Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Özet

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Özet

Son teknolojik ilerleme nedeniyle cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) hızla protein kompleksleri atomik çözünürlükte yapısal analizi için standart bir yöntem haline geliyor. Ancak, protein yalıtım teknikleri ve örnek hazırlama yöntemleri için EM bir darboğaz kalır. Bireysel protein parçacıklar nispeten az sayıda (100,000 birkaç milyon) proteinler yüksek çözünürlüklü analiz için tek parçacık EM yaklaşım, kırılan örnek işleme teknikleri ve mikrosıvısal ilkeleri yapım tarafından yansıması gereken uygulanabilir.

Örnek ön Klima, EM kılavuz astar ve yalnızca nanoliter-örnek hacimleri tüketir işlem sonrası için bir minyatür, kağıt-Blot ücretsiz EM kılavuz hazırlama yöntemi gösterilir. Yöntem bir dağıtım sistemi kontrol sıvı alımı ve EM kılavuz astar, bir platform için alt-nanoliter hassasiyetle böylece belirleme bağıl nem EM kılavuz ve çekme-ve-dalma-için bir mekanizma örnek yukarıda kılavuz sıcaklık denetlemek için kullanır Vitrifiye. Cryo-EM, EM kılavuz ısı kontrollü sahnede yer alıyor ve örnek bir kılcal damar Aspire. Kapiler uç ızgara yüzeyi bir mesafede konumlandırılmış, kılavuz ile örnek yüklenir ve aşırı microcapillary yeniden emişli. Daha sonra örnek film stabilize ve biraz platformu sıcaklık çiğ noktası göreli uzaklığı tarafından kontrollü su buharlaşma ile inceltilerek. Belirli bir noktada hızla içine sıvı etan örnek vitrifikasyon için astarlanmalıdır EM kılavuz aktarma çekme ve dalma mekanizma tetiklenir. Alternatif olarak, örnek-Klima yöntemleri örnek nanoliter boyutlu birimleri negatif leke (NS) EM hazırlamak kullanılabilir.

Metodolojisi büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve filtre kağıdı kurutma geleneksel yöntemlerde kullanılan gibi yaklaşımlar zararlı proteinler, kaçının. Ayrıca, gerekli örnek küçük miktarda gibi hızlı örnek tek hücre lizis için "görsel proteomik" or "kayıpsız" Toplam numune hazırlama Nicel analiz ile Merkezi Klima, roman deneysel stratejileri sağlar karmaşık örnekleri.

Giriş

Donanım ve yazılım protein kompleksleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından yapısal analizi için ağır son yıllarda gelişmiş. Yapılan iyileştirmeler "çözünürlük devrimi"^1,2 yol açtı ve temelde yapısal araştırma değişti. Radyasyon duyarlılık azaltılması ve önlenmesi ise hazırlık yakın fizyolojik koşullar altında Biyolojik örneklerin izin cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM)^3,4, advent ile devrim başladı Transmisyon Elektron mikroskobu⁵örnek buharlaşma yüksek vakum. Takip eden yıllarda, artan teknolojik ilerleme yavaş yavaş ulaşılabilir çözünürlük artar. Bu yenilikler arasında uygulama alanı-emisyon silah^6,7vardı ve daha yakın zamanlarda, geliştirilmiş veri analizi algoritmaları, maksimum olabilirlik yöntemleri^8,9gibi. Doğrudan elektron dedektörü kameralar^10,11,12,13, film-tarz görüntüleme ve eşlik eden yazılım gelişmeler^{14,15, 16 , 17}, sağlanan tek parçacık analizi (için bir daha gözden geçirme bkz: Cheng, Grigorieff, vd tarafından biyolojik örnekler için atomik çözünürlük elde etmek için gerekli son atılım ¹⁸). cryo-EM önemini yakın zamanda üç pioneers kimya Nobel Ödülü Ödülü tarafından tanındı.

TEM tarafından biyolojik bir örnek görüntü için örnek (daha sonra "kılavuz hazırlık" anılacaktır) ile EM kılavuz yüklemek için kullanılan yöntemi elde edilen örnek katmanı (i) yeterince ince olduğundan emin olmalısınız (< 100 nm) geniş sesini tarafından esnek olmayan önlemek ya da çarpmak için dağınık Elektron, (ii) dayanıklı elektron mikroskobu yüksek vakum ve (III) biomolecules radyasyon zararlardan korur. Bu perquisites yerine getirmek için iki ana yöntem kullanılır: negatif leke(NS)^19,20 yordamları (Şekil 1A) örnek bir ince Karbon film için absorbe, amorf ağır metal biomolecules embed ve sonra havada kurumaya derleme izin. Bu basit ve hızlı, ve (daha sonra "örnek ızgaralar" da adlandırılır) yüklü EM ızgaralar basit-e doğru saklamak ve uzun bir süre için tutulabilir (genellikle yıl). TEM, ürünleri yüksek karşıtlık NS nedeniyle sergi ve yüksek elektron dozda cryo-hazırlıklar daha tahammül, ancak çözünürlük (Şekil 1B) istihdam delikli karbon destekler yaklaşık 20 Å. Cryo-EM yordamlar sınırlıdır. Örnek çözüm ince bir film delikleri arasında yayılmış ve EM kılavuz bir cryogen, genellikle sıvılaştırılmış etan-150 ° c altında hızla sakin, içine daldı Sonuç bir amorf, vitrifiye, 50-100 nm-kalın film çözüm destek delik. Bu ince, amorf film elektron mikroskobu yüksek vakum dayanmaktadır ve ideal durumda, yerel durumlarına biyolojik yapıları korur. Yordam, yüksek çözünürlüklü yansıması biyolojik örnekler verir. Ancak, örnek kılavuz aşağıdaki sıcaklıklarda-150 ° C devitrification önlemek için her zaman tutulmalıdır. Düşük sıcaklık ama karşıtlığı nedeniyle nispeten yüksek elektron dozlarda kullanılarak görüntüsü ve sinyal-gürültü oranı yine de düşük. Bu nedenle, ortalama teknikleri kontrastı arttırmak için istihdam edilmektedir ve sağlanan örnek--dan farklı açı görüntüsü, bir yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) harita yeniden olabilir. En sık kullanılan ve tek parçacık yaklaşım bugün itibariyle 3D yeniden inşası için son derece başarılı yöntemdir. Son bir reklam için Cheng al.¹⁸' e bakın.

Yüksek karşıtlık gerek duyulduğunda veya örnek yalnızca sınırlı miktarda kullanılabilir olduğunda negatif leke TEM (NS-EM) tarama ve kalite kontrol için önemli (adsorpsiyon Karbon film genellikle yoğunlaşmaktadır örnek). Tek parçacık cryo-EM altın standart yöntem ise protein yapısının yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonu için amaçlanmıştır.

Resim 1: TEM ilkeleri kılavuz hazırlanması ve klasik (panel A, B) ve bir mikrosıvısal yaklaşım (masası C, D) arasında karşılaştırma. A) klasik NS-EM kılavuz hazırlık: hakkında 3 µL örneği pipetted el ile (daha sonra bir 'NS-EM tablo' da adlandırılır) bir sürekli Karbon film ile kaplı bir EM ızgara üzerine (ı). Yaklaşık 10 için kuluçka sonra s, filtre kağıdı uzak adsorbed biomolecules bir ince su film bırakarak aşırı sıvı (II), taraftan leke için kullanılır. Daha sonra protein inkübe bir heavy metal tuz solüsyonu, Örneğin, %20 2 uranyl asetat s (III) ve tekrar sıvı filtre kağıdı (IV) kullanarak taraftan Blot tarafından kaldırılır. Son olarak, EM-grid havada kurumaya bırakılır. B) klasik cryo-EM kılavuz hazırlık: hakkında 3 µL örnek bir delikli Karbon film üzerine bir el tarafından pipetted. Bir ince örnek film oluşturmak için fazla sıvı kağıt kurutma görülen bir veya her iki taraftan da (II) tarafından kaldırılır. Son olarak, grid hızla Vitrifiye (III) için sıvı etan içine gömülür. C) cryoWriter kurulumu kullanarak NS-EM kılavuz hazırlık: A 5 nL birim bir microcapillary (i) kullanarak örnek stoktan Aspire. Merkezi Klima örnek için microcapillary ipucu Klima çözüm içine, Örneğin, %2 amonyum asetat batırılır. İyonları ile küçük moleküllerin difüzyon (II) tarafından değiştirilir. Microcapillary boyutları tüm süreç odaklı difüzyon olduğundan emin olun unutmayın. Protein çok daha düşük difüzyon sabitler Tuz iyonları daha sahiptir ve önemli ölçüde²⁴kayıp değil. Son olarak, örnek kılavuz reçete ve (III) kuru izin. D) cryoWriter tabanlı yöntemi kullanma cryo-EM kılavuz hazırlama ilkeleri: delikli Karbon film ile kaplı bir EM kılavuz ısı kontrollü bir platform yüzeyine yerleştirilen ve cımbız tarafından düzenlenen. Platform sıcaklığını çiğ noktası sıcaklık ızgara çevrenin bir uzaklığındaki kontrol edilir. Kılavuz örnek içeren microcapillary göre taşınır ve bu kılavuz yukarıda birkaç mikrometre bitene microcapillary indirilir. Sahne bir sarmal Model taşındı iken daha sonra örnek bir kaç nanoliters ondan kalmaması sağlanmaktadır; aşırı sıvı yeniden emişli (i). EM kılavuz, priming sonra microcapillary içine kapanık ve (daha sonra çiğ noktası (DP) sahne da adlandırılır) sıcaklık kontrollü platform örnek buharlaşır için kontrollü bir miktar izin vermek kısa bir süre için kılavuz kalır. Buz gibi atılmak için kılavuz hızla cımbız (II) kullanarak sahne alanı'ndan geri 90 ° dikey pozisyona saygısız ve (daha sonra 'çekme ve dalma' mekanizması olarak da adlandırılır) cryogen banyo (III) daldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ne yazık ki, NS ve cryo-EM için kullanılan ızgara hazırlama yöntemleri önemli ölçüde geliştirilmiş onlar icat edildi bu yana değil. Yüksek örnek tüketimi (1 mg/mL protein yaklaşık 3 µL) geçerli sakıncaları vardır ve büyük miktarda örnek (> %99) (resim 1A, B) kaybetti. Ayrıca, ızgaralar cryo-EM için hazırlamak için kullanılan klasik yöntem bir sert proteinler için işlemdir: ilk olarak, bu bir geniş görülen kağıt kurutma adım (Şekil 1B, II) içerir, ve, ikinci olarak, protein hava-su arabirimi için maruz kalmaktadır Saat²¹önemli bir miktar için. Burada, ön şartlandırma örnek için alternatif bir yöntem, örnek kılavuz hazırlık ve (kılavuz kurutma veya vitrifikasyon) NS-EM (Şekil 1C) veya cryo-EM (Şekil 1D) için son işlem sunulmaktadır. "CryoWriter" denilen içi yapılı Kur küçültülmüş örneği teknoloji ve mikrosıvısal ilkeleri işleme Aspire edin, koşul ve örnek, tamamen kurutma ve ince örnekleri için alternatif yöntemler sağlayan kaçınarak kağıt dağıtmak için kullanır Cryo-EM. Bu önemli ölçüde örnek tüketimini azaltır ve numune hazırlama bir bütün olarak üzerinde kullanıcı denetimini artırır. Ayrıca, yöntemi roman deneysel uygulamalar sağlar; "tek hücre görsel proteomik"^22,23,24,25denilen bir yaklaşım tek tek hücreleri izole biyolojik bileşenleri hazırlanması gibi.

Protokol

"cryoWriter" (Şekil 2; Ayrıntılar önceki iş^24,26,27için bakın) veya eşdeğer araçları aşağıdaki iletişim kuralları için gereklidir. Ana bölümleri ve sarf malzemeleri satıcılar listesini Malzemeler tabloverilir.

1. olumsuz leke (NS) kılavuz hazırlık

1. Araç üzerinde açın ve yazılımı başlatın. Tüm gerekli modülleri (şırınga pompa denetleyicisi, motorlu aşamaları, güvenlik kameraları ve çiğ noktası sahne) başlatın.
2. Örnek destek ve çiğ noktası sahne serin. Gerekirse, çiğ noktası sahne sıcaklık düzenlenmiştir emin olun 1-2 ° C çiğ noktası üzerinde.
   Not: Bir ticari Peltier aygıt PID denetleyicisi tarafından sahne soğutulur.
3. NS bir 100 ya da 200 µL PCR tüp NS (Örneğin, piyasada bulunan % 2 methylamine tungstate) 100-150 µL ile doldurarak hazırlayın. Tüp enstrümanın soğutmalı örnek destek koyun.
4. Örnek getirin.
   1. Örnek koymak (0.5 - 1 µM) 100 ya da 200 µL PCR tüp içine. Az 50 µL örneği varsa, bir tıraş bıçağı ile bir PCR tüp alt kesti ve iyi bir örnek olarak kullanabilirsiniz. Bu microcapillary örnek kolayca ulaşabilirsiniz sağlayacaktır.
      Not: Daha sonra örnek Aspire eskiden microcapillary biraz hareket ettirildiğinde ve seyahat-yükseklik z ekseni yönünde sınırlı olduğu için 100 ya da 200 µL PCR tüpleri, örnekleri Aspire kolayıdır.
   2. PCR tüp/konteyner buharlaşma önlemek için alet soğutmalı örnek destek yerleştirin. Alternatif olarak, örnek--dan mikroskop sahne en iyi kuluçka oda sıcaklığında iyi plakaları Aspire; Soğutma iyi plakalar için uygulanmamaktadır.
5. Konumlarını tanımlayın. Motorlu xy-sahne ve yazılım kontrol düğmeleri doğrusal x-, y-, ve z ekseni aşamaları microcapillary konumlandırmak için kontrol cryoWriter gezinme çubuğunu kullanın. Kamera kılcal konumunu denetlemek için kullanın.
   1. Microcapillary örnek havzanın taşıma. İpucu örnek sıvı içine sokmak ve bu duruma "örnek" olarak kaydedin.
   2. Microcapillary NS PCR Tüp taşıma, ucu NS çözüm içine sokmak ve bu konumu "leke" olarak kaydet.
   3. Microcapillary kabaca 100 µm yukarıda nerede EM ızgara yerleştirilmiş olacak ve "grid_save" olarak bu konumu Kaydet yarık ortasına yerleştirin.
6. Örnek Aspire edin ve NS-EM için durum.
   1. Zaten yüklediyseniz, bir 10 µL şırınga (0,46 mm iç çap) hassas şırınga pompa monte.
   2. Bir 30 cm uzun erimiş silis microcapillary (dış çapı 360 µm, iç çap 150 µm) şırınga çıkışına bir ucunu tutkal.
   3. Diğer microcapillary için kısa bir (5 cm) uzun konik sonu microcapillary uygun basın bağlayıcı üzerinden bağlayın. Kısa microcapillary konik ucunu losyonlu ucunu oluşturur.
   4. Şırınga degassed çift distile su ile (GKD₂O; sistem sıvı) doldurun ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.
   5. Nanoliters sistem sıvı birkaç onlarca dağıtmak ve hav bırakmayan bir doku ile microcapillary herhangi bir damla kaldırın.
   6. Kaydedilen örnek konumu çift tıklatın. Bu örnekte de microcapillary konumlandırır. Kılcal hareket olsa da, 3 x 0.5 dağıtmak sadece microcapillary ipucu var (bkz: Not Aşağıdaki 2) yakalanan üzerinden hava kabarcığı önlemek için örnek içine dalmış önce sistem sıvı nL.
   7. Aspire edin 5 nL örneği.
   8. Kaydedilmiş NS konumu çift tıklatın. Microcapillary örnek kapsayıcıdan içine kapanık ve NS havzanın otomatik olarak taşındı. Kılcal hareket olmakla birlikte, el ile 3 x 0.5 dağıtmak sadece ucu hava yok olduğundan emin olmak için rezervuar dalmış önce örnek sıvı nL kabarcıklar (2 aşağıdaki nota bakın).
      Not: Önemli: (1) aspirasyon dağıtım modu veya tersi geçiş yaparken, işte küçük bir kaybı piston İnmede şırınga pompa vites tepki için. Üreticiye göre 7 ve 12 µm arasında yeni bir birim tepki yatıyor. Namlu çapı 0,46 mm bizim şırınga için bu 1-2 nL çevirir. "Örnek aslında reçete önce bu nedenle, 1-2 nL, reçete". Genellikle, microcapillary ucunu üçüncü 0.5 sonra çıkmak küçük damlacık başlar nL dağıtmak adım. (2) / aşağıda örnek sıkışmış hava kabarcığı dağıtımı daha az doğru yapmak ve örnek Klima tarafından difüzyon önlemek.
   9. Örnek arabellek ve meme geometri bağlı olarak 3-12 dk için dalmış microcapillary bırakın.
      Not: Yüksek tuz ve/veya fosfat konsantrasyonu arabelleği, gerekli daldırma uzun. NS (nispeten hızlı bir şekilde) (çok daha yavaş) diffüz out sırasında arabellek tuzları (oldukça hızlı) ve protein örnek fiş içine dağılır. Bu onları yüklü kılavuz kurur crystallizing engelleyen örnek arabellek tuzları konsantrasyonu düşürür. Ayrıca, fosfat NS ile birlikte bir çökelti formu eğilimindedir.
7. Bir kılavuz hazırlamak ve para yatırma şartına örnek bir fincan.
   1. Örnek şartına, yapışkan bant ve PDMS blok bir parça alın ve uygulama ve toz yok olması için yapışkan bandı kaldırma PDMS üst kısmı temiz. PDMS engeli bir Petri kabına yerleştirin.
      Not: Yeni PDMS blok temiz oda alınır.
   2. Dikkatle seçmek bir ızgarası (Örneğin, Cu, Parlodion/C film ile kaplı 200 veya 400 mesh). Cımbız ile sadece ızgara kenarına dokunmak emin olun. Temiz PDMS blokta Karbon film yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
   3. Yer ile bir hava kızdırma-deşarj ünitesi ve ışıma kılavuzunda PDMS blok 20 için deşarj 0.4 mbar 100 W gücünde bir iyimsersin. Izgara kapalı kabında saklayın. Uzun kızdırma deşarj süreleri genellikle bir daha büyük ızgara üzerinde yatırılan örnek hacminin yaymak için yol. Sonuç olarak, leke katman daha ince olur (zayıf leke).
   4. önce daldırma zaman, 1dk cryoWriter cımbızla kızdırma taburcu kılavuz kavramak. Elektromıknatıs açık olduğundan emin olun; Aksi takdirde yazılım açın. Cımbız Elektromıknatıs üzerinde dağ ve kılavuz düz sahnede çiğ noktası, Karbon film tarafı yukarı hizalamak için el ile micromanipulator vida kullanın. Çiğ noktası sahne sıcaklık düzenlenmiştir emin olun örnek yüklendikten sonra buharlaşma oranını azaltmak için 1-2 ° C çiğ noktası yukarıda.
   5. Daldırma süre dolduğunda, "grid_save" üzerinde çift tıklatın. Microcapillary ipucu güvenli bir şekilde ızgara yüzeyi üzerinde yer alacak. El ile microcapillary İpucu Kılavuz temas getir. Meme tarafından 10 µm kaldırın ve merkezi üzerinde konumlandırın.
      Uyarı: Deterjanlar içeren bazı örnekler alt yüzey gerilimi nedeniyle sıvı reçete zaman microcapillary dış yüzeyi boyunca yukarı taşımak eğilimindedir. Bu tür kayıpları önlemek için kılavuz yüzeye yakın olmak çok önemlidir.
   6. 5 dağıtmak örnek ızgara üzerine nL. Ne zaman hızlı buharlaşma microcapillary ucundaki yer alır, Kuru bir günde, bir örnek çok uç olana da yavaş yavaş dağıtmak ve da sonra hızlı bir şekilde dağıtmak 5 nL.
   7. Microcapillary geri çekilin ve yavaş yavaş çiğ noktası sahne (DP-sahne) Kuru şartına örnek izin.
   8. Örnek nokta kuruduktan sonra kılavuz çıkarın ve kılavuz kutusu veya Petri kabına oda sıcaklığında saklayın.
   9. 500 dağıtmak nL microcapillary sistem sıvı ve hav bırakmayan bir doku ile çıkarın. 5 kere ile etanol, deterjan veya 1 M NaOH kılcal floş. Bu farklı bir örnek ile kullanılmak üzere izin microcapillary temizler.

2. Cryo kılavuz hazırlık

1. Aracı ve örnek hazırlamak için yukarıda açıklanan adımları 1,1-1,5 izleyin. NS gerekli değilse, 1.3 ve 1.5.2 adımları atlayın. Örnek arabellek değişimi veya diyaliz tarafından örnek cryo-EM için koşul için arabellek konsantrasyonu azaltmak için Örneğin, tuzlar veya tanıtmak için kullanın (Örneğin, trehalose, deterjanlar) katkı maddeleri istediğiniz arabellek NS yerine adım 1.3 ve 1.5.2.
2. Bir çift soğutucu kap içinde sıvı etan hazırlayın.
   1. Etan Kupası, soguk kutusu sahibi ve örümcek birleştirin ve sıvı azot ile ağzına kadar cryogen kapsayıcıyı doldurmak; genellikle yaklaşık 200 mL gerektirir. Etan Kupası soğuduktan ve sıvı azot ücretsizdir kadar birkaç dakika bekleyin.
   2. Etan gaz şişesi açacağız ve yavaş yavaş gaz akışı etan bardağa. 2-3 mm aşağıda üst seviyesidir ile sıvı etan dolduramazsınız izin; Bu birkaç dakika sürer ve yaklaşık 5 mL sıvı etan gerektirir.
   3. Cryo kutusunu alıp cryogen kapsayıcısında ücretsiz bir yuvaya yerleştirin.
   4. Örümcek kaldırmak, polystyrol kapak üstüne yerleştirin ve cryoWriter montaj cryogen kapsayıcı yerleştirin.
3. Kızdırma deşarj bir EM kılavuz.
   1. Yapışkan bant ve polydimethylsiloxane (PDMS) blok bir parça alın ve üst kısmı PDMS temiz uygulamak ve yapışkan bant (herhangi bir toz kaldırır) kaldırma. PDMS engeli bir Petri kabına yerleştirin.
   2. Dikkatli bir kılavuz kılavuz kutusundan seçin. Cımbız ile sadece ızgara kenarına dokunmak emin olun. Temiz bir PDMS blokta delikli Karbon film yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
   3. Yer PDMS blok bir plazma temizleyici ve plazma temiz kılavuzunda ile ızgara yüzey (Örneğin kullanım % 75 Ar/25% H_2, güç 50 W, basınç 25 mTorr). Kızdırma taburcu Izgara'yla PDMS blok bir Petri kabına yerleştirin.
4. Pozisyon kılavuz alet
   1. Kızdırma taburcu kılavuz cryoWriter cımbızla kavramak. Elektromıknatıs açık olduğundan emin olun; Aksi takdirde yazılım açın. Cımbız Elektromıknatıs üzerinde dağ ve kılavuz düz sahne alanı'nda, Karbon film tarafı yukarı hizalamak için el ile micromanipulator vida kullanın.
   2. "Grid_save" üzerinde çift tıklatın. Ucu yaklaşık 10 µm ızgara yüzeyi yukarıda olması microcapillary pozisyonunu ayarlayýn. Gerekli microcapillary çekilme birkaç mikrometre microcapillary serbestçe ızgara üzerinde herhangi bir yere, dokunmadan taşıyabilirsiniz olduğunu emin olun.
   3. Geri kılavuz merkezine gidin ve yeni konumu "kılavuz" olarak kaydet.
      Uyarı: Doğru adlandırma iş makro komut dosyası için zorunludur.
5. Örnek ve dalma-freeze kılavuz yazmak.
   1. Microcapillary nanoliters sistemi sıvı birkaç onlarca ile temizleme ve hav bırakmayan bir doku ile microcapillary herhangi bir damla kaldırmak.
   2. Makro komut dosyasını başlatmak. Makro aşağıdaki adımları gerçekleştirir:
      1. 5 dağıtmak nL (herhangi bir hava kabarcıkları uç kaldırmak için) ve örnek konumuna gidin.
      2. Aspiratı 65 nL örneği. 5 demlemek nL örnek tüp içine geri. Bu hesapları sistemi için tepki ve senkronize yazma, yaniizin., bu dağıtım sağlamak ve aynı zamanda hareket başlangıç sahne için.
      3. "Kılavuz" konuma getirin.
      4. 'Aynı anda 45 dağıtımı ızgara üzerinde taşımak microcapillary neden olacak yazma desen' başlatmak nL örneği.
      5. Daha sonra microcapillary geri kılavuz, merkezine taşımak başka bir 10 µm düşürebilir ve aşırı örnek sıvı çekmek.
      6. Microcapillary geri çekilin ve Elektromıknatıs açmak. Bu buz gibi cımbız ve başlatır dalma serbest bırakır.
6. Cımbız kavrama ve dikkatli bir şekilde pistonu manyetik bağdaştırıcısından serbest bırakmak. Hızlı kılavuz etan bardaktan cryo kutusu içeren cryogen konteyner içine aktarmak ve kılavuz ücretsiz bir yuvaya yerleştirin.

3. tek hücreli Lysate hazırlık

1. Microcapillaries adım için hazır olun.
   Not: Konik (lazer çekti ve incelenen) erimiş silis microcapillaries bir koruma polimid kaplama kaplama incelen işlemi sırasında yanmış nerede belgili tanımlık uç dışında dış var.
   1. Microcapillaries bir iletken tabaka kat için yukarı doğru işaret eden ipuçları ile metal bir demiryolu üzerinde bir 45 ° açıyla mount. Kaplamasız polimid en iyi mühür daha sonra istihdam basın-fit konektörleri ile formlar gibi alt sonuna (2 cm) ipuçları, kalkan bir alüminyum folyo kullanın.
   2. Sputter mevduat 20 bir yapışkan tabaka nm Ti/W ve sonra 200 nm-kalın tabakası Pt.
2. Microcapillary ipucu hidrofobik olun.
   1. 1-dodecanethiol alkol içinde 1 M çözeltisi hazırlamak.
   2. Parlaklık-deşarj 0.4 mbar 100 W güç ile 1 dakika havada microcapillary.
   3. 1-dodecanethiol 1 M çözüm microcapillary ucu (ideal gece) bir kaç saatliğine bırakın.
      Not: İpuçları, taze kullanmadan önce bir gün hazırlanmak en iyisidir.
3. Yeni microcapillary yükleyin.
   1. Microcapillary 1-dodecanethiol çözümden kaldırmak, dış etanol ile durulayın ve iç kullanarak etanol ile yıkayın.
      Not: functionalized hiçbir microcapillaries yoksa, hızlı bir şekilde kızdırma bir microcapillary ucu deşarj ve PDMS ve sülfürik asit karışımı ticari araç pencere tedavi bir düşüş daldırma. Elde edilen hidrofobik functionalization kadar iyi ile 1-dodecanethiol, ama genellikle yeterli değildir.
   2. Kaplamasız sonuna kılcal bir kesici ile ayırmak.
      Not: Temiz bir kesik ile basın-fit bağlamak iyi bir sızdırmazlık için önemlidir.
   3. Gümüş Yapıştır polimid kaplama lazerle kılcal çekerek sırasında yandı zaman cam ve polimid kaplama arasında oluşan keskin yatılı uygulamak için bir kürdan kullanın.
      Not: Bu takviye Pt kaplama bu bölgede çok zayıf olduğunu ve elektrik iletim kolayca aşağı zarar verebilir gibi gereklidir.
   4. Polimid sonuna microcapillary aseton ile yıkayın. Aseton küçük bir damla sonunda bırakın ve basın-fit bağlayıcı ağız ekleyin. İyi bir mühür oluşturmak için hafif basınç uygulayın.
4. Microcapillary pozisyon kalibre.
   1. Araç üzerinde açın ve belgili tanımlık bilgisayar yazılımı 1.1. adımda açıklandığı gibi başlatın. Ayrıca, mikroskop kamera ve işlev üreteci başlatılamıyor.
   2. Bir cam mikroskop slaytta slayt tutucusuna mikroskop yer.
   3. Alt cam slayt ve merkezi yakın microcapillary üzerinde o kadar mikroskop objektif mikroskop kamera görünümünde görünür. X ve y ekseni doğrusal aşamaları microcapillary ucu resmin merkezine konumlandırmak için kullanın. Cam slayt hafifçe dokunana kadar ucunu yavaşça indirin.
      Uyarı: Son yaklaşma yolunda çok küçük adımlar (5 mikron) seçin. Aksi takdirde, ucu zarar görebilir.
   4. "Meme kalibre" düğmesine basın. Bu microcapillary geri çeker pozisyon ev 40 mm ve bu pozisyon olarak ayarlar.
5. Hazırlık damgalı PDMS parçaları ve ITO slaytları
   1. Mix PDMS crosslinker 10:1 oranında, dökün ve büyük bir petri derinliğe, yaklaşık 2-3 mm. Bake 60° C'de içine birkaç saat içinde bir hibridizasyon inkübatöre veya benzer aygıt için.
   2. Bir çekiç ve bir pul (12 mm çapında) ile PDMS katmanındaki delik. Daha sonra bir neşter 2 cm uzun kare veya dikdörtgen delik mikroskop slayda sığdırmak damgalı parçalar elde etmek için de dahil olmak üzere kesmek için kullanın. Genellikle, iki damgalı parçalar bir mikroskop slayt üzerine monte edilir.
   3. PDMS parçaları ve ITO slaytları % 70 etanol ile ve daha sonra ilk deterjan ile yıkayın. Onları, ıslak, bir petri ve etanol tam izin yer buharlaşır 60° C'de bir fırın
   4. Kızdırma-ITO slaytları için 1 dk 100 W güç 0.4 mbar ile debi ve 1 mL kaplama çözeltisi (Örneğin, poli-L-lizin (PLL)) uygulayın. 5 min için kuluçkaya, çözümü bir pipet ile kaldırmak ve 1 mL GKD₂O. biraz uygulamak için 1 dk kışkırtmak ve GKD₂O bir pipet kullanarak kaldırın. 60 ° C'de kuru slayt izin
6. Hücre kültürü hazırlayın. Standart yapışık hücreli kodlamayla Protokolü (Örneğin, Arnold, et al. izleyin ^{24 , 25}). tohum ITO hücrelerdeyse sırasında normal bölme/passaging çalışır.
   1. Taze PLL kaplı ITO slayt alıp PDMS parça ekleyin. Su geçirmez mühür oluşturmak için bazı basınç uygulayın. Bu onların temel olarak küçük wells ile slayt oluşturur.
   2. Yaklaşık 300 µL PDMS wells taze orta askıya hücre ekleyin. Tohumlama yoğunluğu iyi başına yaklaşık 75.000 hücre olmalıdır.
   3. ITO slaytları için standart koşullar altında 1-2 gün kuluçkaya.
7. Hücre lizis deneme için hazırlayın:
   1. Elektroporasyon arabellek (Örneğin, fosfat tamponlu tuz (PBS)) bir kaç mililitre önceden ısıtmak.
   2. Kurulum için NS-EM kılavuz hazırlama hazırlamak
      Not: Kurulum hazırlama ayrıntıları adımları 1,1-1,5 (NS) veya adıma 2.1-2.4 (soğuk) gösterilir. Burada NS-hazırlık için en önemli adımları açıklar.
      1. NS bir 100 ya da 200 µL PCR tüp NS (Örneğin, piyasada bulunan % 2 methylamine tungstate) 100-150 µL ile doldurarak hazırlayın. Tüp enstrümanın soğutmalı örnek destek koyun.
      2. Microcapillary NS PCR Tüp taşıma, ucu NS çözüm içine sokmak ve bu konumu "leke" olarak kaydet.
   3. Yük standart lizis parametreleri, Örneğin, lizis gerilim.
   4. ITO slayt kuluçka makinesi almak ve mikroskop Ekle monte edin. İki vidayı slayt üzerinde alüminyum Ekle düzeltmek için kullanıp ITO arasında elektriksel temas sağlamak için kaplama elektrikli topraklı alüminyum çerçeve ve slayt.
   5. Hücre kültür orta kaldırmak ve iki kez 300 µL Elektroporasyon arabellek ile yıkayın. Hücre çoğalmasıyla arabellekte tutmak.
   6. Kurulum canlı hücre kuluçka sahnede ITO slayt holding alüminyum Ekle yerleştirin.
   7. Hücre kültürü içinde mikroskop görünüm bulun ve hiçbir hücre ile bir alanı seçin. ITO yüzey için belgili tanımlık uç yaklaşım ve hafifçe dokun, sonra ucu 100 µm geri çekilin ve konumu "hücre" olarak kaydet.
   8. Hızlı bir şekilde hücre kültürü tutun ve nanoliters sistem sıvı birkaç onlarca microcapillary ucuyla sifonu ardından tekrar hücre kültürü koy. Bir kaç nanoliters kabarcıklar ucunda hapsolmuş hava sağlamak için PDMS kuyunun içine daldırma sırasında dağıtmak.
   9. Yavaşça ITO yüzey yaklaşım (başlangıçta, pozisyon "hücre", yaniolmalı., 100 µm yüzey yukarıda). İletişim ipucu 10 µm geri çek.
   10. Yakındaki bir hücre lizis için seçin. Hedef hücrenin üstündeki microcapillary ucu bir yer.
8. Tek hücre lizis için makro script başlatın.
   1. Bir hücre başarıyla lysed sonra adı microcapillary pozisyon için taşınması gereken. Bu NS rezervuar (NS-EM), desalting arabellek (cryo-EM) veya EM kılavuz (cryo-EM) olacaktır. Yazım hatalarını önlemek ve "ok" tuşuna basın.
   2. Makro Kullanıcı müdahalesi olmadan devam eder:
      1. i) mikroskop sahne ve hücre kültür 100 µm hedeflenen hücre anlık görüntüsüdür sola, taşınır alınan ve 50 nL GKD₂O sistem sıvı microcapillary reçete. Bu yerinden ve yüksek salt arabellek sulandırır ve ozmotik basınç hücreye uygular.
      2. II) Sahne ucu hedeflenen hücre yeniden konumlandırmak için geri taşınır. Önceden tanımlanmış gerilim patlama uygulanır ve 500 ms sonra pompa sistemi 3 Aspire başlar nL örneği 2 µL/dk akış hızında.
      3. III) sahne alanı tekrar, hücre kontrol için izin sola taşınır. Bir pencere, Kullanıcı girişi için soran görünür.
   3. Lizis adım başarılı olup olmadığını söylüyorlar.
      1. Cevap hayır, al, microcapillary floş ve yeni bir hücre hedef eğer.
      2. Cevap Evet ise, bir anlık görüntüsünü kaldırıldı (lysed) hücre alınır ve daha sonra microcapillary 3.8.1 içinde belirtilen konuma taşınır. Bu NS veya bir arabellek rezervuar ise, 3 x 0.5 dağıtmak için standart Kullanıcı arabirimini kullanan nL microcapillary süre sıvı hava hava kabarcığı yok emin olmak hareket ediyor. İpucu rezervuar sıvı içinde makro tarafından batırılır.
         Not: Örnek durumu ve Izgaralar 1.6.9 - NS-EM veya bölümün 2.2-2,6 cryo-EM için 1.7.9 bölümlerde açıklandığı şekilde hazırlamak devam edebilirsiniz. Aşağıda, NS-kılavuz hazırlanması için gerekli adımları açıklanmıştır.
   4. Meme geometri bağlı olarak 8-12 dk için dalmış microcapillary bırak
      Not: Yüksek fosfat konsantrasyon arabelleği için klima daha uzun bir daldırma süresi gerektirir.
   5. 5 dağıtmak nL şartına hücre kılavuz lysate.
   6. Microcapillary geri çekilin ve izin şartına örnek çiğ noktası sahne (DP-sahne) yavaş yavaş kuru 1-2 ° C çiğ noktası sıcaklığı düzenlenir.
   7. Izgarayı çıkarın ve kılavuz kutusu veya Petri kabına oda sıcaklığında saklayın.

Sonuçlar

"CryoWriter" Kur ( Şekil 2' deki görülen) Şekil 1C, Dönerilen küçültülmüş EM kılavuz hazırlama prosedürleri test amacıyla geliştirilmiştir. Resim 2 A bir ters floresans mikroskobu monte çeşitli bileşenlerinin özetini gösterir. Hücre kültürü çalışmalarının modülü mikroskop sol tarafında yüklü; EM kılavuz hazırlık için bir modül sağda yer alır. Hücre kültürü çalışmalarının modülü (Şekil 2B) tarafından ışık mikroskobu yapisan ökaryotik hücrelerin büyümesini ve hücre kültürü canlı hücre görüntüleme sağlar. Tek tek hücreleri ozmotik şok, Elektroporasyon ve hücre içeriğinin aspirasyon microcapillary (resim 2B, Şekil 6A)^24,25içine kombine eylem tarafından lysed. Emişli lysate örnek daha sonra ızgaralar NS - veya cryo-EM için hazırlamak için kullanılabilir. Alternatif olarak, bir hisse senedi protein çözüm PCR tüp içinde örnek kaynağı olabilir. İstihdam microcapillary (resim 2B) bir yüksek-tamlık pompa sisteminde emişli ve alt-nL hassasiyetle kalmaması için örnek birimlere bağlı. Protokolleri ayrıntılı olarak tüm örnek işleme bu microcapillary içinde veya EM kılavuz kendisi önemli örnek ulaşım olmadan gerçekleştirilir. Örneğin, aynı microcapillary tek tek ökaryotik hücreleri parçalayıcı, lysate Aspire edin, bu durumu ve son olarak aliquots EM ızgaralar üzerine dağıtmak için kullanılır. Kılavuz hazırlık modülü tam kontrollü (Şekil 2C) olmak üzere yerleştirilen EM kılavuz sıcaklığı sağlayan hareketli bir DP-sahne oluşur. NS-TEM için hazırlanmış örnek kılavuz sonra sadece soğuk sahne alanı'ndan kaldırılır ve oda sıcaklığında havada kuru izin. Ancak, o zaman neden olabilir sözde kahve-ring etkileri nerede protein 'parçacıklar' sayılır nicel TEM için kaçınılması gerekir. Izgaralar bunu yapmak için yavaş yavaş sıvı buharlaşma yavaş yavaş yavaş artan bir sıcaklık gradyanı kullanarak DP sahnede kurutulur. Cryo-EM için kılavuz sıcaklığını çiğ noktası yakın tutulur; gerekirse bir algılayıcı tarafından izlenebilir kontrollü buharlaşma örnek sıvı ince film istikrar ve inceltme, için izin vererek pozitif bir uzaklığı yaklaşık 8 ° c seçilir²⁶. Seçilen inceltme zaman sonra bir çekme ve dalma mekanizma etkinleştirilir ve örnek Vitrifiye (Şekil 2C). Dalan bu mekanizma oda sıcaklığında saklanan NS-EM ızgaralar için gerekli değildir unutmayın.

Resim 2: cryoWriter ayarının Özeti. A) cryoWriter ayarının Özeti monte bir ters ışık-mikroskobunun (1). B) iç metin alanının bir minyatür PDMS tabanlı hücre kültür plaka (4) yer alan örnek manipülasyon ve hücre lizis için microcapillary (3) ile panelinde A. hücre kodlamayla yuvası (2), sol tarafında gösterilir. C) iç metin alanının belirtilen paneli A. 'çekme-ve-dalma' mekanizması içinde sağ tarafta. Delikli Karbon film EM kılavuz (5) Cımbız (6) ipuçları arasında monte edilmiş ve ana metin çiğ noktası sahne (DP-sahne) adı verilen doğrudan temas ısı kontrollü evre (7), yatay olarak yerleştirilmiş. Sahne sıcaklık sıkı bir PID denetleyicisi ve, ya da çiğ noktası sıcaklığı, ortam ortama bağlı yakın tutmak bir su soğutmalı Peltier öğesi üzerinden kontrol edilir. DP-Etap (7) ızgara microcapillary göre hareket için bir motorlu xy eksende monte edilir. Microcapillary kendisi z sahnede monte ve çok EM kılavuz yüzeye yakın olana indirdi ve nanoliter ölçekli (sürekli ince karbon için bir katman NS-EM veya cr için delikli Karbon film kapsayan örnek Destek birimlerini dağıtmak için kullanılan Yo-EM). Sıvı alımı ve dağıtımı yapılır ki yüksek hassasiyetli pompa sistemi (8) kullanarak unutmayın. Kullanılmış sıvı bir sarmal şeklinde kılavuz microcapillary göre hareket ettirerek dağıtılabilir. Cryo-EM hazırlık için çekme ve dalma dondurucu mekanizması (9) hızla içine sıvı etan (10) hızlı soğutma ve örnek vitrifikasyon örnek yüklü kılavuz aktarır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 cryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan NS-EM ızgaralar için elde temsilcisi sonuçları gösterir. Microcapillary ucu 5 ile dolu olduğunu nL bir hisse senedi çözümden örnek ve birkaç dakika için NS çözüm (%2 methylamine tungstate) bir rezervuar içine daldırma galvaniz NS ve Tuz iyonları diffusive değişimine izin ver (Arnold, teorik için bkz et Al. ²⁴). daha sonra klimalı örnek bir NS-EM ızgara ince Karbon film reçete ve kurutulmuş. Şekil 3 A kantitatif TEM için gerektiği gibi tam damlacık görselleştirmek için aynı şekilde bir yuvası ızgara kullanımını gösterir. Kahve yüzük etkisi önlemek amacıyla, taze glow taburcu kılavuz başlangıçta çiğ noktası sıcaklığı (su buharlaşma) düzenlenen ve yavaş yavaş DP sahnede ısıtacağız. Unutmayın, çoğu uygulama için (Örneğin, kalite kontrol örnek veya yapısal analizi) değil yavaş kuruyan bu işlem gereklidir. Yüksek kaliteli NS-hazırlıklar Şekil 3B, Cgösterildiği gibi o olmadan elde edilir. Klima fosfat içermeyen düşük tuz arabellekleri için yaklaşık 3 dk, Örneğin, düşük tuz Tris-tampon (20 mM Tris-HCl pH 7.4 ile 50 mM NaCl), ile tütün mozaik virüsü (TMV) kullanarak Şekil 3B gösterildiği örnek olarak zamanlardır. Şekil 3 TMV PBS arabellekte (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) olduğu gibi C bir en kötü durum senaryosu sunar. Fosfat iyonları gerekli Klima zaman (7 dakika) uzatma geçici kristaller (bkz Şekil 5C) NS, ağır metal iyonları ile oluşturur. Diğer ağır metal tuzları da kullanılabilir kılavuz hazırlık modülü, Örneğin, %2 methylamine vanadat veya amonyum molibdat ile (Ayrıca Arnold, et al. bkz: ²⁴). ancak, uranyl asetat uygun; değildir Adsorpsiyon bir karbon film önce (bkz Şekil 5E)²³protein örnek çözümü, şartına Eğer bu leke crosslinking etkisi için toplamları açar.

Şekil 3: tipik sonuçları Şekil 1' deCbelirtildiği gibi cryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan NS ızgaralar için. A) bir yuvası ızgara üzerinde Klima ile % 2 methylamine tungstate sonra reçete 3 nL damlacık görüntüsünü genel bakış. B) 20 mM TRIS arabelleği TMV. İlave bir 3 x büyütme belirtilen bölge gösterir. Arnold, et al.²⁴ uyarlanmış (excerpted malzeme ilgili ilave izinleri yönetmen için ACS). C) tütün mozaik virüsü (TMV) PBS arabelleği. İlave bir 3 x büyütme belirtilen bölge gösterir. Arnold, et al.²⁴ uyarlanmış (excerpted malzeme ilgili ilave izinleri yönetmen için ACS). Ölçek çubukları: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

CryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan cryo-EM ızgaralar için elde tipik sonuçları Şekil 4' te tasvir edilmektedir. Paneli 4A vitrifiye örnek tarafından bölgeyi kılavuz Atlası gösterir. Paneli 4B vitreus buz polimerlerin bir seçili kılavuz yuvasında gösterir. Her iki durumda da, 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl arabellek % 0.05 Fos 14 deterjan içeren örnek oldu. Birçok örnekleri ve arabellekleri test edildi ve karşılaştırılabilir yüksek kalite vitreus buz elde edildi, ama gerekli koşullar arabellek bağımlı (Ayrıca bkz: tartışma Şekil5). Panel 4C apoferritin parçacıklar ve bir bakteriyofaj kontrastı arttırmak için yüksek odak yansıma Tris-HCl tampon (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7,4) gösterir. Panel 4D amphipoles tarafından stabilize bir 200 kDa membran protein gösterir.

Şekil 4: tipik sonuçları Şekil 1' deDbelirtildiği gibi cryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan cryo-EM ızgaralar için. Örnekleri ve arabellekleri gösterilen örnekleri değişir. Tüm örneklerini delikli karbon filmler doluydu. A) kolaj bir 150 kDa membran protein, vitreus buz çevre içeren örneği ("kılavuz atlas") genel bakış görüntülerin Beyaz oklarla belirtilir. B) büyütülmüş kılavuz yuvadan vitreus buz ile delikli Karbon film gösterilen aynı arabellek ile hazırlanan bir kılavuz. Bazı delikler Beyaz oklarla gösterilmiş örnek arabellek ile dolu değil. C) karbon delikle vitrifiye örnek apoferritin protein kompleksleri ve bacteriophages içeren. İç metin: bir bakteriyofaj kuyruğunun gösterilen iki kat büyütme. Beyaz yıldız işareti karbon film gösterir. Not görüntü kontrastı arttırmak için yüksek odak ile kaydedildi. D) A 200 kDa membran protein amphipols içinde yeniden düzenlendi. İç metin: belirtilen bölgesinin yüksek kontrast ile gösterilen bir 2 x büyütme. Ölçek çubukları: A, 100 µm; B, 10 µm; C ve D, 80 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

CryoWriter Kur optimal EM-grid hazırlık koşullar için eleme sistematik sağlar; Şekil 5içindeA bir örnek gösterilmiştir (25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, % 0.05 apoferritin Fos 14). Bu deneyde, "sıcaklık inceltme" vitreus buz çeşitli, ama inceltme zaman (yani, örnek uygulama ve dalma donma arasındaki zaman aralığı) sabit kaldı (1 s). Düşük mahsup sıcaklıklarda (Örneğin, 8 K), örnek tabakası çok kalın. Mahsup daha yüksek sıcaklıklarda, deliklere vitreus buz ince (10 K, 12 K), (yukarıda 18 K) bazı aşamada kılavuz tamamen kabul edilene kadar kuru (değil gösterilir). Sonuçları burada, siyah oklarla gösterilmiş bir uzaklık 12 K kurşun vitreus buz büyük bir homojen bölgesine sunulan. Bu en iyi duruma getirme deneyler "test" proteinler (örneğin, apoferritin) kullanarak hedef örnek arabelleği ile gerçekleştirilebilir. En iyi koşullarda bulundu daha sonra hedef örneğine uygulanır. Ayrıca, ızgaralar uzak optimum parametreleri ile hazırlama işlemi sırasında sık sık tanınır ve elektron mikroskobu, önemli zaman tasarrufu taranması gerekmez. Şekil 5 de tipik cryo-EM (masası B) ve NS-EM (E panelleri C) eserler bir galeri cryoWriter kurulum belirli gösterir. Cryo-EM ızgara paneli 5B % 0,1 disil-β-D-maltopyranoside (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM) içeren PBS TMV ile gösterilen aşırı inceltilerek. Görüntünün arka plan grenli çünkü tuz konsantrasyonu çok yüksek oldu. Genel olarak, bir örnek görsel görünümünü tuz konsantrasyonunun doğrusal bir fonksiyon olmak görünmüyor; bir eşik konsantrasyon inceltme işlemi sırasında ulaşıldığında tahıl aniden önemli olmak. İstenmeyen maddeleri bir klima adım kılavuz hazırlık önce tarafından kaldırılabilir Protokolü bölümü 1,6 NS-EM için açıklandığı gibi not. NS diğer yapıları neden olabilir. Panel 5 C gösterilen örnekte, PBS arabellek (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) örnek olmadan 3 dk. Precipitates için % 2 methylamine tungstate şartına ve kristalleri vardır belirgin ve çatlaklar için önde gelen karbon yüzeyinde geniş kuvvetler uygularlar. Precipitates tek formda belirli bir PBS ve NS konsantrasyon aralığı ve daha uzun ( Şekil 3C) karşılaştır için örnek Klima tarafından kaçınılmalıdır. Panel 5D "kahve yüzük" sergileyen kullanılmış NS örnek damlacık çevre gösterir. Bu nicel, toplam numune analizine rahatsız ve EM kılavuz örnek uygulama sırasında çiğ noktası sıcaklığında tutmak ve sonra yavaş yavaş artan sıcaklığı kuru için ( yani, kurutma işlemi yavaşlatarak önlenebilir Şekil 3Abakın). Paneli 5E (apoferritin 20 mM HEPES, pH 7,0, klimalı 3 dk.) önce onlar Karbon film çekmek için adsorbe, koşul protein örnekleri için kullanılamayan % 2 uranyl asetat leke crosslinking faaliyet gösterir.

Şekil 5: sistematik değişiklikleri ve eserler gözlenen ne zaman cryoWriter set-up ızgaralar NS - ve cryo-EM için hazırlamak için kullanıldı. A) sistematik vitreus buz kalınlığı varyasyon; cryo-EM için kılavuz hazırlık duruma getirilmesi. Çeşitli (8 K 12 K) tutmak inceltme zaman sabit DP sahneyi mahsup sıcaklığını yapıldı (1 s). Oklar örnek katman çevre gösterir. B) tuz etkileri; çok yüksek oranda konsantre, yani, inceltme adım çok uzundu. İlave bir 2 x büyütme belirtilen bölgenin gösteriyor. C) tuz PBS arabellek heavy metal tuzları huzurunda oluşturduğu precipitates. PBS arabellek içeren örnekleri örnekleri diğer arabelleklerindeki daha uzun süre şartına gerekir. PBS arabellek örnek olmadan % 2 methylamine tungstate 3 dakika içinde burada, diğer örnek arabellek tipik bir süre şartına. Karbon film ince destek kurutma işlemi sırasında hareket precipitates güçlü kuvvetlerden nedeniyle en büyük olasılıkla belgili tanımlık çatlamak unutmayın. D) 'Kahve ring' etkisi. E) 3 dk. Uranyl iyonları önemli crosslinking faaliyet ve apoferritin sergilemek için % 2 uranyl asetat şartına Apoferritin formu büyük toplamları kümeleri. Ölçek çubukları: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Küçük bir bölümü ve hacimli cryoWriter kurulumu kullanarak EM kılavuz hazırlanması için gerekli yeni deneyler türleri sağlar. Örneğin, tek bir hücre Toplam içeriği toplanan ve NS - ve cryo-EM için hazırlanmış. Yordamı Şekil 6'Abelirtilir. Yapışık, ökaryotik hücre (HEK 293) eşzamanlı Elektroporasyon ve örnek aspirasyon (Panel 6A)²⁵tarafından lysed. 3 toplam hacmi nL emişli, hangi lysate hücresi ve diğer işlemler microcapillary korunur. NS-EM Panel 6B gösterildiği için hücre kültürü çalışmalarının orta PBS arabellek (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) hücre lizis önce alışverişinde. Hücre içeriğini 3'te Aspire nL arabelleği ve NS bir rezervuar Şekil 1' deC için 10 dk. sonra gösterildiği gibi şartına, 5 nL seviyesini bir NS-EM kılavuz sürekli Karbon film reçete. Bireysel proteinler, Örneğin, ipliksi aktin ve zar düzeltme ekleri bağlı proteinler ile görüntünün içinde kabul edilebilir. Cryo-EM, Şekil6 Cgösterildiği için 3 hacmi nL Tarih reçete delikli karbon EM kılavuz sıvı kaldırmak için yeniden aspirasyon olmadan. Oluşan örnek nispeten kalın film kapsamlı vitrifikasyon önce inceltilerek. Bunu yapmak için DP kademeli sıcaklık yavaş yavaş, çiğ noktası sıcaklığında başlayan yükseltilmiştir. Önceden belirtilen bir eşik 'çekme ve dalma' mekanizması ve örnek Vitrifiye (için Ayrıntılar bkz: Arnold, et al. tetikleyen ulaşıldı kadar inceltme işlemi gerçek zamanlı sensör sistemi tarafından izlenen yapıldı. ²⁶). membran yapılar ve proteinler resimdeki tanıdı.

Şekil 6: tek hücre görsel proteomik cryoWriter kurulumu kullanarak. A) tek bir yapisan ökaryotik hücre lizis. Hücre (1, yeşil) bir functionalized, ITO (kırmızı) kaplı cam-slayt (2) içinde bir minyatür petri kabına (3)²⁵üzerinde büyüyor. ITO katman elektriksel olarak topraklanmış olduğunu. Hücre platin ile kaplı (4), microcapillary tarafından yaklaştı. Bir ilk ozmotik şoku (değil gösterilir) bir dizi elektrik ve lysate hücre aspirasyon sırasında sarf kesme kuvvetleri tarafından gerçekleştirilen lizis kolaylaştırmak için verilir. İşlem tarafından ışık mikroskobu izlenebilir; mikroskop objektif lens belirtilen (5) ' dir. Ayrıntılı bilgi için bkz: bizim önceki iş^24,25. B) NS-EM görüntüsünü lysate bir bireysel HEK 293 hücreden. İpliksi aktin ve membran yamalar bağlı proteinler ile görülebilir. Arnold, et al.²⁴ adapte paneli (excerpted malzeme ilgili ilave izinleri yönetmen için ACS). C) Cryo-EM görüntüsünü lysate bir bireysel HEK 293 hücreden. İlave bir 2 x büyütme ile ilişkili proteinler tipik membran yapılar görünür nerede belirtilen bölge gösterir. Paneli C adapte Arnold, et al. ²⁶ ölçek çubukları: B, 50 nm; C, 80 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

'CryoWriter' alet takımları ve örnek ızgaralar için NS - ve cryo-EM boyutlu nL toplam örnek birimlerden hazırlamak ve tamamen klasik kağıt kurutma adım önlemek için gerekli iletişim kurallarının sunulmaktadır. Mikrosıvısal ilke ve micromechanical sistem bu mümkün yapmak için cryoWriter içinde birleştirilir.

Bizim deneyim bu el yazması sunulan mini yöntemleri kullanıldığında, parametre alanı EM-kılavuz hazırlanması için klasik yöntemleri için ve sıkı Kullanıcı denetimi altında daha büyük olduğunu gösterir. Önemlisi, artan tekrarlanabilirlik elde gerçek deneme yapılmadan önce optimum parametreleri belirlemek için hazır test protein ile tamamlanmaktadır örnek arabellek sistemiyle ön ekran olanak sağlar. Bu örnek ilgi tüketimi için mutlak minimum tutar ve şiddetle tavsiye edilir. Her iki NS ve cryo EM kılavuz hazırlanması için kritik adımlar vardır: (i) emişli pompa sistemi; alt-nanoliter birimi dağıtımı için sistem sıvı (su) degassed olmalı ve ücretsiz kabarcık. (ii) kesin bir ışıma deşarj veya plazma adım temizlik denetim; EM ızgara yüzey özellikleri için tekrarlanabilir sonuçlar açısından büyük önem taşıyor. (iii) örnek Klima; Örneğin, NS, Merkezi Klima, için gereken süreyi ara bellek türü, tuz içeriği ve konsantrasyon (Şekil 3) yanı sıra microcapillary²⁴meme geometrisini bağlıdır. (iv) buharlaşma oranlarını nicel EM NS-EM hazırlıkları için; kahve-ring etkisi kantitatif analiz NS-EM hazırlıkların yasaklayabilir ve yavaş buharlaşma oranlarını DP sahneyi tarafından kontrollü tarafından bastırılmış gerekir.

Sunulan ızgara hazırlama yöntemleri farklı yönlerini serbestçe belirli örnekleri için çok yönlü iletişim kuralları gelişimi sağlayan kombine edilebilir. Tipik örnekler Klima adım kılavuz hazırlık cryo-EM için önce yüksek çözünürlüklü EM, Örneğin, gliserol, engelleyen bir madde kaldırılması olacaktır; Arabulucu moleküllerin, Izgaralar hazır mısın önce Klima tarafından ligandlar, giriş; ya da tek hücre NS - veya cryo-EM tarafından (Şekil 6) lysate incelenmesi.

Havacilik ve sunulan yöntemler miktarlarda en az örnek kullanımı tamamen kağıt kurutma adımları gereksinimini ortadan kaldırır. Bunun büyük bir avantaj nedeni kağıt kurutma proteinler, potansiyel olarak istenmeyen iyonları ile örnek kirletici ve doğal olarak büyük örnek kaybı için önde gelen sert bir tedavidir. Öte yandan, cryoWriter kullanıldığında potansiyel olarak hava-su arabirimi cryo-EM örnekleri klasik şekilde hazırlanır zaman ince örnek film nedeniyle etkileri önlenmesini değil. Izgaralar cryo-EM için uygun örnek uygulama ve Vitrifiye (veri gösterilmez) arasında daha az 0.2 s bekleme süresi ile hazırlanabilir. Ancak, protein bir nanometre birkaç nanosaniye birkaç onda tarafından difüzyon seyahat gibi hala var. onları 100 nm kalın örnek film hava-su arayüzü ile birkaç kez çarpışmak yeterli zaman Ancak, hava-su arabirimine yapışmasını protein miktarı önemli ölçüde bu kısa sürede boşlukları tarafından azaltılmış olabilir ve proteini denatürasyon engelleyebilir veya kısıtlanmış parçacık yönlendirme. Hassas proteinler hava-su arabiriminden korumak olabilir başka bir umut verici yaklaşım düşük moleküler ağırlıklı yüzey-aktif maddeler maddeler tarafından örnek film karşılamaktır. Bu bileşiklerin hızla bir klima adım kılavuz hazırlık önce cryoWriter'tarafından tanıtıldı. Örnek potansiyel olarak belirsiz adsorpsiyon tarafından microcapillary yüzeye kayıp olabilir ve kantitatif analiz parçacık sayma tarafından rahatsız mikrosıvısal sistemlerinin yüksek yüzey hacim oranı cryoWriter daha fazla bir kısıtlamasıdır. Sorunu iki şekilde ele: ilk olarak, örnek microcapillary içinde uzun mesafelerde seyahat değil. Gerçekten de, nanoliter numune hacmi kapiler uç işleme boyunca kalır. İkinci olarak, hacim oranı yüzeye daha da microcapillaries nispeten büyük iç çapları, Örneğin, 180 µm. ile üçüncü kullanarak azalır, microcapillaries yüzeylerin kolayca gerekirse, düzgünleştirilecek onları tedavi tarafından Örneğin, piyasada bulunan polylysine etanol glikoller (PLL-PEG) ile.

Proteinler tarafından EM içinde kullanılan tek parçacık yaklaşımı yüksek çözünürlüklü analiz sadece 100.000 bireysel protein parçacıkların bir kaç milyon resimlere gerektirir. Bu mikrosıvısal teknikleri yapısal soruşturma için yeterli protein kompleksleri sağlayabilir anlamına gelir. Protein kompleksleri (yaklaşık 1 saat) (yaklaşık 40.000 hücreleri) en az hücre tutarlardan hızlı yalıtım için bir mini IMMUNO-yağış yöntemi önceki²⁸geliştirilmiştir. Bu yöntem artık doğrudan cryoWriter küçültülmüş örnek hazırlık aşaması için bağlanır. Nihai amaç az iki saat içinde tüm gerektiren ultra-hızlı protein yalıtım ve cryo-EM kılavuz hazırlanması için bir tümleşik mikrosıvısal boru hattı geliştirmektir. Ayrıca, Şekil 6, dakika tutar ve numune hazırlama ve neredeyse kayıpsız klima ve cryoWriter kullanılarak elde kılavuz hazırlama prosedür için gerekli malzemenin hacmi gösterildiği gibi protein çalışma olanak sağlar tek tek hücreleri kompleksleri. Birlikte, biz son zamanlarda Isı şok deneyler²⁴için gösterildiği gibi minyatür IMMUNO-yağış yöntemi ve cryoWriter "tek hücre görsel proteomik" adlı yeni bir proteomik yöntemi temeli yatıyordu. "Görsel proteomik" görüntüleri analiz için tasarlanmış veri analizi algoritmaları şu anda test edilmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liquid handling
Microcapillary tip	New Objective	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve	New Objective	CONGAS-1	Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector	BGB-Analytik	2525LD	Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25
Syringe 10 µl	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)
Syringe pump controller	Cetoni	A3921000093	neMESYS controller
Syringe pump dosing unit	Cetoni	A3921000095	neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor	Meltec	UFT75-AT	Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller	Cooltronic	TC2812	PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 mm
Water-cooling block	-	-	Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block	-	-	Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis	Dyneos AG	M-404.2PD	High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage	Prior Scientific	H117EIL5	Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets	Supermagnete	S-05-08-N	Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet	Schramme	EG1025A02/110	Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Electromagnet control PCB board
Solenoid hub	Distrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers	Electron Microscopy Sciences	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts	Thorlabs	-	-
Various mechanical parts	Workshop Biozentrum, University Basel	-	Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode	Thorlabs	CPS780S	780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM	emsdiasum.com	DTF-03523	30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537 SIGMA	Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Negative stain vanadium based
NanoW 2%	nanoprobes.com		Negative stain tungsten based
Software
openBEB			The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin)			Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.