JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحديد مستقبلات الدوبامين D1-ألفا في accumbens نواة أمر بالغ الأهمية لتوضيح خلل مستقبلات D1 خلال مرض الجهاز العصبي المركزي. أجرينا الحمض النووي الريبي رواية في الموقع تهجين مقايسة لتصور واحد من جزيئات الحمض النووي الريبي في منطقة محددة من الدماغ.

Abstract

في الجهاز العصبي المركزي، مستقبلات النوع الفرعي D1-ألفا (Drd1α) هي الأكثر وفرة من مستقبلات الدوبامين (DA)، الذي يلعب دوراً حيويا في تنظيم نمو الخلايا العصبية، والتنمية. ومع ذلك، الآليات الكامنة وراء شذوذ مستقبلات Drd1α وساطة الاستجابات السلوكية وتحوير وظيفة الذاكرة العاملة لا تزال غير واضحة. باستخدام الحمض النووي الريبي رواية في الموقع تهجين مقايسة، وحددت الدراسة الحالية التعبير الحمض النووي الريبي hydroxylase (TH) تيروزين ومستقبلات الدوبامين Drd1α من الدوائر ذات الصلة دا في منطقة accumbens (NAc) نواة والمنطقة الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية)، على التوالي. يظهر التعبير Drd1α في ائتلاف البرنامج الجديد "نقطة منفصلة" تلطيخ النمط. وقد لوحظت الاختلافات بين الجنسين واضحة في التعبير Drd1α. وفي المقابل، يظهر ال نمط المصبوغة "متفاوت المسافات". فيما يتعلق بالتعبير TH، عرض إناث الفئران تعبير إشارة أعلى كل خلية بالنسبة إلى الحيوانات الذكور. الأساليب المقدمة هنا توفر تقنية تهجين رواية في عين المكان للتحقيق في أحداث تغييرات في خلل نظام الدوبامين خلال تقدم أمراض الجهاز العصبي المركزي.

Introduction

الخلل في نظام striatal الدوبامين تشترك في تطور الأعراض السريرية التي لوحظت في العديد من الأمراض عصبي. مستقبلات الدوبامين D1 موجودة في قشرة prefrontal (PFC) ومناطق سترياتال في المخ، وتؤثر بشدة على العمليات الإدراكية1، بما في ذلك العمل في الذاكرة وتجهيز الزمانية والسلوك قاطرة2،3 , 4 , 5 , 6 , 7-أوضحت الدراسات السابقة أن التغييرات من مستقبلات الدوبامين D1 ارتبطت بتطور اهتمام العجز-فرط النشاط الفوضى (إعاقة)8، أعراض عصبي في الفصام9، 10 والإجهاد قابلية11. على وجه التحديد، في مرض الفصام، أشارت دراسات التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) إلى أن القدرة الملزمة من مستقبلات الدوبامين D1 في كورتيسيس prefrontal عالية تتصل بالعجز الإدراكي ووجود الأعراض السلبية11. النمو الجذعية ضادات الخلايا العصبية في قشرة prefrontal ينظم مستقبلات الدوبامين D1 يخفف قابلية الإجهاد. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تعزز ضربة قاضية مستقبلات D1 في الخلايا العصبية الآنسي prefrontal القشرية (mPFC) الأبطال الاجتماعية الناجمة عن الإجهاد الهزيمة الاجتماعية12.

هنا، نحن نقدم تقنية جديدة للجيش النيبالي الملكي في الموقع التهجين لتصور واحد من جزيئات الحمض النووي الريبي في زنزانة مع عينات الأنسجة المجمدة الطازجة. هذا الأسلوب مزايا متعددة أكثر من الأساليب التي توجد داخل الأدبيات الراهنة. أولاً، الإجراء الحالي يحافظ على السياق المكاني والخصائص المورفولوجية للأنسجة وأجرى على عينات الأنسجة المجمدة الطازجة حيث أن إجراءات أخرى تتطلب الطازجة، قد يتم دمج الأنسجة غير مضمن مع الأساليب الحالية. إجراءات مماثلة في الأنسجة الثابتة الفورمالين وجزءاً لا يتجزأ من البارافين قد بينت أنه يمكن التوصل إلى حل النسخ واحد استخدام الجيش الملكي النيبالي في الموقع تهجين تقنية13. الكشف عن الحمض النووي الريبي على مستوى النسخ واحد يوفر حساسية فائقة للتعبير رقم نسخة منخفضة، فضلا عن فرصة لمقارنة التعبير الجيني على مستوى الخلايا الفردية التي لا يمكن تحقيقها بطرق الكشف عن الأحماض النووية الأخرى، مثل تقنيات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ الطريقة الحالية للصور مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال تحقيقات الجيش الملكي النيبالي محددة للغاية تهجين لنسخ الحمض النووي الريبي هدف واحد، وملزمة بالتتابع بسلسلة من الإشارات التضخيم الجزيئات في الكشف عن النظام. وأخيراً، توفر التكنولوجيا الحالية الفرصة لتقييم النظم البيولوجية متعددة مع بالمسابير الملكية محددة الهدف، بدلاً من الحد من تحقيقاتنا إلى فئة واحدة فقط من علامات المتصلة بالنظام مثل الكشف عن البروتين أساليب إيمونوهيستوتشيميستري.

في دراستنا، استخدمنا هذا الجيش الملكي النيبالي الرواية في الموقع التهجين تقييم التعبير مستقبلات Drd1α في accumbens نواة (NAc) والتعبير تيروزين hydroxylase (ال) في المادة الرمادية (دائرة الاستخبارات الوطنية) لكل من الذكور والإناث من الفئران ن F344/. الجيش الملكي النيبالي مبتكرة في الموقع التهجين مكنتنا من التحقيق آليات التأثير على امتصاص دا والإصدار دا في وقت واحد، وتحسين فهمنا لتعقيدات النظام سترياتال دا. هنا، يمكننا وصف الإجراء للدماغ مجمدة طازجة شرائح وتوفير أساليب تحليل البيانات لمختلف أنماط المصبوغة: "نقطة منفصلة" أو "مجموعات".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأقر البروتوكول التجريبي "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة كارولينا الجنوبية (ضمان الاتحادي رقم: A3049-01).

1-إعداد أقسام الدماغ المجمدة الطازجة

  1. استخدام سلالة الجرذ ن F344/: الفئران الثلاثة من كل جنس، 13 شهرا عمر، وزن حوالي 320 ز جسم.
  2. ضبط تركيز سيفوفلوراني إلى 5% (جرعة زائدة سيفوفلوراني). مواصلة التعرض sevoflurane بعد التنفس توقف دقيقة إضافية.
  3. قطع رأس الفئران وإزالة الدماغ.
  4. تغرق في الدماغ الفئران في النتروجين السائل لمدة 15 s ضمن 5 دقائق من الحصاد الأنسجة.
  5. حجته في الدماغ إلى-20 درجة مئوية في كريوستات على ح 1.
  6. قص 30 ميكرومتر الأقسام ونقل إلى شرائح (انظر الجدول للمواد).
  7. اختيار المقاطع من منطقة accumbens النواة، حوالي 2.76 مم مم 2.28 عرفت بريجما14.
  8. شريحة الدماغ الفئران من لمبة شمي باستمرار عبر منطقة accumbens نواة وفقا لهيكل المخ ستيريوتاكسيك الفئران.
  9. تحميل عينات على الشرائح. إبقاء الأبواب في-20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة حتى تجف.
  10. فورا تزج الشرائح في بارافورمالدهيد 4% مبردة مسبقاً ح 1 في 4 درجات مئوية.
  11. وضع الشرائح في تدرج إيثانول متزايد في درجة حرارة الغرفة (RT): 50% EtOH لمدة 5 دقائق؛ 70% EtOH لمدة 5 دقائق؛ و 100% EtOH لمدة 5 دقائق.
  12. كرر مع طازجة 100% EtOH.
  13. ضع الشرائح على ورقة ماصة، والهواء الجاف.
  14. رسم حاجزاً حول كل قسم بقلم جدار (انظر الجدول للمواد). واسمحوا الجدار جاف تماما لمدة 1 دقيقة.

2-المعالجة المسبقة لأقسام الدماغ

  1. قم بتشغيل الفرن وتعيين درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية.
  2. إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لكاشف 4 المعالجة (انظر الجدول للمواد) في كل قسم الدماغ (مقطع واحد كل شريحة).
  3. احتضان الفروع لمدة 30 دقيقة في الرايت
  4. غمر الشرائح في برنامج تلفزيوني x 1 لمدة 1 دقيقة في تكرار الرايت مع برنامج تلفزيوني جديد x 1.
    ملاحظة: ينبغي أن لا تبقى الشرائح في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة أطول من 15 دقيقة.

3-الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين الفلورسنت متعدد الإنزيم

  1. الحارة المسبار المستهدفة لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية في حمام مائي، وبارد ثم إلى الرايت
  2. ضع الكاشف الحمض النووي الريبي (مثلاً، أمبير فلوريدا 1-4) في الرايت
  3. إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
  4. إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) المسبار Drd1α (C1) على شريحة العينة. احتضانها ح 2 عند 40 درجة مئوية.
  5. غمر الشرائح في 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة دقيقتين في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  6. إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
  7. إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 1-فلوريدا على شريحة العينة. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  8. غمر الشرائح الموجودة في المخزن المؤقت 1 يغسل لمدة 2 دقيقة في تكرار الرايت مع المخزن المؤقت 1wash الطازجة.
  9. إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
  10. إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 2-فلوريدا على شريحة العينة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  11. غمر الشرائح في 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة دقيقتين في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  12. إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
  13. إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 3-فلوريدا على شريحة العينة. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  14. غمر شرائح 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  15. إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
  16. إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 4-فلوريدا-البديل ألف على شريحة العينة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  17. غمر الشرائح في 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة دقيقتين في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  18. إزالة السائل الزائد من الشرائح وفورا بوضع 2 قطرات كاشف المتصاعدة (انظر الجدول للمواد) على كل قسم.
  19. ضع ساترة 22 ملم 22 ملم (انظر الجدول للمواد) على كل قسم الدماغ.
  20. تخزين الشرائح في الظلام في 2-8 درجة مئوية حتى الجاف.
  21. قم بتشغيل المجهر [كنفوكل] وقم بالتبديل إلى هدف X 60.
  22. الحصول على الصور Z-مكدس مع مجهر [كنفوكل]. مشاهدة الفيديو تكميلية على إجراء تفصيل لتصوير [كنفوكل].
  23. الحصول على صور Drd1α تسمية الخلايا في منطقة accumbens نواة (الإثارة: 488 نانومتر؛ الانبعاثات: 515/30 نانومتر).
    ملاحظة: لا تدع الدماغ المقاطع تجف بين الخطوات الحضانة.

4. تحليل البيانات

  1. شبه كمي تحليل نمط المصبوغة: "نقاط منفصلة".
    1. لتحديد الخلية الفردية من الصورة، نفذ DAPI تلطيخ كعلامة نووية. ومع ذلك، من الصعب لا يزال تحليل بعض أجزاء من أنسجة المخ نظراً لأنه يحتوي على أنواع متعددة من الخلايا بشكل منتظم من الأنوية و/أو خلايا. هنا، تعيين اثنين من الباحثين ذوي الخبرة بشكل منفصل كل خلية من الصور لتعريف المنطقة الخلية.
    2. نقاط بصريا كل خلية داخل الصور [كنفوكل] الممثل على أساس العدد النقاط لكل خلية باستخدام معايير محددة (الشكل 1B).
    3. تحديد عدد الخلايا الإجمالي في كل فئة والقسمة على عدد الخلايا الإجمالية x100 لإنشاء الرسومات التواتر النسبي لعرض نسبة تواتر الخلايا داخل كل فئة لجميع أقسام الأنسجة (الشكل 2A)، والذكور والإناث بشكل منفصل (الشكل 2E).
    4. تقسيم مجموع الخلايا داخل جميع التصنيفات السابقة حسب عدد الخلايا الإجمالية x100 لتحديد تواتر التراكمي للخلايا لجميع أقسام الأنسجة (الشكل 2) وللذكور والإناث على حدة (الشكل 2 واو).
  2. تحليل إحصائيا "النقاط المنفصلة" تلطيخ نمط (اختياري).
    1. فحص عدد النقاط لكل خلية لتقديم متغير قاطع ترتيبي في الطبيعة (أي عدد الخلايا التي تندرج في كل فئة من فئات التصنيف من أدنى خلية التعبير (1) إلى أعلى الخلية التعبير (9)) لمزيد من التحليلات الإحصائية.
    2. بعد دراسة لإحصاءات وصفية، استخدام الطرق الرئيسية الثلاث: إحصاء رف-هاينسزيل، واختبار مان-ويتني U، واختبار كروسكال-واليس. على الرغم من أن النهج الإحصائي الدقيق سيتوقف على مسألة الفائدة، شجرة قرار إحصائية (الشكل 4) التصميم والبحوث التجريبية قد تساعد في اتخاذ القرارات فيما يتعلق بالنهج التحليلي.
  3. قياس كثافة إشارة في المنطقة لمصلحة (ROI) لتلوين النقش: "مجموعات".
    1. حساب كثافة إشارة لكل صورة باستخدام المعادلة التالية:
      إشارة كثافة = مجموع كثافة الصورة عائد الاستثمار-(مساحة الصورة الإجمالية × كثافة الخلفية متوسط)
    2. حساب إجمالي عدد الخلايا داخل الصورة عائد الاستثمار لحساب التعبير إشارة تقريبية كل خلية. مجموعة الاختلافات في كثافة إشارة/الصورة، فضلا عن العدد من الخلايا/صورة قد تكون ذات فائدة للنظر في الآليات التي قد تساهم الاختلافات الفريق ينظر في التعبير إشارة/الخلية (الشكل 3B-3D).
  4. تحليل إحصائيا "المجموعات" تلطيخ نمط (اختياري).
    1. دراسة التعبير/الخلية إشارة إلى تقديم متغير مستمر لمزيد من التحليل الإحصائي. استخدام نهجين اثنين، بما في ذلك عينة مستقلة اختبار t وتحليل التباين (ANOVA)، استناداً إلى العدد من العوامل من بين المواضيع المدرجة في التصميم. شجرة قرار إحصائية (الشكل 4) قد تساعد في اتخاذ القرارات فيما يتعلق بالنهج الإحصائية الأكثر ملاءمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ولاحظت الدراسة الحالية "نقاط منفصلة" تلطيخ نمط التعبير الجيش الملكي النيبالي بمستقبلات الدوبامين D1-ألفا (Drd1α) في ائتلاف البرنامج الجديد في الفئران F344/N (الشكل 1A). إشارات fluorescence الفردية تم التعرف عليها بسهولة، ويمكن اعتبار واحد "النقاط"، يمثل كل منها نسخة ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول، يمكننا وصف تقنية رواية من التهجين في الموقع لشرائح مجمدة طازجة الدماغ لتقييم التعبير مستقبلات Drd1α في accumbens نواة (NAc) والتعبير تيروزين hydroxylase (ال) في المنطقة الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية). كما نقوم بتوفير أساليب تحليل البيانات لمختلف أنماط المصبوغة: "?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا يوجد أي تضارب في المصالح تعلن.

Acknowledgements

ودعمت الأعمال الحالية بالمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المنح HD043680، MH106392، DA013137، و NS100624. صندوق جزئية قدمت منحة تدريب T32 المعاهد الوطنية للصحة في مجال العلوم الطبية الحيوية-السلوكية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HybEZ Oven systemAdvanced Cell Diagnostics 310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1aAdvanced Cell Diagnostics 317031Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics 320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoryH-4000
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rackFisher ScientificNC9837976
Tissue-Tek staining dishFisher ScientificNC0731403
Precision General Purpose BathsThermoFisher ScientificTSGP28
Pretreatment 4Advanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagentLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
EZ-C1 software packageNikon Instrumentsversion 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,version 9.4

References

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 D1 Drd1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved