله في البرنامج. جبل الملاقط على المغناطيس الكهربائي واستخدام المسمار ميكرومانيبولاتور اليدوي لمحاذاة الشبكة شقة على المسرح، والكربون الفيلم الجانب حتى.
   2. انقر نقراً مزدوجاً فوق "grid_save". ضبط موضع ميكروكابيلاري حيث يكون التلميح حوالي 10 ميكرون فوق سطح الشبكة. تأكد من أن ميكروكابيلاري يمكن أن تتحرك بحرية عبر الشبكة دون لمسها في أي مكان، إذا كان ضروريا سحب ميكروكابيلاري عدد قليل ميكرومتر.
   3. العودة إلى مركز الشبكة وحفظ الموضع الجديد ك "الشبكة".
      تنبيه: التسمية الصحيحة إلزامية للبرنامج النصي الكلي للعمل.
5. كتابة شبكة عينة وتجميد يغرق.
   1. تدفق ميكروكابيلاري مع بضع عشرات من نانوليتيرس السائلة النظام وإزالة أي قطرات من ميكروكابيلاري مع أنسجة خالية من الوبر.
   2. بدء تشغيل البرنامج النصي ماكرو. سيتم تنفيذ الماكرو بالخطوات التالية:
      1. الاستغناء عن 5 nL (لإزالة أي فقاعات الهواء في الطرف) والذهاب إلى الموضع عينة.
      2. NL aspirate 65 من عينة. يبث 5 nL العودة إلى أنبوب عينة. رد فعل هذه الحسابات للنظام والسماح بالكتابة المتزامنة، أي.، لضمان أن الاستغناء ومرحلة بدء الحركة في نفس الوقت.
      3. الانتقال إلى الموضع "الشبكة".
      4. بدء 'نمط الكتابة'، الذي سوف يتسبب ميكروكابيلاري للانتقال عبر الشبكة، في الوقت ذاته الاستغناء عن 45 nL عينة.
      5. بعد ذلك، نقل ميكروكابيلاري مرة أخرى إلى مركز الشبكة، أقل أنه آخر 10 ميكرون، وسحب السائل الزائد عينة.
      6. سحب ميكروكابيلاري وإيقاف المغناطيس الكهربائي. هذا النشرات يغرق ملاقط ويبدأ التجميد.
6. قبضة الملاقط والإصدار المحول المغناطيسي من المكبس بعناية. بسرعة نقل الشبكة من كأس الإيثان في الوعاء كريوجين التي تحتوي على مربع البرد ومكان الشبكة في فتحه مجاناً.

3-خلية واحدة ليستي إعداد

1. تعد ميكروكابيلاريس انهانسر.
   ملاحظة: ميكروكابيلاريس والسليكا فوسيد (سحبت الليزر وتفتيش) مدبب لها طلاء بوليميد حماية إلى الخارج، باستثناء تلميح، حيث يتم حرق الطلاء أثناء عملية مستدق.
   1. معطف ميكروكابيلاريس مع طبقة موصلة، يشن منها بزاوية مقدارها 45 درجة على السكك الحديدية معدنية، مع نصائح إلى الأعلى. استخدام رقائق ألومنيوم لدرع نهاية الدنيا (2 سم) من النصائح، حيث يشكل بوليميد غير المصقول ختم أفضل مع موصلات تناسب صحفي يعمل في وقت لاحق.
   2. الرش إيداع طبقة لزجة من 20 نانومتر Ti/ث، وثم طبقة سميكة شمال البحر الأبيض المتوسط 200 نقطة.
2. تقديم نصيحة ميكروكابيلاري مسعور.
   1. إعداد حل م 1 من 1-دوديكانيثيول في EtOH.
   2. توهج التفريغ ميكروكابيلاري في الهواء لمدة 1 دقيقة مع 100 W السلطة على 0.4 [مبر].
   3. تزج غيض ميكروكابيلاري في الحل م 1 من 1-دوديكانيثيول لبضع ساعات (من الناحية المثالية بين عشية وضحاها).
      ملاحظة: من الأفضل إعداد نصائح طازجة يوم واحد قبل الاستخدام.
3. قم بتثبيت ميكروكابيلاري جديدة.
   1. إزالة ميكروكابيلاري من الحل 1-دوديكانيثيول وشطف الخارج مع الإيثانول ومطاردة الداخل مع الإيثانول باستخدام المحاقن.
      ملاحظة: في حالة توفر لا ميكروكابيلاريس فونكتيوناليزيد، بسرعة توهج أداء غيض من ميكروكابيلاري وتراجع ذلك في انخفاض السيارات التجارية النافذة في المعاملة، التي مزيج من PDMS وحمض الكبريتيك. الروغان مسعور الناتجة ليست جيدة كما هو الحال مع 1-دوديكانيثيول، ولكن عموما كافية.
   2. تنشق نهايته غير المصقول مع قطع شعري.
      ملاحظة: قطع نظيفة المهم ختم جيدة مع موصل تناسب الصحافة.
   3. استخدام مسواك لتطبيق لصق الفضة على الحدود حادة عندما أحرق الطلاء بوليميد بالليزر أثناء سحب الشعرية شكلت بين الزجاج وطلاء بوليميد.
      ملاحظة: هذا التعزيز ضروري كطلاء Pt ضعيف جداً في هذه المنطقة، ويمكن بسهولة لكسر التوصيل الكهربي.
   4. أغسل بوليميد نهاية ميكروكابيلاري مع الأسيتون. اترك قطره صغيرة من الأسيتون في النهاية وأدخله في فتحه موصل تناسب الصحافة. تطبيق الضغط الخفيف شكل ختم جيدة.
4. معايرة موقف ميكروكابيلاري.
   1. قم بتشغيل الأداة وبدء تشغيل البرنامج كما هو موضح في الخطوة 1، 1. بالإضافة إلى ذلك، تتم تهيئة الكاميرا مجهر ومولد الدالة.
   2. ضع شريحة الميكروسكوب زجاجية في حامل الشريحة في المجهر.
   3. أقل ميكروكابيلاري القرب من الشرائح الزجاجية ومركز على هدف مجهر حتى أنه يظهر في عرض الكاميرا المجهر. استخدام مراحل الخطية المحور x و y لموقف غيض من ميكروكابيلاري في مركز الصورة. ثم ببطء أقل التلميح حتى أنها قليلاً يلامس الشريحة الزجاجية.
      تنبيه: اختر خطوات صغيرة جداً (5 ميكرون) نحو النهج النهائي. وبخلاف ذلك، يمكن أن تتلف الحافة.
   4. اضغط على زر "معايرة فوهة". هذا يسحب ميكروكابيلاري 40 مم، ومجموعات وهذا موقف كموقف الصفحة الرئيسية.
5. إعداد مختومة وقطع PDMS إيتو الشرائح
   1. مزيج PDMS وكروسلينكير بنسبة 10:1، وتصب في طبق بتري كبيرة بعمق من حوالي 2-3 ملم. خبز عند 60 درجة مئوية لبضع ساعات في التهجين حاضنة أو الأجهزة المماثلة.
   2. مع مطرقة وختم (12 مم)، قطع ثقوب في طبقة PDMS. وبعد ذلك استخدام مشرط لقطع 2 سم طويلة المربعات أو المستطيلات بما في ذلك الثقوب للحصول على ختم من القطع التي تناسب على شريحة مجهر. عادة، يتم تحميلها قطعتين ختمها على شريحة المجهر واحد.
   3. تغسل القطع PDMS والشرائح إيتو مع المنظفات أولاً ثم مع الإيثانول 70%. مكان لهم، الرطب، في طبق بتري واسمحوا الإيثانول الكامل تتبخر في فرن عند 60 درجة مئوية.
   4. وهج-تصريف الشرائح إيتو لمدة 1 دقيقة مع 100 W السلطة على 0.4 [مبر] ومن ثم تطبيق 1 مل من محلول طلاء (مثلاً، بولي-L-يسين (PLL)). احتضان لمدة 5 دقائق وإزالة الحل مع ماصة، وتطبيق 1 مل ddH₂"سين قليلاً" تحرض لمدة 1 دقيقة، ثم قم بإزالة ddH₂س استخدام ماصة. واسمحوا الشرائح الجافة عند 60 درجة مئوية.
6. إعداد ثقافة الخلية. اتبع خلية تمسكا تثقيف بروتوكول قياسي (مثلاً، أرنولد، et al. ^{24 , 25})-بذور الخلايا على إيتو أثناء تشغيل تقسيم باساجينج العادية.
   1. تأخذ شريحة طازجة مغلفة PLL إيتو وإضافة قطعة PDMS. تطبيق بعض الضغط لتشكيل ختم محكم. تنتج هذه الآبار الصغيرة مع الشريحة كقاعدة لهم.
   2. إضافة حوالي 300 ميليلتر من الخلايا التي علقت في المتوسط الطازجة إلى الآبار PDMS. ينبغي أن تكون كثافة بذر خلايا حوالي 75,000 كل بئر.
   3. احتضان الشرائح إيتو لمدة 1-2 يوما تحت الظروف القياسية.
7. الاستعداد لتجربة تحلل الخلية:
   1. قبل الحارة قليلة ملليلتر من المخزن المؤقت انهانسر (مثلاً، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)).
   2. إعداد إعداد إعداد الشبكة NS-م
      ملاحظة: يبين تفاصيل عن إعداد الإنشاء خطوات 1.1-1.5 (NS) أو خطوة 2.1-2.4 (للبرد). هنا يصف لنا أهم الخطوات لإعداد NS.
      1. إعداد NS بتعبئة من 100 أو 200 ميليلتر بكر أنبوب مع 100-150 ميليلتر من NS (مثلاً، المتاحة تجارياً تنغستات ميثيلاميني 2%). ضع الأنبوب على دعم تبريد عينة من الصك.
      2. الانتقال ميكروكابيلاري إلى أنبوب NS PCR وتزج نصيحة في الحل NS وحفظ هذا الموقف "وصمة عار".
   3. تحميل المعلمات تحلل القياسية، مثلاً، الجهد تحلل.
   4. تأخذ الشريحة إيتو من الحاضنة وجبل على إدراج المجهر. استخدام مسامير اثنين لإصلاح الشريحة على إدراج الألومنيوم، وتأمين الاتصال الكهربائي بين إيتو طلاء من الشريحة والإطار الألومنيوم كهربائياً على الأرض.
   5. إزالة مستنبت الخلية ويغسل مرتين مع 300 ميليلتر انهانسر المخزن المؤقت. إبقاء الخلايا في انهانسر المخزن المؤقت.
   6. مكان إدراج الألومنيوم عقد الشريحة إيتو في المرحلة حاضنة خلية يعيش في برنامج الإعداد.
   7. موقع ثقافة الخلية في عرض مجهر واختيار منطقة مع أي من الخلايا. نهج في التلميح إلى السطح إيتو ولطف لمسها، ثم سحب ميكرومتر 100 نصيحة وحفظ منصب "الخلايا".
   8. بسرعة ترك ثقافة الخلية وتدفق نصيحة ميكروكابيلاري مع بضع عشرات من نانوليتيرس من نظام السائل ثم وضعه في ثقافة الخلية مرة أخرى. الاستغناء عن نانوليتيرس قليلة خلال الانغماس في البئر PDMS للتأكد من أن لا يوجد هواء فقاعات محاصرون في التلميح.
   9. التعامل برفق سطح إيتو (في البداية، يجب أن تكون في موقف "خلايا"، أي.، 100 ميكرون فوق السطح). عند الاتصال، تتراجع تلميح 10 ميكرون.
   10. حدد خلية مجاورة لتحلل. مكان غيض ميكروكابيلاري الموجود بأعلى الخلية المستهدفة.
8. بدء تشغيل البرنامج النصي الكلي لتحلل الخلايا المفردة.
   1. اسم موضع ميكروكابيلاري ينبغي أن تنقل إلى بعد تفكيك خلية قد تم بنجاح. وسيكون هذا الخزان نانوثانية (NS-م)، مخزن مؤقت ديسالتينج (cryo-م) أو الشبكة م (cryo-م). تجنب الأخطاء الإملائية واضغط "موافق".
   2. عائدات الماكرو دون تدخل من قبل المستخدم:
      1. ط) ميكرومتر الثقافة 100 المرحلة والخلية المجهر يتم نقلها إلى اليسار، ولقطة من الخلية المستهدفة يتم الاستغناء عن nL المتخذة، و 50 ddH₂س نظام السائل من ميكروكابيلاري. وهذا يزيح ويميع المخزن المؤقت الملح عالية وينطبق الضغط الاسموزي للخلية.
      2. الثانية) المرحلة التي عادت إلى موقف التلميح أعلى الخلية المستهدفة مرة أخرى. يتم تطبيق انفجر الجهد المعرفة مسبقاً، وبعد 500 مللي يبدأ النظام بمضخة لنضح 3 nL عينة بمعدل تدفق 2 ميليلتر/دقيقة.
      3. الثالثة) المرحلة التي يتم نقلها إلى اليسار مرة أخرى، يسمح للخلية المراد تفتيشها. تظهر نافذة، تسألك عن إدخال المستخدم.
   3. القول ما إذا كانت الخطوة تحلل ناجحة أم لا.
      1. إذا كانت الإجابة لا، تولي، ومطاردة في ميكروكابيلاري واستهداف خلية جديدة.
      2. إذا كان الجواب بنعم، أخذ لقطة من الخلية () تمت إزالتها، وبعد ذلك يتم نقلها ميكروكابيلاري إلى الموقع المحدد في 3.8.1. إذا كان هذا هو NS أو خزان المخزن مؤقت، استخدام واجهة المستخدم القياسية للاستغناء عن 3 × 0.5 يتحرك nL السائل في حين ميكروكابيلاري ضمان عدم وجود لا فقاعات الهواء. التلميح مغمور في السائل خزان الماكرو.
         ملاحظة: يمكنك متابعة حالة العينة وإعداد الشبكات كما هو موضح في المقاطع 1.6.9-1.7.9 NS-EM أو القسم 2.2-2.6 للبرد-م. ويرد أدناه، الخطوات اللازمة لإعداد شبكة NS.
   4. ترك ميكروكابيلاري مغمورة مدة 8-12 دقيقة، اعتماداً على هندسة فوهة
      ملاحظة: يتطلب تركيز عالية من الفوسفات في المخزن المؤقت لغمر وقتاً أطول لتكييف.
   5. الاستغناء عن 5 nL الخلية مكيفة على الشبكة.
   6. سحب ميكروكابيلاري وينظم السماح مكيفة العينة الجافة ببطء في مرحلة نقطة الندى (DP-المرحلة) 1-2 درجة مئوية فوق درجة حرارة نقطة الندى.
   7. إزالة الشبكة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في مربع شبكة أو طبق بيتري.

النتائج

تم تطوير برنامج الإعداد "كريووريتير" (يصور في الشكل 2) بغية اختبار المنمنمة م الشبكة إعداد الإجراءات المقترحة في الشكل 1ج، د. الشكل 2 أ يعرض لمحة عامة عن مختلف العناصر التي شنت مجهر الأسفار معكوس. تركيب وحدة استزراع خلية على الجانب الأيسر من المجهر؛ وحدة نمطية لإعداد الشبكة م يقع على الحق. وحدة استزراع الخلايا (الشكل 2ب) يسمح نمو الخلايا حقيقية النواة ملتصقة وتصوير خلية يعيش ثقافة الخلية بالمجهر الخفيفة. يتم تفكيك خلايا فردية في العمل مجتمعة من صدمة ناضح وانهانسر والتطلع لمحتوى الخلية في^24،ميكروكابيلاري (الشكل 2ب، الرقم 6أ)²⁵. ثم يمكن استخدام العينة ليستي يستنشق لإعداد شبكات لطب الطوارئ NS أو البرد. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون حلاً بروتين مخزون في أنبوب PCR المصدر عينة. ميكروكابيلاري (الشكل 2ب) استخدمت متصل بنظام مضخة عالية الدقة يسمح حجم العينة أن يستنشق والاستغناء عن الدقة sub-nL. كما هو مفصل في البروتوكولات، يتم تنفيذ كل عينة المعالجة داخل هذا ميكروكابيلاري أو على الشبكة م نفسها دون النقل عينة كبيرة. على سبيل المثال، يتم استخدام ميكروكابيلاري نفسه الخلايا حقيقية النواة المفردة ونضح، شرط أنها وأخيراً الاستغناء عن مختبرين على شبكات م. وحدة إعداد شبكة تتكون من DP منقولة-مرحلة تسمح درجة الحرارة في شبكة طب الطوارئ على أن يكون التحديد الخاضعة للرقابة (الشكل 2ج). ل NS-TEM، الشبكة العينة المعدة يمكن ثم ببساطة إزالة من مرحلة الباردة وسمح لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، آثار القهوة-خاتم ما يسمى ثم يمكن أن يؤدي إلى تحتاج إلى تجنبها للكمية تيم حيث يتم حساب البروتين 'الجزيئات'. للقيام بذلك، يتم المجففة الشبكات ببطء في موانئ دبي-مرحلة استخدام تدرج درجات الحرارة تتزايد تدريجيا إلى إبطاء تبخر السائل. للبرد-م، يتم الاحتفاظ بدرجة حرارة الشبكة قريبة من نقطة الندى؛ يتم اختيارها إزاحة إيجابية نحو 8 درجات مئوية، السماح لتبخر السائل نموذج للاستقرار رقيقة ورقيق، الخاضعة للرقابة التي يمكن رصدها بجهاز استشعار إذا لزم الأمر²⁶. بعد الوقت المحدد رقيق، يتم تنشيط إليه اختيار والهبوط، وهو الشركة إنتاج العينة (الشكل 2-ج). علما أن هذه الآلية تغرق غير مطلوبة من أجل الشبكات NS-م، والتي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة.

الشكل 2: نظرة عامة على إعداد كريووريتير. A) نظرة عامة على إعداد كريووريتير التي شنت على عكس ضوء مجهر (1). ب) وأشار إلى الإطار الداخلي للمنطقة على الجانب الأيسر في لوحة الخلية ألف حجرة تثقيف (2)، مع ميكروكابيلاري (3) لتحلل الخلية والتلاعب عينة المتمركزة فوق لوحة ثقافة خلية على أساس PDMS المنمنمة (4). ج) أشار إلى الإطار الداخلي للمنطقة على الجانب الأيسر في الفريق (أ) 'بيك-ويغرق' إليه. شبكة م فيلم الكربون المخرمة (5) شنت بين نصائح ملاقط (6) ووضعه أفقياً في اتصال مباشر مع مرحلة التحكم في درجة الحرارة (7)، يشار إلى مرحلة نقطة الندى (DP-المرحلة) في النص الرئيسي. أن درجة الحرارة في مرحلة مراقبة شديدة عن طريق وحدة تحكم PID وعنصر بلتيير المياه المبردة، إبقائها في أو بالقرب من درجة حرارة نقطة الندى، اعتماداً على البيئة المحيطة. موانئ دبي-المرحلة (7) شنت على محور س ص مزودة بمحركات لنقل الشبكة بالنسبة ميكروكابيلاري. ميكروكابيلاري نفسها هي التي شنت على z-مرحلة ويمكن خفضت حتى أنها جداً قريبة من السطح في شبكة م واستخدامها للاستغناء عن وحدات التخزين الحجم نانولتر على دعم عينة تشمل (طبقة الكربون رقيقة مستمر ل NS-EM أو فيلم الكربون المخرمة للجمهورية التشيكية يو م). ملاحظة يتم تنفيذ امتصاص السائل والاستغناء عن استخدام نظام مضخة عالية الدقة (8). ويمكن توزيع السائل تخليها عن طريق تحريك الشبكة بالنسبة ميكروكابيلاري في نمط دوامة. لإعداد م البرد، نقل إليه تجميد بيك ويغرق (9) سرعة الشبكة محملة بعينه في الإيثان السائل (10) للتبريد السريع والتزجيج عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الشكل 3 نتائج تمثيلية لشبكات NS-م أعدت باستخدام الإعداد كريووريتير. غيض ميكروكابيلاري كانت محملة 5 nL عينة من تسوية مخزون وانخفضت إلى مستودع للحل NS (تنغستات ميثيلاميني 2 ٪) لعدة دقائق للسماح بتبادل انتشارية NS وأيونات الملح (لنقاش نظري راجع أرنولد، et al. ²⁴). بعد ذلك، تم الاستغناء على الفيلم الكربون رقيقة من شبكة NS-م العينة مكيفة والمجففة. الشكل 3 يظهر استخدام شبكة فتحه بنفس الطريقة لتصور الحبرية كاملة، كما هو مطلوب لل كمي. تجنبا لتأثير الحلبة القهوة، عقدت في البداية عند درجة حرارة نقطة الندى (لا تبخر الماء) الشبكة طازج خرج توهج وثم ببطء استعد في موانئ دبي-المرحلة. ولاحظ أن هذه العملية بطيئة التجفيف غير مطلوبة لمعظم التطبيقات (مثلاً، مراقبة الجودة عينة أو التحليل الهيكلي). NS عالية الجودة-الأعمال التحضيرية تم الحصول عليها من دون ذلك، كما هو مبين في الشكل 3ب، ج. تكييف أوقات لمخازن الملح خالية من الفوسفات منخفضة حوالي 3 دقيقة، مثلاً، مع منخفضة الملح تريس المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4 مع 50 ملم كلوريد الصوديوم)، كما هو موضح في الشكل 3ب استخدام فيروس تبرقش التبغ (TMV) كعينة. الشكل 3 ج يعرض سيناريو أسوأ الحالات كما تمف كان في برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (2.7 مم بوكل، 1.5 مم خ₂ص₄، مم 136.9 كلوريد الصوديوم، 8.9 ملم Na₂هبو₄·7H2O، درجة الحموضة 7.4). أيونات الفوسفات تشكل بلورات عابر مع أيونات المعادن الثقيلة من NS (انظر الشكل 5ج)، إطالة الوقت تكييف المطلوب (7 دقيقة). يمكن أيضا استخدام أملاح المعادن الثقيلة الأخرى مع الوحدة النمطية لإعداد الشبكة، مثلاً، موليبدات الأمونيوم أو بانديت ميثيلاميني 2% (انظر أيضا أرنولد, et al. ²⁴)-خلات اليورانيل غير مناسبة؛ أثر crosslinking وصمة عار هذا يؤدي إلى المجاميع إذا كانت العينة البروتين مشروطة في الحل، قبل الفيلم الامتزاز بالكربون (انظر الشكل 5ه)²³.

الشكل 3: النتائج النموذجية لشبكات NS أعدت باستخدام الإعداد كريووريتير كما هو مبين في الشكل 1ج. A) الصورة نظرة عامة لمعالجة تجميعية nL 3 الاستغناء عن شبكة فتحه بعد تكييف مع تنغستات ميثيلاميني 2%. ب) تمف في المخزن المؤقت تريس 20 مم. يظهر اقحم إجراء توسيع 3 x للمنطقة المشار إليها. مقتبس من أرنولد, et al.²⁴ (أذونات أخرى تتصل بالمواد مقتطفات ينبغي أن توجه إلى رابطة الدول الكاريبية). ج) فيروس تبرقش التبغ (TMV) في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. يظهر اقحم إجراء توسيع 3 x للمنطقة المشار إليها. مقتبس من أرنولد, et al.²⁴ (أذونات أخرى تتصل بالمواد مقتطفات ينبغي أن توجه إلى رابطة الدول الكاريبية). تغيير حجم أشرطة: ألف، 100 ميكرومتر؛ ب من 50 نانومتر؛ ج، 80 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويرد في الشكل 4النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها لشبكات cryo-م أعدت باستخدام الإعداد كريووريتير. لوحة 4A يظهر أطلس شبكة المنطقة المشمولة بالعينة المزججة. ويبين 4B الفريق تجانس الجليد الزجاجي في فتحه شبكة محدد. وفي كلتا الحالتين، كانت العينة في 25 مم كوه حبيس pH 7.5، 50 مم كلوريد الصوديوم العازلة التي تحتوي على 0.05% 14 المنحدر المنظفات. تم اختبار العديد من العينات ومخازن وحصلت جليد زجاجي ذات جودة عالية قابلة لمقارنة، ولكن الشروط المطلوبة هي المخزن المؤقت تعتمد (انظر أيضا مناقشة الشكل 5). تظهر لوحة ج 4 جسيمات أبوفيريتين ومن عاثية في تريس-HCl المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl، 50 مم كلوريد الصوديوم؛ ودرجة الحموضة 7.4) تصويرها في يزيل التباؤر عالية لزيادة التباين. تظهر لوحة 4 د بروتين غشائي كاتشين 200 استقرت قبل أمفيبوليس.

الشكل 4: النتائج النموذجية لشبكات cryo-م أعدت باستخدام الإعداد كريووريتير كما هو مبين في الشكل 1د. تختلف العينات والمخازن المؤقتة في الأمثلة التي تظهر. تم تحميل جميع العينات في الأفلام الكربون المخرمة. A) مجمعة صور نظرة عامة على الشبكة ("أطلس") من عينة تحتوي على بروتين غشاء كاتشين 150، هامش الجليد الزجاجي يشار بواسطة الأسهم البيضاء. ب) فتحه الشبكة الموسع من شبكة أعدت مع المخزن المؤقت نفسه، وعرض الفيلم الكربون المخرمة مع الجليد الزجاجي. لا تشغل بعض الثقوب مع المخزن المؤقت للعينة، كما هو مبين بالأسهم البيضاء. ج) هول الكربون مع عينة المزججة التي تحتوي على مجمعات البروتين أبوفيريتين وباكتيريوفاجيس. داخلي: توسيع شقين عرض ذيل عاثية. النجمة البيضاء تشير إلى الفيلم الكربون. لاحظ أن الصورة تم تسجيلها مع يزيل التباؤر عالية لزيادة التباين. د) 200 ألف بروتين غشائي كاتشين تشكيلها في أمفيبولس. داخلي: 2 x توسيع المنطقة المشار إليها تظهر مع التباين المتزايد. تغيير حجم أشرطة: ألف، 100 ميكرومتر؛ ب، 10 ميكرومتر؛ ج ود، 80 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

يسمح الإعداد كريووريتير منهجية الكشف عن الظروف المثلى من إعداد م-الشبكة؛ يتم عرض مثال في الشكل 5ألف (apoferritin في 25 مم كوه حبيس pH 7.5، 50 مم كلوريد الصوديوم، 0.05% 14 المنحدر). في هذه التجربة، قد تباينت الجليد الزجاجي "رقيق" درجة الحرارة، ولكن الوقت رقيق (أي، الفجوة الزمنية بين التطبيق العينة وتجميد يغرق) ظلت ثابتة (1 ثانية). في المقابل درجات حرارة منخفضة (مثلاً، ك 8)، كان طبقة العينة سميكة جداً. في أعلى درجات حرارة المقابلة، كان الجليد الزجاجي في الثقوب أرق (ك 10، 12 ك)، حتى في مرحلة (أعلاه ك 18) أصبحت الشبكة تماما الجافة (لا تظهر). في النتائج المعروضة هنا، إزاحة ك 12 يؤدي إلى منطقة متجانسة كبيرة من الجليد الزجاجي كما هو مبين بالأسهم السوداء. يمكن إجراء هذه التجارب والأمثل مع المخزن المؤقت للعينة المستهدفة باستخدام "اختبار" البروتينات (مثل أبوفيريتين). ثم يتم تطبيق شروط أفضل العثور على العينة المستهدفة. وعلاوة على ذلك، شبكات مع المعلمات بعيداً عن الأمثل يمكن التعرف على كثير من الأحيان أثناء إجراء الإعداد ولا تحتاج إلى فحص بالمجهر الإلكتروني، توفير قدر كبير من الوقت. كما يبين الشكل 5 معرض نموذجي cryo-م (فريق ب) والتحف NS-م (لوحات ج إلى ه) محددة للإعداد كريووريتير. مفرطة قد ضعفت الشبكة cryo-م يظهر في لوحة 5B مع تمف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% ديسيل-β-د-مالتوبيرانوسيدي (2.7 مم بوكل، 1.5 مم خ₂ص₄، مم 136.9 كلوريد الصوديوم، 8.9 ملم Na₂هبو₄·7H2O، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1%DM). خلفية الصورة محبب لتركيز الملح أصبحت عالية جداً. وبصفة عامة، لا يبدو المظهر المرئي من عينة أن تكون دالة خطية لتركيز الملح؛ الحبوب فجأة أصبحت بارزة عندما يتم التوصل إلى عتبة تركيز أثناء عملية رقيق. لاحظ أنه يمكن إزالة المواد غير المرغوب فيها بخطوة تكييف قبل إعداد الشبكة، كما هو موضح لطب الطوارئ NS في البروتوكول قسم 1.6. يمكن أن يسبب NS التحف الأخرى. في المثال الموضح في لوحة ج 5، برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (2.7 مم بوكل، 1.5 مم خ₂ص₄، مم 136.9 كلوريد الصوديوم، مم 8.9 غ₂هبو₄·7H2O، درجة الحموضة 7.4) دون عينة كانت مكيفة في تنغستات ميثيلاميني 2% لرواسب 3 كحد أدنى وبلورات واضحة وتمارس قوات مكثفة على سطح الكربون مما يؤدي إلى شروخ. شكل رواسب فقط بتركيز برنامج تلفزيوني و NS معينة تتراوح ويمكن تجنبها من خلال تكييف العينة لفترة أطول (مقارنة الرقم 3ج). تظهر لوحة د 5 هامش تخليها NS عينة معالجة تجميعية العارضة "عصابة قهوة". وهذا سوف تخل بالتحليل الكمي، ومجموع العينة ويمكن تجنبها بإبطاء عملية التجفيف، أي، بحفظ الشبكة م في درجة حرارة نقطة الندى أثناء تطبيق نموذج ومن ثم تدريجيا على زيادة درجة الحرارة إلى الجافة ( انظر الشكل 3أ). لوحة 5E (apoferritin في 20 مم حبيس، ودرجة الحموضة 7.0، مكيفة 3 دقيقة) يظهر نشاط crosslinking وصمة خلات اليورانيل 2%، الذي لا يمكن استخدامه لعينات البروتين شرط قبل أنها هي تمتز إلى يدعم الفيلم الكربون.

الشكل 5: التغييرات المنهجية والنتائج الملموسة ولاحظ عند استخدام الإعداد كريووريتير لإعداد شبكات لطب الطوارئ NS والبرد. A) تباين سمك الجليد الزجاجي المنهجي؛ الأمثل لإعداد الشبكة للبرد-م. وكانت درجة الحرارة إزاحة DP-المرحلة المتنوعة (ك 8 إلى 12 ك) حفظ وقت ثابت رقيق (1 ثانية). تشير الأسهم إلى محيط طبقة العينة. ب) الملح الآثار؛ تركيز عالية جداً، أيخطوة رقيق كان طويل جداً. اقحم يصور توسيع 2 x المنطقة المشار إليها. ج) الملح رواسب شكلتها المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني حضور أملاح المعادن الثقيلة. يجب أن تكون مشروطة العينات المحتوية على المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني أطول من العينات في المخازن المؤقتة الأخرى. هنا، كانت مكيفة المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني دون عينة في تنغستات ميثيلاميني 2% لمدة 3 دقائق، وقت نموذجي للمخازن المؤقتة عينة أخرى. ملاحظة الكراك في الفيلم الكربون على الأرجح سبب قوي قوي من رواسب تعمل على دعم رقيقة أثناء عملية التجفيف. د) تأثير 'خاتم القهوة'. ه) Apoferritin مكيفة في خلات اليورانيل 2% للحد الأدنى 3 اليورانيل أيونات يحمل النشاط crosslinking كبيرة وأبوفيريتين مجموعات نموذج المجاميع الكبيرة. تغيير حجم أشرطة: A، 80 ميكرومتر؛ ب من 80 نانومتر ج، 12 ميكرومتر؛ د، 80 ميكرومتر؛ ه 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كمية صغيرة والتخزين اللازمة لإعداد شبكة م باستخدام الإعداد كريووريتير تمكن أنواع جديدة من التجارب. على سبيل المثال، يمكن جمع إجمالي محتويات خلية واحدة ومستعدة لطب الطوارئ NS والبرد. ويرد الإجراء في الشكل 6A. يتم تفكيك خلية حقيقية النواة ملتصقة (HEK 293) انهانسر المتزامنة وعينه تطلع (لوحة 6A)²⁵. إجمالي حجم 3 يستنشق لانغ، الذي يحتوي على الخلية ليستي، ويتم الاحتفاظ بها في ميكروكابيلاري لمزيد من المعالجة. ل NS-م يظهر في لوحة 6B، وجرى تبادل المتوسطة استزراع خلية مع برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (2.7 مم بوكل، 1.5 مم خ₂ص₄، مم 136.9 كلوريد الصوديوم، 8.9 ملم Na₂هبو₄·7H2O، ودرجة الحموضة 7.4) قبل تحلل الخلية. وقد يستنشق محتويات الخلية في 3 nL من المخزن المؤقت ومكيفة في خزان NS كما هو مبين في الشكل 1ج على 10 دقيقة بعد ذلك، الاستغناء عن وحدة تخزين nL 5 على الفيلم الكربون المستمر لشبكة NS-م. يمكن التعرف على البروتينات الفردية، مثلاً، أكتين الخيطية، والغشاء بقع مع البروتينات المرفقة في الصورة. للبرد م، هو موضح في الشكل6 ج، حجم 3 لانغ كان الاستغناء عن على شبكة المخرمة الكربون م من دون إعادة التطلع إزالة السائل. وكان ضعفت الفيلم سميكة نسبيا من العينة التي تشكلت على نطاق واسع قبل التزجيج. للقيام بذلك، زيادة درجة حرارة DP-المرحلة كان تدريجيا، بدءاً من درجة حرارة نقطة الندى. عملية رقيق ويرصد نظام استشعار في الوقت الحقيقي حتى تم التوصل إلى عتبة محددة سلفا تحريك إليه 'بيك ويغرق' والتزجيج عينة (للتفاصيل انظر أرنولد, et al. ²⁶)-هياكل الأغشية والبروتينات يمكن التعرف عليها في الصورة.

الشكل 6: واحد خلية البروتيوميات المرئية باستخدام الإعداد كريووريتير. A) تحلل خلية حقيقية النواة ملتصقة واحدة. ويزرع في الخلية (1، الأخضر) في فونكتيوناليزيد، إيتو المغلفة (أحمر)-شريحة زجاجية (2) في طبق بتري المنمنمة (3)²⁵. ويستند كهربائياً طبقة إيتو. اقترب من الخلية قبل ميكروكابيلاري (4)، التي هي مغلفة بالبلاتين. حدوث صدمة ناضح أولية (لم يبين) تعطي لتسهيل تحلل، الذي يتم تنفيذ سلسلة من النبضات الكهربائية وقوى القص التي تمارس خلال تطلع الخلية ليساتي. العملية يمكن أن ترصدها الخفيفة الميكروسكوب؛ عدسة المجهر الهدف هو المشار إليه (5). لمزيد من التفاصيل، انظر بنا^24،العمل السابق²⁵. ب) صورة م NS ليستي من خلية HEK 293 فردية. بقع أكتين والغشاء الخيطية مع البروتينات المرفقة مرئية. لوحة مقتبسة من أرنولد, et al.²⁴ (أذونات أخرى تتصل بالمواد مقتطفات ينبغي أن توجه إلى رابطة الدول الكاريبية). ج) صورة م Cryo ليساتي من خلية HEK 293 فردية. يظهر اقحم توسيع 2 x المنطقة المشار إليها حيث مرئية هياكل غشاء نموذجية مع البروتينات المرتبطة بها. الفريق جيم مقتبس من أرنولد, et al. ²⁶ أشرطة مقياس: ب، 50 نانومتر؛ ج، 80 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وترد أداة 'كريووريتير' والبروتوكولات المطلوبة لإعداد شبكات عينة م NS والبرد من أحجام العينة الإجمالية nL الحجم وتجنب تماما الخطوة النشاف الورق الكلاسيكية. يتم الجمع بين مبادئ موائع جزيئية ونظام ذبابة في كريووريتير لجعل هذا ممكناً.

تبين تجربتنا أنه عندما تستخدم أساليب المنمنمة التي عرضت في هذه المخطوطة، مساحة المعلمة لإعداد الشبكة م-أكبر من الأساليب الكلاسيكية، وتحت رقابة المستخدم. الأهم من ذلك، زيادة إمكانية تكرار نتائج تحقيقها يجعل من الممكن للفحص المسبق مع نظام المخزن المؤقت عينة، تستكمل مع بروتين اختبار متاحة بسهولة، لتحديد المعلمات الأمثل قبل إجراء التجربة الفعلية. وهذا يبقى استهلاك العينة من الفائدة للمطلق الحد الأدنى وينصح بشدة. الخطوات الأساسية لإعداد الشبكة م NS والبرد على حد سواء،: (ط) فتيلة نظام مضخة؛ للاستغناء عن حجم نانولتر الفرعية، يجب أن يكون ديجاسيد نظام السائل (الماء) وفقاعة مجاناً. (ثانيا) دقة السيطرة توهج التفريغ أو البلازما التنظيف خطوة؛ خصائص الشبكة م السطحية حاسمة بالنسبة للنتائج استنساخه. (الثالث) تكييف نموذج؛ الوقت اللازم لتكييف، مثلاً، مع NS، يعتمد على نوع المخزن المؤقت، ومحتوى الملح وتركيز (الشكل 3)، وكذلك في هندسة فوهة ميكروكابيلاري²⁴. (رابعا) معدلات التبخر NS م التحضير لكمية م؛ أثر القهوة-خاتم يمكن حظر التحليل الكمي للأعمال التحضيرية NS-م، ويجب قمعها بمعدلات التبخر بطيئة يسيطر DP-المرحلة.

يمكن دمج الجوانب المختلفة لأساليب إعداد الشبكة المعروضة بحرية مما يتيح وضع بروتوكولات متعددة لعينات محددة. ستكون الأمثلة النموذجية على إزالة مادة تمنع م عالية الاستبانة، مثلاً، الجلسرين، بخطوة تكييف قبل إعداد الشبكة للبرد-م؛ إدخال جزيئات الوسيط، مثل يغاندس، بتكييف قبل أن يتم إعداد الشبكات؛ أو النظر في خلية مفردة قبل NS أو البرد-م (الشكل 6).

استخدام ميكروفلويديكس وكميات العينة الحد الأدنى في أساليب عرض يزيل تماما الحاجة إلى اتخاذ خطوات ورقة النشاف. هذا ميزة كبيرة، نظراً لأن الورق النشاف معاملة قاسية للبروتينات واحتمال تلويث العينة مع أيونات غير المرغوب فيها وطبيعتها مما يؤدي إلى فقدان عينة واسعة النطاق. من ناحية أخرى، لا يتم تجنب الآثار المحتملة الناجمة عن واجهة الهواء والماء من الفيلم عينة رقيقة شكلت عندما يتم إعداد العينات cryo-م بطريقة كلاسيكية عندما يستخدم في كريووريتير. يمكن إعداد شبكات مناسبة للبرد-م مع وقت انتظار أقل من 0.2 s بين نموذج التطبيق والتزجيج (البيانات لا تظهر). ومع ذلك، البروتينات السفر بضعة أعشار نانومتر في بضعة نانو ثانية قبل نشرها، لا يزال هناك ما يكفي من الوقت لكي تتصادم مع واجهة الهواء والماء من العينة سميكة nm 100 فيلم عدة مرات. بيد أن كمية البروتينات التي تتمسك بواجهة الهواء والماء قد خفض إلى حد كبير بهذه الثغرات في وقت قصير وقد منع تمسخ البروتين أو مقيدة باتجاه الجسيمات. آخر النهج الواعدة التي قد تحمي البروتينات الحساسة من واجهة الهواء والماء لتغطية الفيلم عينة من المواد سطحها منخفض الوزن الجزيئي. يمكن إدخال هذه المركبات سريعاً بخطوة تكييف في كريووريتير قبل إعداد الشبكة. ارتفاع نسبة السطح إلى الحجم من نظم موائع جزيئية قيد مزيد من كريووريتير، كما يحتمل أن يمكن أن تضيع بغير محدد الامتزاز على السطح ميكروكابيلاري عينة وتخل بالتحليل الكمي عن طريق العد الجسيمات. يتم معالجة المشكلة بطريقتين: أولاً، العينة عدم السفر مسافات طويلة داخل ميكروكابيلاري. في الواقع، يظل حجم العينة نانولتر في تلميح الشعرية طوال التجهيز. الثانية، وأيضا في تخفيض على السطح إلى نسبة الحجم باستخدام ميكروكابيلاريس بأقطار داخلية كبيرة نسبيا، مثلاً، 180 ميكرون. وثالثاً، يمكن تخميل أسطح ميكروكابيلاريس سهولة إذا لزم الأمر، مثلاً، بالتعامل معهم مع بوليليسيني المتاحة تجارياً املؤسسه الإيثانول (PLL-الربط).

تحليل الاستبانة من البروتينات بنهج واحد الجسيمات المستخدمة في طب الطوارئ يتطلب فقط 100,000 إلى عدد قليل من الصور مليون من جزيئات البروتين الفردية. وهذا يعني أن تقنيات موائع جزيئية يمكن أن توفر ما يكفي من البروتين المجمعات للتحقيق في الهيكلية. وقد وضعت طريقة المنمنمة المناعية-ترسيب لعزله بسرعة من مجمعات البروتين (حوالي 1 ساعة) من المبالغ خلية الحد الأدنى (حوالي 40,000 الخلايا) سابق²⁸. الآن سوف يكون هذا الأسلوب ارتباطاً مباشرا بمرحلة إعداد عينة المنمنمة كريووريتير. والهدف النهائي هو وضع أنبوب موائع جزيئية متكاملة للبروتين فائقة السرعة والعزلة والبرد-م الشبكة إعداد يتطلب أقل من ساعتين في جميع. وعلاوة على ذلك، كما يتضح من الشكل 6، كمية دقيقة وحجم المواد اللازمة لإعداد نموذج وتكييف تقريبا ضياع وإجراءات إعداد الشبكة يتحقق باستخدام كريووريتير، تجعل من الممكن لدراسة البروتين مجمعات خلايا الفردية. معا، طريقة المنمنمة المناعية-ترسيب وكريووريتير إرساء الأساس لأسلوب البروتيوميات جديد يسمى "خلية مفردة البروتيوميات البصرية"، كما أثبتنا مؤخرا للحرارة-الصدمة تجارب²⁴. ويجري حاليا اختبار خوارزميات تحليل البيانات الموجهة لتحليل الصور "البروتيوميات البصرية".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liquid handling
Microcapillary tip	New Objective	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve	New Objective	CONGAS-1	Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector	BGB-Analytik	2525LD	Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25
Syringe 10 µl	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)
Syringe pump controller	Cetoni	A3921000093	neMESYS controller
Syringe pump dosing unit	Cetoni	A3921000095	neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor	Meltec	UFT75-AT	Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller	Cooltronic	TC2812	PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 mm
Water-cooling block	-	-	Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block	-	-	Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis	Dyneos AG	M-404.2PD	High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage	Prior Scientific	H117EIL5	Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets	Supermagnete	S-05-08-N	Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet	Schramme	EG1025A02/110	Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Electromagnet control PCB board
Solenoid hub	Distrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers	Electron Microscopy Sciences	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts	Thorlabs	-	-
Various mechanical parts	Workshop Biozentrum, University Basel	-	Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode	Thorlabs	CPS780S	780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM	emsdiasum.com	DTF-03523	30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537 SIGMA	Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Negative stain vanadium based
NanoW 2%	nanoprobes.com		Negative stain tungsten based
Software
openBEB			The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin)		Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.