Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

É apresentado um instrumento e métodos para a preparação dos volumes de nanolitros de tamanho de amostra para microscopia eletrônica de transmissão. Sem papel-mancha passos são necessários, evitando assim as consequências prejudiciais que isso pode ter para proteínas, reduzindo a perda de amostra significativamente e permitindo a análise do lisado para proteômica visual única célula.

Resumo

Devido a recentes progressos tecnológicos, microscopia cryo-elétron (cryo-EM) está rapidamente se tornando um método padrão para a análise estrutural dos complexos de proteína para resolução atômica. No entanto, técnicas de isolamento de proteínas e métodos de preparação de amostra para EM permanecem um gargalo. Um número relativamente pequeno (100.000 para alguns milhões) de partículas de proteínas individuais precisa ser fotografada para a análise de alta resolução de proteínas pela partícula única abordagem EM, fazer a amostra miniaturizada manipulação microfluidic princípios e técnicas viável.

Um miniaturizados, papel-mancha-livre EM grade método de preparação para pré-condicionamento de amostra, escorva de grade EM e pós-processamento que consome apenas nanolitros-volumes da amostra é apresentado. O método usa um sistema de distribuição com precisão subnanolitros a absorção líquida de controle e preparação de grade EM, uma plataforma para controlar a temperatura de grade, determinando, assim, a umidade relativa do ar acima da grade EM e um escolha-e-mergulho-mecanismo para amostra vitrificação. Para cryo-EM, uma grade EM é colocado no palco temperatura controlada e a amostra é aspirada em um capilar. A ponta capilar é posicionada em proximidade com a superfície da grade, a grade é carregado com a amostra e excesso é re-aspirado para a conta. Posteriormente, o filme de amostra é estabilizado e ligeiramente diluído por evaporação de água controlada, regulada pelo deslocamento da temperatura da plataforma em relação ao ponto de orvalho. Em um determinado ponto é acionado o mecanismo de escolha-e-mergulho, rapidamente, transferindo a grade EM aprontada em etano líquido para vitrificação de amostra. Alternativamente, métodos de condicionamento de amostra estão disponíveis para preparar mancha negativa (NS) EM volumes de amostra tamanho de nanolitros.

As metodologias extremamente reduzem o consumo de amostra e evitar abordagens potencialmente prejudiciais às proteínas, tais como a mancha de papel de filtro utilizado em métodos convencionais. Além disso, a minúscula quantidade de amostra necessária permite romance estratégias experimentais, tais como rápida amostra condicionado, combinação com lise de célula única para "proteomics visual", ou "sem perdas" preparação da amostra total de análise quantitativa de amostras complexas.

Introdução

Hardware e software de análise estrutural de complexos de proteínas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) maciçamente tem avançado nos últimos anos. As melhorias feitas pavimentaram o caminho para uma "revolução de resolução"^1,2 e mudaram fundamentalmente pesquisa estrutural. A revolução começou com o advento do cryo-elétron microscopia (cryo-EM)^3,4, que permite a preparação de amostras biológicas sob perto condições fisiológicas enquanto diminuindo a sensibilidade de radiação e prevenção evaporação da amostra no alto vácuo do microscópio eletrônico de transmissão⁵. Nos anos seguintes, o progresso tecnológico incremental aumentou gradualmente realizáveis a resolução. Entre estas inovações foram a aplicação de armas de emissão de campo^6,7e, mais recentemente, melhorou a algoritmos de análise de dados, tais como métodos de máxima verossimilhança^8,9. Elétron direto detector câmeras^10,11,12,13, imagens do filme-mode e o acompanhamento software desenvolvimentos^{14,15, 16 , 17}, desde que o avanço final necessário para atingir resolução atômica para amostras biológicas por análise de partícula única (para uma revisão, ver Cheng, Grigorieff, et al ¹⁸). a importância da cryo-EM foi recentemente reconhecida pela atribuição do prémio Nobel da química para três dos pioneiros.

Para uma amostra biológica pela TEM de imagem, o método usado para carregar a grade EM com amostra (posteriormente referida como "preparação de grade") deve garantir que a camada resultante de amostra (i) é fina o suficiente (< 100 nm) evitar ruído extensivo por inelástica ou multiplicar espalhados elétrons, (ii) suporta o alto vácuo do microscópio de elétron, e (iii) protege as biomoléculas de danos de radiação. Dois métodos principais são usados para cumprir estes pré-requisitos: mancha negativa(NS)^19,20 procedimentos (Figura 1A) fixar a amostra a uma película fina de carbono, incorporar as biomoléculas em amorfo de heavy metal e então permitir que o assembly secar no ar. Isto é simples e rápido, e as grades de EM carregado (posteriormente referidas como "grades de amostra") são fáceis de armazenar e podem ser mantidos por longos períodos de tempo (geralmente anos). Na temperatura, as preparações apresentam alto contraste devido a NS e toleram doses maiores de elétron de cryo-preparações, mas a resolução é limitada a cerca de 20 procedimentos Å. Cryo-EM (Figura 1B) empregam holey carbono suporta. Uma película fina de solução da amostra é atravessada através dos furos e a grade EM é mergulhada em um cryogen, etano geralmente liquefeito, para resfriá-lo rapidamente abaixo-150 º C. O resultado é um amorfo, vitrificados, 50 a 100 nm de espessura filme da solução nos furos do suporte. Esta película fina, amorfa resiste o alto vácuo no microscópio eletrônico e, no caso ideal, preserva estruturas biológicas em seu estado nativo. O procedimento permite que amostras biológicas para criação da imagem em alta resolução. No entanto, a grade de amostra deve ser mantida em temperaturas abaixo-150 º C em todos os momentos para evitar desvitrificação. Isso pode ser fotografado usando doses de elétrons relativamente elevado devido a baixa temperatura, mas o contraste e a relação sinal-ruído, no entanto, é baixa. Portanto, técnicas de amostragem são empregadas para aumentar o contraste e, desde que a amostra é fotografada de ângulos diferentes, mapa de alta resolução tridimensional (3D) pode ser reconstruído. O mais comumente usado e altamente bem sucedido método de reconstrução 3D a partir de agora é a abordagem única partícula. Para uma recente revisão, consulte Cheng em Al.¹⁸.

Mancha negativa TEM (NS-EM) é importante para o rastreio e controle de qualidade, quando o alto contraste é necessário ou quando apenas uma quantidade limitada de amostra está disponível (adsorção para o filme de carbono geralmente concentra-se a amostra). Única partícula cryo-EM é o método padrão-ouro se destinam-se para reconstruções 3D de alta resolução da estrutura da proteína.

Figura 1: princípios de TEM grade preparação e comparação entre o clássico (painel A, B) e uma abordagem microfluidic (painel C, D). A) preparação de grade NS-EM clássico: sobre 3 µ l de amostra são pipetado à mão para um grid EM coberto com uma película de carbono contínuo (posteriormente referida como um 'grade EM NS-') (i). Após incubação por aproximadamente 10 s, papel de filtro é utilizado para borre fora o excesso de líquido do lado, (ii), deixando as biomoléculas adsorvidas em uma película fina de água. Posteriormente, a proteína é incubada em uma solução de sal de metal pesado, por exemplo, 2% de acetato de uranilo, para 20 s (iii) e novamente o líquido é removido pela mancha do lado usando papel de filtro (iv). Finalmente, a EM-grade é deixada para secar ao ar. B) preparação de grade cryo-EM clássico: sobre 3 µ l de amostra são pipetado por uma mão em um filme de carbono holey. Para formar uma película fina de amostra, o líquido excedente é removido pelo papel-mancha rosto-de um ou de ambos os lados (ii). Finalmente, a grade é rapidamente mergulhou etano líquido para vitrificação (iii). C) preparação de NS-EM grade usando a configuração de cryoWriter: volume A 5 nL é aspirado do estoque de amostra usando uma conta de (i). Para amostra de condicionamento, a ponta de conta é imerso na solução de condicionamento, por exemplo, 2% de acetato de amónio. Íons e pequenas moléculas são trocadas por difusão (ii). Observe que as dimensões da conta assegurar que todo o processo é conduzido de difusão. As proteínas têm muito baixa constantes de difusão do que íons de sal e não são significativamente perdeu²⁴. Finalmente, a amostra é dispensada na grade e deixa-se secar (iii). D) princípios de preparação de cryo-EM grade usando o método baseado em cryoWriter: EM um grid coberto com uma película de carbono holey é colocado na superfície de uma plataforma de controlo de temperatura e mantido por uma pinça. A temperatura da plataforma é controlada em um deslocamento da temperatura de ponto de orvalho do ambiente grade. A grade é movido em relação a conta que contém a amostra e a conta é abaixada até é alguns micrômetros acima da grade. Posteriormente, alguns nanoliters da amostra são dispensados a partir dele enquanto o palco é movido em um padrão espiral; excesso de líquido é re-aspirado (i). Depois da grade de EM aprontar, a conta é retirada e grade permanece na temperatura controlada plataforma (posteriormente denominada ponto de orvalho (DP) palco) por um tempo curto permitir que uma quantidade controlada de amostra para evaporar. Para mergulho a congelar, a grade é rapidamente retirado do palco usando uma pinça (ii), capotou por 90° para a posição vertical e mergulhado em um banho de cryogen (iii) (posteriormente referido como mecanismo de 'escolher-e-mergulhar'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Infelizmente, os métodos de preparação de grade usados para NS e cryo-EM não melhoraram significativamente desde que foram inventados. Atuais inconvenientes são o consumo elevado de amostra (aprox. 3 µ l de proteína 1 mg/mL) e a grande quantidade (> 99%) da amostra perdeu (Figura 1A, B). Além disso, o método clássico utilizado para preparar grades para cryo-EM é um procedimento duro para proteínas: primeiro, que envolve um extensivo rosto-no papel-mancha passo (Figura 1B, ii), e, em segundo lugar, a proteína é exposta para o interface ar-água para uma quantidade significativa de tempo²¹. Aqui, um método alternativo para amostra pré-condicionamento, preparação da amostra grade e pós-processamento (grade de secagem ou vitrificação) para NS-EM (Figura 1C) ou cryo-EM (Figura 1D) é apresentado. A configuração construída in-house, chamada "cryoWriter", usa amostra miniaturizada manipulação tecnologia e microfluidic princípios para aspirar, condição e dispensar a amostra, evitando papel mancha completamente e fornecer métodos alternativos para amostras finas para Cryo-EM. Significativamente reduz o consumo de amostra e melhora o controle de usuário sobre a preparação da amostra como um todo. Além disso, o método permite que novos aplicativos experimentais; tais como a preparação dos componentes biológicos isolados de células individuais em uma abordagem denominada "única célula visual proteomics"^22,23,24,25.

Protocolo

Um "cryoWriter" (Figura 2; para obter detalhes consulte anterior trabalho^24,26,27) ou equivalente instrumentação é necessária para os seguintes protocolos. Uma lista de fornecedores para as principais peças e consumíveis é dado na Tabela de materiais.

1. preparação de grade negativo mancha (NS)

1. Ligue o instrumento e start-up do software. Inicialize todos os módulos necessários (controlador de bomba de seringa, estágios motorizados, câmeras de vigilância e palco de ponto de orvalho).
2. Fixe o suporte de amostra e a fase de ponto de orvalho. Se necessário, certifique-se que a temperatura de palco de ponto de orvalho é regulada 1-2 ° C acima do ponto de orvalho.
   Nota: O estágio é resfriado por um dispositivo Peltier comercial com um controlador PID.
3. Prepare-se NS preenchendo um 100 ou 200 µ l do PCR tubo com 100-150 µ l de NS (por exemplo, tungstato de 2% metilamina comercialmente disponível). Coloca o tubo com o apoio de refrigeração de amostra do instrumento.
4. Posição da amostra.
   1. Colocar a amostra (0,5 - 1 µM) em um tubo PCR 100 ou 200 µ l. Se menos de 50 µ l de amostra está disponível, cortar a parte inferior de um tubo PCR com uma lâmina de barbear e usá-lo como uma amostra bem. Isto irá garantir que a conta pode chegar facilmente a amostra.
      Nota: É mais fácil aspirar amostras de 100 ou 200 µ l da polimerase, porque a conta usada mais tarde para aspirar a amostra é ligeiramente inclinada e a direção do eixo z-altura do curso é limitada.
   2. Coloque o tubo PCR/recipiente com o apoio de refrigeração de amostra no instrumento para evitar a evaporação. Alternativamente, as amostras podem ser aspiradas do bem placas na incubadora top microscópio estágio à temperatura ambiente; resfriamento não é implementada para placas bem.
5. Defina posições. Use o joystick de cryoWriter que controla a xy-palco motorizado e botões de controle de software para o linear x, y e fases do eixo z para posicionar a conta. Use a câmera para verificar a posição do capilar.
   1. Mova a conta para o reservatório de amostra. Mergulhe a ponta ao líquido de amostra e salve esta posição como "amostra".
   2. Mover a conta para o tubo de NS do PCR, mergulhe a ponta na solução de NS e salvar esta posição como "mancha".
   3. Coloque a conta de aproximadamente 100 µm acima do centro do slot onde a grade EM será posicionado e salvar esta posição como "grid_save".
6. Aspirar a amostra e condicioná-lo para NS-i.
   1. Se já não estiver instalado, instale uma seringa de 10 µ l (0,46 mm de diâmetro interno) em uma bomba de seringa de precisão.
   2. Cola uma extremidade de uma conta longa de sílica fundida 30 cm (diâmetro exterior 360 µm, diâmetro interno 150 µm) à saída da seringa.
   3. Conecte a outra fim da conta de um curto-circuito (5 cm) longo cônico conta através do conector de imprensa caber. A ponta cónica de conta a curta forma a ponta aplicadora.
   4. Encha a seringa com água bidestilada libertos (ddH₂O; líquido do sistema) e evitar a formação de bolhas de ar.
   5. Dispensa de algumas dezenas de nanoliters de líquido do sistema e remover quaisquer gotas da conta com um pano livre de fiapos.
   6. Clique duas vezes sobre a posição da amostra guardada. Bem, isto posiciona a conta na amostra. Enquanto o capilar está se movendo, dispensar 3 x 0,5 nL de líquido do sistema antes de ponta conta é imerso na amostra para impedir que a bolha de ar sendo preso por lá (ver nota 2 abaixo).
   7. Aspirado 5 nL da amostra.
   8. Clique duas vezes em posição de NS guardada. A conta é retirada do recipiente da amostra e mudou-se para o reservatório de NS automaticamente. Enquanto o capilar está se movendo, manualmente dispensar 3 x 0,5 nL de líquido de amostra antes da ponta está imerso no reservatório para certificar-se de que não há nenhum ar bolhas (ver nota 2 abaixo).
      Nota: importante: (1) quando se muda de aspiração para o modo de distribuição, ou vice-versa, há uma pequena perda no curso do pistão devido a folga nas engrenagens da bomba de seringa. De acordo com o fabricante, a reação de uma nova unidade situa-se entre 7 e 12 µm. Para a nossa seringa com um barril de 0,46 mm de diâmetro, isso se traduz em nL 1-2. Portanto, 1-2 nL pode ser "dispensado", antes de amostra na verdade é dispensada. Geralmente, uma pequena gota começa a sair a ponta da conta após o terceiro 0,5 nL dispensar o passo. (2) uma bolha de ar presa acima/abaixo a amostra faria dispensar menos precisos e evitar condicionamento de amostra por difusão.
   9. Deixe a conta imergida para 3-12 min, dependendo da geometria do bocal e do amortecedor da amostra.
      Nota: Quanto maior o sal e/ou fosfato concentração no buffer, quanto mais o tempo de imersão necessário. NS (relativamente rápido) difunde-se para a tomada de amostra enquanto reserva de sais (relativamente rápida) e proteína (muito mais lento) difusa fora. Isso diminui a concentração de sais do tampão na amostra impedindo-os de cristalizar quando carregado grade seca. Além disso, fosfato tende a formar um precipitado em combinação com NS.
7. Prepare uma grade e depositar um ponto da amostra condicionado.
   1. Enquanto a amostra está sendo condicionada, pegue um pedaço de fita adesiva e um bloco PDMS e limpe o lado superior do PDMS, aplicando e removendo a fita adesiva para garantir que não há nenhuma poeira. Coloque o bloco PDMS em uma placa de Petri.
      Nota: Novos blocos PDMS são tomados a partir da sala limpa.
   2. Escolher cuidadosamente uma grade (por exemplo, Cu, 200 ou 400 malha revestida com filme de Parlodion/C). Certifique-se de tocar somente a borda da grade com a pinça. Coloque-o no bloco de PDMS limpo com o filme de carbono voltado para cima.
   3. Lugar do bloco PDMS com a grade em uma unidade de brilho-da descarga de ar e o brilho descarregá-la por 20 s, com potência de 100 W a 0,4 mbar. Armazene a grade num recipiente fechado. Tempos de descarga do fulgor mais geralmente levam a uma propagação maior volume da amostra depositada na grelha. Como resultado, a camada da mancha se torna mais fina (mancha mais fraca).
   4. 1 min antes do tempo de imersão, agarrar a grade de brilho-alta com a pinça de cryoWriter. Certifique-se de que o eletroímã é ativado; caso contrário ligá-lo no software. Montar a pinça no eletroímã e usar o parafuso manual micromanipulador para alinhar a grade plana na fase de ponto de orvalho, carbono filme para cima. Certifique-se que a temperatura de palco de ponto de orvalho é regulada 1-2 ° C acima do ponto de orvalho para reduzir a taxa de evaporação após amostra é carregada.
   5. Quando o tempo de imersão, clique duas vezes em "grid_save". A ponta de conta será colocada com segurança acima da superfície da grelha. Manualmente, ponha a ponta em conta em contacto com a grade. Levante o bocal por 10 µm e posicione-o acima do centro.
      Atenção: Algumas amostras contendo detergentes tendem a subir ao longo da superfície exterior da conta quando o líquido é dispensado devido a baixa tensão superficial. É importante estar muito perto da superfície da grade para evitar tais perdas.
   6. Dispensar 5 nL da amostra para o grid. Em um dia seco, quando a evaporação rápida tem lugar na ponta de conta, pode dispensar também lentamente até que a amostra é na ponta e então rapidamente dispensar 5 nL.
   7. Retirar a conta e deixar a amostra condicionada secar lentamente sobre o estágio de ponto de orvalho (DP-estágio).
   8. Uma vez que o ponto de amostra seca, retire a grelha e armazená-lo em temperatura ambiente em uma caixa de grade ou placa de Petri.
   9. Dispense a 500 nL de líquido do sistema da conta e removê-lo com um pano livre de fiapos. Irrigue o capilar 5 vezes com etanol, detergente ou 1 M de NaOH. Isto limpa a conta que lhe permite ser usado com uma amostra diferente.

2. crio grade preparação

1. Para preparar o instrumento e a amostra, siga os passos de 1.1 a 1.5 descritos acima. Se NS não é necessária, omita etapas 1.3 e 1.5.2. Para trocar o amortecedor da amostra ou condicionar a amostra para cryo-EM pela diálise, por exemplo, para reduzir a concentração do buffer de sais, ou para introduzir aditivos (por exemplo, trealose, detergentes) usam o buffer desejado em vez de NS etapas 1.3 e 1.5.2.
2. Prepare o etano líquido em um recipiente padrão cryo.
   1. Montar o copo de etano, crio caixa titular e aranha e encha o recipiente cryogen até a borda com nitrogênio líquido; geralmente requer cerca de 200 mL. Aguarde alguns minutos até a Copa de etano arrefeceu e é livre de nitrogênio líquido.
   2. Abra a garrafa de gás etano e lentamente deixe o fluxo de gás para o copo de etano. Deixá-lo encher com etano líquido até o nível é de 2-3 mm abaixo do topo; Isto leva alguns minutos e requer cerca de 5 mL de etano líquido.
   3. Pegue uma caixa de cryo e colocá-lo em um slot livre no recipiente cryogen.
   4. Remover a aranha, coloque a tampa polistirol por cima e coloque o recipiente cryogen na montagem no cryoWriter.
3. Brilho da descarga uma grade EM.
   1. Pegue um pedaço de fita adesiva e um bloco de polidimetilsiloxano (PDMS) e limpe o lado superior PDMS, aplicando e removendo a fita adesiva (remove toda a poeira). Coloque o bloco PDMS em uma placa de Petri.
   2. Escolha cuidadosamente uma grade da caixa de grade. Certifique-se de tocar somente a borda da grade com a pinça. Coloque-o num bloco de PDMS limpo com o filme de carbono holey virada para cima.
   3. Lugar do PDMS bloquear com a grade em um plasma cleaner e plasma-limpar a superfície da grade (por exemplo, uso 75% Ar/25% H_2, potência 50 W, pressão 25 mTorr). Coloque o bloco PDMS com grade de brilho-alta em uma placa de Petri.
4. Posicione a grade no instrumento
   1. Agarre a grade de brilho-alta com a pinça de cryoWriter. Certifique-se de que o eletroímã é ativado; caso contrário ligá-lo no software. Montar a pinça no eletroímã e use o parafuso manual micromanipulador para alinhar a grade plana no palco, lado de filme de carbono acima.
   2. Clique duas vezes em "grid_save". Ajuste a posição da conta para que a ponta é de aproximadamente 10 µm acima da superfície da grelha. Certifique-se de que a conta pode mover-se livremente em toda a rede sem tocá-lo em qualquer lugar, se necessário retirar a conta alguns micrômetros.
   3. Vou voltar para o centro da grade e salvar a nova posição como "rede".
      Atenção: Correta nomenclatura é obrigatório para o script de macro trabalhar.
5. Escreva a grade de amostra e mergulho-freeze.
   1. Liberar a conta com algumas dezenas de nanoliters de líquido do sistema e remover quaisquer gotas da conta com um pano livre de fiapos.
   2. Inicie o script de macro. A macro executará as seguintes etapas:
      1. Dispensar 5 nL (para remover quaisquer bolhas de ar na ponta) e a posição da amostra.
      2. Aspirado de 65 nL da amostra. Infundir 5 nL volta no tubo de amostra. Esta contas para o sistema de reação e permitir escrita sincronizada, ou seja., para garantir o fornecimento e início de movimento de palco ao mesmo tempo.
      3. Mover para a posição de "grade".
      4. Iniciar a 'escrita padrão', que fará com que a conta mover-se em toda a rede, simultaneamente, dispensando 45 nL da amostra.
      5. Depois, voltar a conta para o centro da grade, abaixá-lo outro 10 µm e retirar o líquido em excesso de amostra.
      6. Retirar a conta e desligar o eletroímã. Isso libera o mergulho de pinças e inicia a congelar.
6. Segure a pinça e solte cuidadosamente o adaptador magnético de êmbolo. Rapidamente transfira a grade da Copa do etano no recipiente que contém a caixa de cryo cryogen e a grade em um slot livre.

3. célula única preparação lisada

1. Prepare o microcapilares para eletroporação.
   Nota: Os microcapilares de sílica fundida cônico de (laser-puxado e inspecionado) têm um revestimento protetor de poliimida do lado de fora, exceto para a ponta, onde o revestimento é queimado durante o processo de afilamento.
   1. Para revestir o microcapilares com uma camada condutora, montá-los em um ângulo de 45° em um trilho de metal, com as pontas voltadas para cima. Use uma folha de alumínio para proteger a extremidade inferior (2cm) de dicas, como não revestidos de poliimida forma o selo melhor com os conectores de pressão empregados mais tarde.
   2. Por pulverização catódica depositar uma camada pegajosa de 20 nm Ti/W e em seguida uma 200 nm de espessura camada do Pt.
2. Fazer a ponta do conta hidrofóbicas.
   1. Prepare uma solução 1m de 1-dodecanethiol em EtOH.
   2. Brilho-a conta no ar por 1 min com potência de 100 W a 0,4 mbar da descarga.
   3. Mergulhe a ponta da conta na solução 1 M de 1-dodecanethiol por algumas horas (idealmente durante a noite).
      Nota: É melhor preparar dicas recentemente um dia antes do uso.
3. Instale uma nova conta.
   1. Remover a conta a partir da solução de 1-dodecanethiol, enxaguar fora com etanol e lave o interior com etanol utilizando uma seringa.
      Nota: Se não microcapilares funcionalizados estão disponíveis, rapidamente brilho a ponta de uma conta de descarga e mergulhá-lo em uma gota de tratamento de janela de carro comercial, que é uma mistura de ácido sulfúrico e PDMS. O functionalization hidrofóbico resultante não é tão bom quanto com 1-dodecanethiol, mas geralmente é suficiente.
   2. Cleave o seu fim não revestido com um cortador de capilar.
      Nota: Um corte limpo é importante para uma boa vedação com o conector de pressão.
   3. Use um palito para aplicar pasta de prata para a pensionista afiada formada entre o vidro e o revestimento de poliimida quando o revestimento de poliimida foi queimado pelo laser durante puxando capilar.
      Nota: Este reforço é necessário como o revestimento do Pt é muito fraco nesta região, e condução elétrica pode quebrar facilmente.
   4. Lave o fim de poliimida da conta com acetona. Deixar uma pequena gota de acetona no final e inseri-lo no orifício do conector press-fit. Aplique uma leve pressão para formar uma boa vedação.
4. Calibre a posição da conta.
   1. Ligue o instrumento e iniciar o software, conforme descrito no passo 1.1. Além disso, inicialize a câmera do microscópio e o gerador de função.
   2. Coloque um vidro de microscópio no suporte da lâmina no microscópio.
   3. Reduzir a conta perto da lâmina de vidro e centralizá-lo sobre o objetivo do microscópio, até parece que a visão da câmera de microscópio. Use os estágios lineares de x - e y-eixo para posicionar a ponta da conta no centro da imagem. Então abaixe lentamente a ponta até que toca ligeiramente a lâmina de vidro.
      Atenção: Escolha muito pequenos passos (5 µm) para a aproximação final. Caso contrário, a ponta pode ser danificada.
   4. Pressione o botão "Calibrar o bico". Isto cancela a conta 40 milímetros e moda esse cargo como em casa posição.
5. Preparação de estampadas peças PDMS e ITO desliza
   1. Mix de PDMS e crosslinker na proporção de 10:1, despeje em um grande prato de Petri a uma profundidade de aproximadamente 2-3 mm. Asse a 60° C por algumas horas em uma incubadora de hibridização ou dispositivo similar.
   2. Com um martelo e um carimbo (12 mm de diâmetro), corte buracos na camada de PDMS. Depois, use um bisturi para cortar 2 cm longo quadrada ou rectangular incluindo os buracos para obter peças estampadas que cabem em uma corrediça do microscópio. Normalmente, duas peças estampadas são montadas em um microscópio.
   3. Lave as peças PDMS e os slides de ITO, primeiro com detergente e, em seguida, com 70% de etanol. Coloque-os, molhado, em um prato de Petri e deixe o álcool evaporar totalmente em estufa a 60° C.
   4. Brilho da descarga-os slides ITO por 1 min com potência de 100 W a 0,4 mbar e aplique 1 mL da solução de revestimento (por exemplo, poli-L-lisina (PLL)). Incubar durante 5 min, retire a solução com uma pipeta e aplicar 1 mL de DDQ₂ligeiramente O. agitar por 1 min e em seguida, remover o ddH₂O usando uma pipeta. Seque os slides a 60° C.
6. Prepare a cultura de células. Siga o protocolo padrão de células aderentes cultivo (por exemplo, Arnold, et al ^{24 , 25}). células na ITO de sementes durante execuções de divisão/passagem normais.
   1. Pegue um slide ITO recém PLL-revestido e adicionar um pedaço PDMS. Aplique alguma pressão para formar um selo à prova d'água. Isto produz pequenos poços com o slide como sua base.
   2. Adicione cerca de 300 µ l de células suspensas em meio fresco para os poços PDMS. A densidade de semeadura deve ser de cerca de 75.000 células por poço.
   3. Incube a ITO por 1-2 dias sob condições normais.
7. Prepare-se para a experiência de lise celular:
   1. Pré-aquecer alguns mililitros do electroporation buffer (por exemplo, salina tamponada fosfato (PBS)).
   2. Preparar o set-up para a preparação de grade NS-EM
      Nota: Detalhes para preparar o set-up são mostrados em passos 1.1-1.5 (para NS) ou passo 2.1-2.4 (para criogenia). Aqui descrevemos os passos mais importantes para preparação de NS.
      1. Prepare-se NS preenchendo um 100 ou 200 µ l do PCR tubo com 100-150 µ l de NS (por exemplo, tungstato de 2% metilamina comercialmente disponível). Coloca o tubo com o apoio de refrigeração de amostra do instrumento.
      2. Mover a conta para o tubo de NS do PCR, mergulhe a ponta na solução de NS e salvar esta posição como "mancha".
   3. Carrega os parâmetros padrão do lysis, por exemplo, a tensão de Lise.
   4. Pegue o slide de ITO da incubadora e montá-lo em inserir o microscópio. Use dois parafusos para fixar o slide sobre a inserção de alumínio e para garantir o contato elétrico entre o ITO revestimento de slide e o frame de alumínio eletricamente aterrado.
   5. Remover o meio de cultura celular e lavar duas vezes com 300 µ l de tampão de eletroporação. Manter as células no buffer de eletroporação.
   6. Coloque a inserção de alumínio segurando o slide de ITO na fase de viver-pilha incubadora sobre a instalação.
   7. Localize a cultura de pilha na exibição de microscópio e escolher uma área com nenhuma célula. Aproximar a ponta à superfície ITO e suavemente tocá-lo, em seguida, retirar a ponta 100 µm e salvar a posição como "células".
   8. Rapidamente deixa a cultura de células e lave a ponta do conta com algumas dezenas de nanoliters de líquido do sistema em seguida, colocá-lo na cultura de pilha novamente. Dispense alguns nanoliters durante a imersão dentro do poço PDMS para não assegurar que nenhum ar bolhas estão presos na ponta.
   9. Aproximar-se suavemente a superfície de ITO (inicialmente, você deve estar na posição "células", i. e., 100 µm acima da superfície). Em caso de contacto, retrai dica 10 µm.
   10. Selecione uma célula vizinha para Lise. Coloque a ponta da conta acima da célula alvo.
8. Inicie o script de macro para lise de célula única.
   1. Nome a posição da conta deve ser movido para depois que uma célula tem sido lysed com êxito. Este será o reservatório de NS (NS-EM), um buffer do desalting (cryo-EM) ou a grade EM (cryo-EM). Evite erros de ortografia e pressione "okey".
   2. A macro prossegue sem intervenção do usuário:
      1. i) o microscópio estágio e célula cultura 100 µm são movidos para a esquerda, um instantâneo da célula alvo é tomado e 50 nL de DDQ₂O líquido de sistema são dispensados da conta. Isto desloca e dilui o buffer de sal elevado e se aplica a pressão osmótica da célula.
      2. II) a fase é movida de volta para posicionar a ponta acima a célula alvo novamente. O surto de tensão predefinida é aplicado, e após 500 ms, o sistema de bomba começa a aspirar 3 nL da amostra a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min.
      3. III) a fase é movida para a esquerda novamente, permitindo que a célula a ser inspecionado. Uma janela aparecerá, perguntando para entrada do usuário.
   3. Dizer se a etapa de Lise foi bem-sucedida ou não.
      1. Se a resposta é não, assumir, pode puxar a conta e uma nova célula-alvo.
      2. Se a resposta é sim, um instantâneo da célula (lisado) removido é tomado, e depois a conta é movida para o local especificado em 3.8.1. Se isto é NS ou um reservatório de buffer, use a interface de usuário padrão para dispensar 3 x 0,5 nL de líquido enquanto a conta está movendo-se para garantir que não há nenhuma bolha de ar. A ponta está imerso no líquido reservatório pela macro.
         Nota: Você pode continuar a condicionar a amostra e preparar grades conforme explicado nas seções 1.6.9 - 1.7.9 para NS-EM ou seção 2.2-2.6 para cryo-i. Abaixo, as medidas necessárias para a preparação de NS-grade são explicadas.
   4. Deixe a conta imergida por 8-12 min, dependendo da geometria do bocal
      Nota: A concentração de fosfato elevado no buffer requer um tempo de imersão para o condicionamento.
   5. Dispensar 5 nL da célula condicionada lisada na grade.
   6. Retirar a conta e deixar a amostra condicionada seca lentamente sobre o estágio de ponto de orvalho (DP-estágio) regulada de 1-2° C acima da temperatura de ponto de orvalho.
   7. Retire a grelha e armazená-lo em temperatura ambiente em uma caixa de grade ou placa de Petri.

Resultados

A configuração "cryoWriter" foi desenvolvida (representados na Figura 2) a fim de testar miniaturizados EM procedimentos de rede preparação propostos na Figura 1,C, D. Figura 2 A mostra uma visão geral dos diversos componentes montados a um microscópio de fluorescência inversa. Um módulo de célula-cultivo é instalado no lado esquerdo do microscópio; um módulo para a preparação de grade EM situa-se no lado direito. O módulo de cultivo de células (Figura 2B) permite o crescimento de células eucarióticas aderentes e imagem latente da viver-pilha da cultura de pilha pelo microscópio de luz. Células individuais lysed pela ação combinada de choque osmotic, eletroporação e aspiração do conteúdo da célula em uma conta (Figura 2B, Figura 6A)^24,25. A amostra de lisado aspirada então pode ser usada para preparar grades para NS ou cryo-EM. Como alternativa, uma solução de proteína de estoque em um tubo PCR pode ser a fonte da amostra. A conta (Figura 2B) empregada é conectada a um sistema de bomba de alta precisão, permitindo que os volumes de amostra a ser aspirado e dispensada com precisão sub-nL. Conforme detalhado nos protocolos, todo o processamento de amostra é executada dentro desta conta ou na grade EM si sem transporte de amostra significativa. Por exemplo, a mesma conta é usada para lisar células eucarióticas individuais, Aspire o lisado, condicioná-lo e finalmente distribuir alíquotas para grades EM. O módulo de preparação de grade consiste em um estágio-DP móvel que permite que a temperatura da grade EM colocados para ser precisamente controlada (Figura 2C). Para NS-TEM, a grade de amostra preparada pode simplesmente ser removida da fase fria e deixa-se secar ao ar à temperatura ambiente. No entanto, os chamados efeitos de café-anel que podem resultar em seguida devem ser evitadas para quantitativo TEM onde partículas de proteína' ' são contadas. Para fazer isso, grades são secados lentamente na etapa-DP usando um gradiente de temperatura gradualmente crescente para retardar a evaporação do líquido. Para cryo-EM, a temperatura da grade é mantida perto do ponto de orvalho; é escolhido um deslocamento positivo de cerca de 8 ° C, permitindo a evaporação controlada do líquido de amostra para estabilização de película fina e desbaste, que pode ser monitorizada por um sensor se necessário²⁶. Após o tempo de desbaste selecionado, um mecanismo de escolha-e-mergulhar é ativado e a amostra é vitrificada (Figura 2C). Observe que este mecanismo de mergulhar não é necessário para redes EM NS-, que são armazenadas à temperatura ambiente.

Figura 2: visão geral da instalação do cryoWriter. A) visão geral da instalação do cryoWriter montado em um microscópio de luz inverso (1). B) Inset da área indicada no lado esquerdo no painel compartimento de cultivo r. Cell (2), com uma conta (3) para lise de célula e manipulação de amostra posicionada acima de uma placa de cultura de células de PDMS-baseado miniaturizado (4). C) Inset da área indicada no lado direito no mecanismo de painel a. 'Pick-e-mergulho'. Uma grade de EM de filme de carbono holey (5) é montada entre as pontas da pinça (6) e posicionada horizontalmente em contacto directo com o estágio de temperatura controlada (7), conhecido como o estágio de ponto de orvalho (DP-estágio) no texto principal. A temperatura de palco é rigidamente controlada através de um controlador PID e um elemento Peltier Water-cooled, mantendo-o em ou perto da temperatura de ponto de orvalho, dependendo do ambiente. DP-fase (7) é montado sobre um eixo xy motorizado para mover a grade em relação a conta. A conta em si é montada em um z-palco e pode ser abaixada até é muito perto da superfície da grelha EM e usada para dispensar volumes nanolitros tamanho sobre o suporte de amostra, cobrindo-o (uma camada de carbono fino contínuo para NS-i ou uma película de carbono holey para cr Ei-EM). Note-se que a absorção de líquidos e dispensação é executada usando um sistema de bomba de alta precisão (8). O líquido dispensado pode ser distribuído, movendo a grade em relação a conta em um padrão espiral. Para a preparação de cryo-EM, o mecanismo de congelamento de escolher-e-mergulho (9) rapidamente transfere a grade de amostra-carregado em etano líquido (10) para refrigeração rápida e vitrificação de amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra resultados representativos obtidos para redes EM NS-preparados usando a configuração de cryoWriter. A ponta da conta estava carregada com 5 nL de amostra de uma solução stock e mergulhado em um reservatório de solução de NS (tungstato de 2% metilamina) por vários minutos para permitir a troca difusiva de NS e íons de sal (para uma discussão teórica ver Arnold, et Al. ²⁴). posteriormente, a amostra condicionada foi dispensada para o filme de carbono fino de uma grade de NS-EM e secas. Figura 3 A mostra o uso de uma grade de slot da mesma forma para visualizar o droplet completo, conforme necessário para quantitativo TEM. Para evitar o efeito do anel de café, grade de brilho-dispensado recentemente foi inicialmente realizada a temperatura de ponto de orvalho (nenhuma evaporação de água) e então lentamente aqueci no palco-DP. Note que a maioria dos aplicativos (por exemplo, controle de qualidade da amostra ou análise estrutural) este processo lento-secagem não é necessário. Alta qualidade NS-preparações são obtidas sem ele, como mostrado na Figura 3,B, C. Vezes de condicionamento para os buffers de sal baixos livre de fosfato são em torno de 3 min, por exemplo, com baixo teor de sal de tampão Tris (20 mM Tris-HCl pH 7,4 com 50 mM de NaCl), conforme mostrado na Figura 3B usando o vírus do mosaico do tabaco (TMV) como amostra. Figura 3 C apresenta um cenário de pior caso, como o TMV foi em tampão PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4). Íons fosfato formam cristais transitórias com os íons de metais pesados de NS (consulte a Figura 5C), alongando o tempo de condicionamento necessário (7 min). Outros sais de metais pesados também podem ser usados com o módulo de preparação de grade, por exemplo, 2% metilamina vanadato ou amônio molibdato (Veja também Arnold, et al ²⁴). no entanto, o acetato de uranilo não é adequado; o efeito de reticulação desta mancha leva a agregados se a amostra de proteína é acondicionada em solução, antes de adsorção ao carbono filme (veja a Figura 5E)²³.

Figura 3: resultados típicos para grades de NS preparados usando o cryoWriter de configuração, conforme indicado na Figura 1C. A) imagem panorâmica de uma gotícula de nL 3 dispensadas em uma grade de slot após condicionamento com tungstato de metilamina de 2%. B) TMV em tampão TRIS de 20 mM. A inserção mostra um alargamento de 3x da região indicada. Adaptado de Arnold, et al.²⁴ (mais permissões relacionadas ao material extraído devem ser direcionadas para o ACS). C) vírus do mosaico do tabaco (TMV) em tampão PBS. A inserção mostra um alargamento de 3x da região indicada. Adaptado de Arnold, et al.²⁴ (mais permissões relacionadas ao material extraído devem ser direcionadas para o ACS). Barras de escala: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados típicos obtidos para grades de cryo-EM preparado usando a configuração de cryoWriter são representados na Figura 4. Painel 4A mostra um atlas de grade da área coberta pela amostra vitrificada. Painel 4B mostra a homogeneidade do gelo vítreo em um slot de grade selecionada. Em ambos os casos, a amostra era em pH de HEPES-KOH 25mm 7.5, 50 mM de tampão de NaCl contendo 0.05% Fos 14 detergente. Testaram-se muitas amostras e buffers e obteve-se um gelo vítreo de qualidade comparável, mas as condições exigidas são dependentes do tampão (Veja também a discussão da Figura 5). Painel 4C mostra partículas de apoferritina e um bacteriófago em tampão Tris-HCl (20 mM Tris-HCl, 50mm NaCl; pH 7,4) fotografada em alta desfocagem para aumentar o contraste. Painel 4D mostra uma proteína de membrana de 200 kDa estabilizada por amphipoles.

Figura 4: resultados típicos para grades de cryo-EM preparado usando o cryoWriter de configuração, conforme indicado na Figura 1D. As amostras e os buffers de variam nos exemplos mostrados. Todas as amostras foram carregadas em filmes de carbono holey. A) colagem de imagens de visão geral ("atlas de grade") de uma amostra contendo uma proteína de membrana de 150 kDa, a periferia do gelo vítreo é indicada pelas setas brancas. B) slot de rede alargada de uma grade, preparada com a mesma reserva, mostrando o filme de carbono holey com gelo vítreo. Alguns buracos não são preenchidos com tampão de amostra, conforme indicado pelas setas brancas. C) buraco de carbono com vitrificados amostra contendo complexos de proteína apoferritina e bacteriófagos. Inserção: alargamento de dupla mostrando a cauda de um bacteriófago. O asterisco branco indica o filme de carbono. Observe que a imagem foi gravada com alta desfocagem para aumentar o contraste. D) A 200 kDa proteína de membrana reconstituída em amphipols. Baixo-relevo: um 2 x alargamento da região indicada mostrada com aumento do contraste. Barras de escala: A, 100 µm; B, 10 µm; C e D, 80 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A configuração cryoWriter permite sistemática de triagem para condições ideais de preparação EM-grade; um exemplo é mostrado na Figura 5A (apoferritina no pH 25mm HEPES-KOH 7.5, 50mm NaCl, 0.05% Fos-14). Neste experimento, o gelo vítreo "afinamento" temperatura era variado, mas o tempo de desbaste (ou seja, o intervalo de tempo entre o aplicativo de exemplo e congelamento de mergulho) permaneceu constante (1 s). Em baixas temperaturas de deslocamento (por exemplo, 8K), a camada da amostra era muito grossa. Em temperaturas mais altas de deslocamento, o gelo vítreo nos buracos era mais fino (10K, 12K), até que em algum momento (acima de 18 K), a grade se tornou completamente seco (não mostrado). Nos resultados apresentaram aqui, um deslocamento de 12 K levam a uma grande área homogênea de gelo vítreo conforme indicado pelas setas pretas. Tais experiências de otimização podem ser executadas com o tampão da amostra-alvo usando proteínas "teste" (como apoferritina). As melhores condições encontradas são então aplicadas a amostra-alvo. Além disso, grades com parâmetros longe de ser o ideal podem muitas vezes ser reconhecidos durante o procedimento de preparação e não precisa ser selecionado dentro do microscópio, economia de tempo significativo. A Figura 5 mostra também uma galeria de típico cryo-EM (painel B) e artefatos de NS-EM (painéis C a E) específicos para a instalação de cryoWriter. A grade de cryo-EM mostrada no painel 5B com TMV em PBS contendo 0,1% decílico-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4, 0.1%DM) foi excessivamente diluída. O fundo da imagem é granulado porque a concentração de sal tornou-se muito alta. Em geral, a aparência visual de uma amostra não parece ser uma função linear da concentração de sal; grãos de repente se tornar proeminentes quando uma concentração limiar é alcançada durante o processo de desbaste. Observe que substâncias indesejadas podem ser removidas por uma etapa de condicionamento antes da preparação da grade, como descrito por NS-EM protocolo seção 1.6. NS pode causar outros artefatos. No exemplo mostrado no painel 5C, tampão PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) sem amostra foi condicionado em tungstato de metilamina de 2% por 3 min. precipitados e cristais são evidente e exercer forças extensas na superfície de carbono, levando a fissuras. A única forma de precipitados em uma determinada concentração de PBS e NS variam e podem ser evitadas pelo condicionamento da amostra por mais tempo (ver Figura 3C). Painel 5D mostra a periferia de uma gota de amostra NS doseada exibindo um anel de"café". Isso iria perturbar a análise quantitativa, o total da amostra e pode ser evitado por abrandar o processo de secagem, ou seja, mantendo a grade na temperatura de ponto de orvalho durante a aplicação da amostra, e depois aumentando gradualmente a temperatura para secá-la ( Ver Figura 3). Painel 5E (apoferritina em 20 mM HEPES, pH 7.0, condicionado 3 min) mostra a atividade de reticulação de mancha de acetato de uranilo 2%, que não pode ser usada para amostras de proteína condição antes que eles são adsorvidos às sustentações de filme de carbono.

Figura 5: alterações sistemáticas e artefatos observaram quando a afinação de cryoWriter foi usada para preparar grades para NS e cryo-EM -. A) variação de espessura de gelo vítreo sistemática; otimização da preparação de grade para cryo-i. A temperatura de deslocamento de fase-DP foi variada (8 K para K-12) mantendo-a constante de tempo de desbaste (1 s). As setas indicam a periferia da camada da amostra. B) sal efeitos; também altamente concentrada, ou seja, o desbaste passo era longa demais. O baixo-relevo retrata um alargamento de 2x da região indicada. C) sal precipitados formados por tampão PBS na presença de sais de metais pesados. Amostras contendo tampão PBS devem ser condicionadas mais de amostras em outros buffers. Aqui, tampão PBS sem amostra foi condicionado em tungstato de metilamina 2% por 3 min, um tempo típico para outros buffers de amostra. Observe o crack no filme de carbono, muito provavelmente devido a grande força de precipitados agindo com o apoio de fino durante o processo de secagem. D) efeito 'Anel de café'. E) apoferritina condicionada em acetato de uranilo 2% por 3 min. íons de uranilo exibem atividade significativa de reticulação e a apoferritina clusters de grandes agregados de forma. Barras de escala: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A pequena quantidade e volume necessário para preparação de grade EM usando a configuração cryoWriter permite que novos tipos de experimentos. Por exemplo, o conteúdo total de uma única célula pode ser coletado e preparado para NS e cryo-EM. O procedimento é indicado na Figura 6A. Uma célula eucariótica, aderente (HEK 293) é lysed por eletroporação simultânea e amostra de aspiração (painel 6A)²⁵. Um volume total de 3 nL é aspirado, que contém o lisado celular e é mantido na conta para processamento adicional. Para o NS-i mostrado no painel 6B, o meio de cultivo de células foi trocado com o tampão PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 milímetros de NaCl, Na₂HPO₄·7H2O de 8,9 mM, pH 7,4) antes da lise celular. O conteúdo da célula foram aspirado em 3 nL do buffer e acondicionado em um reservatório de NS, como indicado na Figura 1C por 10 min. depois, um volume de nL 5 foi dispensada para o filme de carbono contínuo de uma grade de NS-EM. As proteínas individuais, por exemplo, actina filamentosa e patches de membrana com proteínas anexadas podem ser reconhecidos na imagem. Para o cryo-EM, mostrado na Figura6 C, um volume de 3 nL foi dispensada em uma grade de carbono holey EM sem re-aspiração para remover o líquido. O filme relativamente espesso de amostra formada foi extensivamente diluído antes de vitrificação. Para fazer isso, a temperatura de DP-estágio foi aumentada gradualmente, começando com a temperatura de ponto de orvalho. O processo de desbaste foi monitorado por um sensor-sistema em tempo real, até um limite previamente especificado foi atingido provocando o mecanismo 'escolher-e-mergulhar' e vitrificação de amostra (para detalhes, ver Arnold, et al ²⁶). estruturas de membrana e proteínas podem ser reconhecidas na imagem.

Figura 6: única célula proteomics visual usando a instalação do cryoWriter. A) lise de uma única célula eucariótica aderente. A célula é cultivada (1, verde) em um funcionalizados, ITO revestido (vermelho)-lâmina de vidro (2) em um prato de petri miniaturizado (3)²⁵. A camada de ITO é eletricamente aterrada. A célula é abordada pela conta (4), que é revestida com platina. Um choque de osmótica inicial (não indicado) é dada para facilitar a Lise, que é realizada por uma série de impulsos elétricos e as forças de cisalhamento exercidas durante a aspiração do lisado celular. O processo pode ser monitorado pela microscopia de luz; a lente objetiva do microscópio é indicado (5). Para obter detalhes, consulte nosso anterior trabalho^24,25. B) imagem de NS-EM de lisado de uma célula individual de HEK 293. Patches de actina e membrana filamentosas com proteínas anexadas são visíveis. Painel adaptado de Arnold, et al.²⁴ (mais permissões relacionadas ao material extraído devem ser direcionadas para o ACS). C) imagem de Cryo-EM de lisado de uma célula individual de HEK 293. A inserção mostra um alargamento de 2x da região indicada, onde estruturas de membrana típico com proteínas associadas são visíveis. Painel C adaptado de Arnold, et al ²⁶ bares de escala: B, 50 nm; C, 80 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O instrumento de 'cryoWriter' e os protocolos necessários à elaboração de grades de amostra para NS - e cryo-EM volumes de nL tamanho total da amostra e evitar completamente a etapa clássica de papel-mancha são apresentados. Microfluidic princípios e um sistema Micromecânico são combinados na cryoWriter para tornar isto possível.

Nossa experiência mostra que, quando são usados os métodos miniaturizados apresentados neste manuscrito, o espaço de parâmetro para a preparação de EM-grade é maior do que para os métodos clássicos e sob o mais rigoroso controle de usuário. Importante, a maior reprodutibilidade alcançada torna possível pré-selecionar com sistema de tampão de amostra, complementado com uma proteína de teste prontamente disponível, para determinar os parâmetros ideais antes que a experiência é realizada. Isto mantém o consumo da amostra de interesse para o absoluto mínimo e é altamente recomendado. Passos críticos para a preparação de grade ambos EM NS - e cryo-são: (i) preparação do sistema de bomba; para subnanolitros dosear o volume, o líquido do sistema (água) deve ser desgaseificado e bubble livre. (ii) um controle preciso do brilho da descarga ou plasma limpeza passo; as características de superfície da grade EM são cruciais para obter resultados reprodutíveis. (iii) condicionamento de amostra; o tempo necessário para o condicionamento, por exemplo, com NS, depende o tipo de buffer, o teor de sal e a concentração (Figura 3), bem como sobre a geometria do bocal do conta²⁴. (iv) taxas de evaporação para preparações de NS-EM para EM quantitativos; o efeito do café-anel pode proibir a análise quantitativa das preparações de NS-EM e deve ser suprimido por taxas de evaporação lenta, controladas pela DP-fase.

Diferentes aspectos dos métodos de preparação de grade apresentados podem ser combinados livremente permitindo o desenvolvimento de protocolos versátil para amostras específicas. Exemplos típicos seria a remoção de uma substância que impede EM alta resolução, por exemplo, glicerol, por uma etapa de condicionamento antes da preparação de grade para cryo-i; a introdução de moléculas de mediador, tais como ligantes, por condicionamento antes que as grelhas estão preparadas; ou o exame de uma única célula lisado por NS ou cryo-EM - (Figura 6).

O uso de microfluídica e quantidades de amostra mínima nos métodos apresentados remove completamente a necessidade de etapas de papel-mancha. Isto é uma grande vantagem, porque a mancha de papel é um tratamento severo para proteínas, potencialmente contaminar a amostra com íons indesejáveis e inerentemente levando a perda de massa da amostra. Por outro lado, efeitos potencialmente provocados pela interface ar-água do filme fino amostra formado quando EM crio-as amostras são preparadas da maneira clássica não são evitados quando o cryoWriter é usado. Apropriado para cryo-EM grades podem ser preparados com um tempo de espera menos de 0.2 s entre o aplicativo de exemplo e vitrificação (dados não mostrados). No entanto, como proteínas viajam alguns décimos de um nanômetro em alguns nanossegundos por difusão, ainda há tempo suficiente para que eles colidem com a interface ar-água de uma película de espessura da amostra 100 nm várias vezes. No entanto, a quantidade de proteínas, aderindo a interface ar-água pode ser reduzida significativamente por estes intervalos de tempo curto e pode evitar a desnaturação de proteína ou restrito a orientação das partículas. Outra abordagem promissora que pode proteger as proteínas sensíveis através da interface ar-água é para cobrir o filme de amostra por substâncias activas de superfície de baixo peso molecular. Estes compostos poderiam ser introduzidos rapidamente por uma etapa de condicionamento no cryoWriter antes de preparação de grade. O elevado rácio de superfície e o volume dos sistemas microfluídicos é uma limitação adicional da cryoWriter, como amostra potencialmente podem ser perdidos por adsorção inespecíficas à superfície conta e perturbar a análise quantitativa pela contagem de partículas. O problema é abordado de duas maneiras: primeiro, a amostra não viajar longas distâncias dentro da conta. Com efeito, o volume de amostra de nanolitros permanece na ponta capilar em todo o processamento. Segundo, a superfície a relação entre o volume é reduzida ainda mais usando microcapilares com diâmetros internos relativamente grandes, por exemplo, 180 µm. em terceiro lugar, as superfícies da microcapilares podem ser facilmente passivadas, se necessário, por exemplo, tratando-os com glicóis de etanol polylysine comercialmente disponíveis (PLL-PEG).

A análise de alta resolução de proteínas pela abordagem única partícula usada EM requer apenas 100.000 para algumas imagens de milhões de partículas de proteínas individuais. Isto significa que técnicas microfluidic podem fornecer bastante complexos de proteínas para a investigação estrutural. Um método de imuno-precipitação miniaturizado para o isolamento rápido de complexos de proteínas (cerca de 1 hora) de quantidades mínimas de célula (cerca de 40.000 células) foi desenvolvido no início²⁸. Esse método será agora diretamente vinculado à fase de preparação de amostra miniaturizada do cryoWriter. O objetivo final é desenvolver um encanamento microfluidic integrado para proteína ultra rápido isolamento e cryo-EM grade preparação que requer menos de duas horas em todos. Além disso, conforme demonstrado pela Figura 6, a pequena quantidade e volume de material necessário para a preparação da amostra e o condicionado quase sem perdas e procedimento de preparação de grade alcançado usando o cryoWriter, que permitam estudar a proteína complexos de células individuais. Juntos, o método imuno-precipitação miniaturizados e a cryoWriter lançar as bases de um novo método de proteômica, chamado "única célula proteomics visual", como nós recentemente demonstrado por experimentos de calor-choque²⁴. Algoritmos de análise de dados voltados para a análise de imagens de "visual proteomics" estão sendo testados atualmente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liquid handling
Microcapillary tip	New Objective	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve	New Objective	CONGAS-1	Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector	BGB-Analytik	2525LD	Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25
Syringe 10 µl	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)
Syringe pump controller	Cetoni	A3921000093	neMESYS controller
Syringe pump dosing unit	Cetoni	A3921000095	neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor	Meltec	UFT75-AT	Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller	Cooltronic	TC2812	PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 mm
Water-cooling block	-	-	Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block	-	-	Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis	Dyneos AG	M-404.2PD	High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage	Prior Scientific	H117EIL5	Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets	Supermagnete	S-05-08-N	Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet	Schramme	EG1025A02/110	Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Electromagnet control PCB board
Solenoid hub	Distrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers	Electron Microscopy Sciences	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts	Thorlabs	-	-
Various mechanical parts	Workshop Biozentrum, University Basel	-	Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode	Thorlabs	CPS780S	780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM	emsdiasum.com	DTF-03523	30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537 SIGMA	Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Negative stain vanadium based
NanoW 2%	nanoprobes.com		Negative stain tungsten based
Software
openBEB			The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin)		Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.