Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

Resumen

Identificación del receptor de dopamina D1-alfa en el Núcleo accumbens es fundamental para clarificar la disfunción del receptor D1 durante una enfermedad del sistema nervioso central. Se realizó un análisis para un RNA nuevo en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en un área específica del cerebro.

Resumen

En el sistema nervioso central, el receptor del subtipo de D1-alfa (Drd1α) es el receptor más abundante de dopamina (DA), que desempeña un papel vital en la regulación del desarrollo y el crecimiento neuronal. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a las anormalidades del receptor Drd1α mediar las respuestas del comportamiento y la modulación de la función de memoria de trabajo aún no están claros. Usando un análisis nuevo RNA en situ el hibridación, el estudio actual identificado dopamina Drd1α del receptor y la tirosina hidroxilasa (TH) RNA expresión de circuitos relacionados con la DA en el Núcleo accumbens (NAc) área y región de nigra del substantia (SNR), respectivamente. Expresión de Drd1α en el NAc muestra un "punto discreto" patrón de tinción. Se observaron diferencias de sexo claro en la expresión de Drd1α. Por el contrario, TH muestra un patrón de coloración "cluster". En cuanto a la expresión de TH, ratas hembra muestran una mayor expresión de la señal por la célula en relación con los animales masculinos. Los métodos presentados aquí ofrecen una técnica novedosa en situ hibridación para investigar cambios en la disfunción del sistema dopamina durante la progresión de enfermedades del sistema nervioso central.

Introducción

Disfunción del sistema de dopamina estriatal está implicada en la progresión de los síntomas clínicos observados en múltiples enfermedades neurocognitivas. Los receptores D1 de dopamina están presentes en la corteza prefrontal (PFC) y regiones estriadas del cerebro y fuertemente influyen en procesos cognitivos¹, incluyendo memoria, el procesamiento temporal y comportamiento locomotor^{2,3 , 4 , 5 , 6 , 7}. estudios anteriores aclaran que los cambios de los receptores de dopamina D1 se asocian con la progresión de atención e hiperactividad déficit trastorno (TDAH)⁸, los síntomas neurocognitivos en la esquizofrenia^{9, 10} y estrés sensibilidad¹¹. Específicamente, en la esquizofrenia, estudios de tomografía por emisión de positrones (PET) indican que la capacidad de unión de los receptores D1 de dopamina en las cortezas prefrontales muy fue relacionado con déficit cognoscitivo y la presencia de síntomas negativos¹¹. El crecimiento dendrítico de las neuronas excitatorias de la corteza prefrontal, regulado por el receptor de dopamina D1 alivia la susceptibilidad al estrés biológico. Además, la caída del receptor D1 en las neuronas corticales prefrontal medial (mPFC) podría mejorar la derrota social evitación social inducida por estrés¹².

Aquí, presentamos una nueva técnica de RNA en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en una célula con las muestras de tejido fresco congelado. La presente técnica tiene varias ventajas sobre los métodos que existen en la literatura actual. En primer lugar, el procedimiento actual conserva el contexto espacial y morfológico de los tejidos y se realizó en muestras de tejido fresco congelado para que otros procedimientos que requieren la fresca, los tejidos no incrustados pueden combinarse con los métodos actuales. Procedimientos similares en los tejidos fijados con formol y embebido en parafina han ilustrado que resolución de transcripción solo se puede conseguir usando una RNA en situ hibridación técnica¹³. Detección de RNA en el nivel de transcripción solo ofrece una sensibilidad superior a baja copia número expresión así como la oportunidad de comparar la expresión génica a nivel de células individuales que no pueden lograrse por otros métodos de detección de ácidos nucleicos, como técnicas de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Además, el método actual mantiene imágenes con un alto cociente signal-to-noise a través de sondas muy específicas de RNA que son hibridadas de las transcripciones del RNA solo objetivo y secuencialmente vinculadas con una cascada de moléculas de amplificación de señal en la detección sistema. Finalmente, la tecnología actual ofrece la oportunidad de evaluar varios sistemas biológicos con sus sondas propietarias específico del destino, en lugar de limitar nuestra investigación a sólo una clase de marcadores relacionados con el sistema tales como la detección de proteínas por métodos de inmunohistoquímica.

En nuestro estudio, utilizamos esta novela RNA en situ hibridación para evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la tirosina hidroxilasa (TH) expresión en el nigra del substantia (SNR) de ratas de F344/N machos y hembras. La innovadora RNA en situ hibridación nos permitió investigar los mecanismos que influyen en la absorción DA y DA liberación simultáneamente, mejorando nuestra comprensión de la complejidad del sistema estriado DA. Aquí, describimos el procedimiento para el cerebro congelado rodajas y proporcionar métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: "punto discreto" o "clusters".

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Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por el cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: A3049-01).

1. preparación de secciones del cerebro congelado fresco

1. Utilizar la cepa de ratas de F344/N: tres ratas de cada sexo, 13 meses de edad, aproximadamente 320 g del peso del cuerpo.
2. Ajustar la concentración de sevoflurano al 5% (sobredosis de sevoflurano). Continúa exposición de sevoflurano después detiene por un minuto adicional.
3. Decapitar a la rata y quitar el cerebro.
4. Sumergir el cerebro de la rata en nitrógeno líquido durante 15 s a 5 min de la cosecha de tejido.
5. Equilibrar el cerebro a-20 ° C en un criostato para 1 h.
6. Cortar 30 μm secciones y transferir a diapositivas (véase Tabla de materiales).
7. Elegir las secciones de la región de accumbens del núcleo, aproximadamente 2,76 mm a 2,28 mm anterior Bregma¹⁴.
8. Cortar continuamente el cerebro de la rata del bulbo olfatorio a través de la región de accumbens del núcleo según la estructura de estereotáctica cerebral de la rata.
9. Montaje de muestras en las diapositivas. Mantener las secciones a-20 ° C por 10 min secar.
10. Inmediatamente sumerja los portaobjetos en el pre enfriado paraformaldehído al 4% durante 1 h a 4 ° C.
11. Coloque los portaobjetos en un gradiente creciente de etanol a temperatura ambiente (RT): 50% EtOH por 5 min; 70% EtOH por 5 min; y 100% EtOH durante 5 minutos.
12. Repita con fresco 100% EtOH.
13. Coloque los portaobjetos en un papel absorbente y secar al aire.
14. Dibujar una barrera alrededor de cada sección con un lápiz de la barrera (véase Tabla de materiales). Deje que se seque completamente durante 1 min la barrera.

2. pretratamiento de las secciones de la cerebral

1. Encender el horno y la temperatura a 40 ° C.
2. Añadir 3 gotas (90 μl) del reactivo 4 pretratamiento (véase Tabla de materiales) en cada sección del cerebro (una parte por diapositiva).
3. Incubar las secciones por 30 min a TA.
4. Sumerja los portaobjetos de 1 x PBS durante 1 min a RT. repetir con frescos de 1 x PBS.
   Nota: Los portaobjetos no deben permanecer en PBS 1 x durante más de 15 minutos.

3. ARN In Situ hibridación fluorescente Multiplex ensayo

1. Caliente la punta de prueba del objetivo por 10 min a 40 ° C en un baño de agua y luego enfriar a RT.
2. Colocar el reactivo RNA (por ejemplo, Amp FL 1-4) a TA.
3. Quitar exceso de líquido de portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
4. Añadir 3 gotas (90 μl) de sonda Drd1α (C1) en el segmento de muestra. Incubar por 2 h a 40 ° C.
5. Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
6. Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
7. Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 1-FL en el segmento de muestra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
8. Sumerja el portaobjetos en el tampón de 1 lavado por 2 min en RT. repetir con el almacenador intermediario fresco 1wash.
9. Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
10. Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 2-FL en el segmento de muestra. Incubar por 15 min a 40 ° C.
11. Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
12. Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
13. Añadir 3 gotas (90 μl) de 3 Amp-FL en el segmento de muestra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
14. Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 min a RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
15. Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
16. Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 4-FL-Alt A en el segmento de muestra. Incubar por 15 min a 40 ° C.
17. Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
18. Quitar exceso de líquido de diapositivas e inmediatamente Coloque 2 gotas de reactivo de montaje (véase Tabla de materiales) en cada sección.
19. Coloque un cubreobjetos de 22 mm 22 mm (véase Tabla de materiales) en cada sección del cerebro.
20. Almacenar diapositivas en la oscuridad a 2-8 ° C hasta que se seque.
21. Encienda el microscopio confocal y cambiar a un objetivo X 60.
22. Obtener imágenes Z-stack con un microscopio confocal. Ver el video suplementario para un procedimiento de detalle de la proyección de imagen confocal.
23. Adquisición de imágenes de Drd1α etiquetado de células en la región de accumbens del núcleo (excitación: 488 nm; Emisión: 515/30 nm).
    Nota: No deje que el cerebro las secciones secan entre pasos de incubación.

4. Análisis de datos

1. Semi-cuantitativamente analizar el patrón de tinción: "puntos discretos".
   1. Para identificar la celda individual de la imagen, realizar tinción DAPI como marcador nuclear. Sin embargo, es todavía difícil de analizar ciertas partes del tejido cerebral ya que cuenta con varios tipos de células con forma irregular de los núcleos o células. Aquí, dos investigadores experimentados asignan por separado cada célula de imágenes para definir la región de la célula.
   2. Marcar visualmente cada célula dentro de las imágenes confocales representativas basadas en el número de puntos por celular usando los criterios específicos (figura 1B).
   3. Determinar el número total de células en cada categoría y dividir por el número total de la célula x100 para crear gráficos de frecuencia relativa que muestra la frecuencia porcentual de células dentro de cada categoría para todas las secciones de tejido (figura 2A) y para machos y hembras por separado (Figura 2E).
   4. Dividir la suma de las células en todas las categorías anteriores por el número total de la célula x100 para determinar la frecuencia acumulativa de las células para todas las secciones de tejido (figura 2B) y para machos y hembras por separado (figura 2F).
2. Analizar estadísticamente los "puntos discretos" (opcional) del patrón de coloración.
   1. Examinar el número de puntos por la célula para proporcionar una variable categórica que es ordinal en naturaleza (es decir, el número de células que caen en cada categoría de fila de menor expresión de células (1) a la más alta expresión de la célula (9)) para más análisis estadísticos.
   2. Tras un examen de estadística descriptiva, usar tres enfoques principales: una estadística de Mantel-Haenszel, una prueba U de Mann-Whitney y una prueba de Kruskal-Wallis. Aunque el enfoque estadístico exacto dependerá la pregunta de investigación y diseño experimental de interés, un árbol de decisión estadística (figura 4) puede ayudar en la toma de decisiones con respecto a su enfoque analítico.
3. Cuantificar la intensidad de la señal en la región de interés (ROI) para el patrón de tinción: "clusters".
   1. Calcular la intensidad de la señal de cada imagen utilizando la siguiente ecuación:
      Intensidad de la señal = intensidad Total de ROI imagen - (fondo media intensidad × imagen Total área)
   2. Contar el número total de células dentro de la imagen ROI para calcular la expresión aproximada de la señal por la célula. Grupo diferencias en intensidad de señal e imágenes así como el número de células, imagen pueden ser de interés considerar mecanismos que pueden contribuir a las diferencias de grupo en señal expresión celular (figura 3B-3D).
4. Analizar estadísticamente los "clusters" (opcional) del patrón de coloración.
   1. Examinar la expresión/célula de la señal para proporcionar una variable continua para su posterior análisis estadístico. Uso dos enfoques, incluyendo una prueba t de muestras independientes y análisis de varianza (ANOVA), basado en el número de factores entre sujetos incluidos en el diseño. Un árbol de decisión estadística (figura 4) puede ayudar en la toma de decisiones sobre el enfoque estadístico más adecuado.

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Resultados

El presente estudio observó un "puntos discretos" patrón para la expresión de RNA en los receptores de la dopamina D1-alfa (Drd1α) de coloración del NAc en ratas de F344/N (figura 1A). Las señales de fluorescencia individual fueron identificadas fácilmente y pueden ser vistas como solo "puntos," cada uno de los cuales representa una sola transcripción RNA dentro de la célula. Imágenes del NAc que muestran los "puntos discretos" patrón de tinción, ...

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Discusión

En este protocolo, describimos una nueva técnica de hibridación en situ para rebanadas de cerebro congelado evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la expresión de tirosina hidroxilasa (TH) en la región de nigra del substantia (SNR). También ofrecemos métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: "punto discreto" o "clusters".

Los pasos críticos para un ensayo de fluorescencia multiplex éxito RNA en situ hibridac...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HybEZ Oven system	Advanced Cell Diagnostics	310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1a	Advanced Cell Diagnostics	317031	Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2	Advanced Cell Diagnostics	314651-C2	Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit	Advanced Cell Diagnostics	320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratory	H-4000
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
4% paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack	Fisher Scientific	NC9837976
Tissue-Tek staining dish	Fisher Scientific	NC0731403
Precision General Purpose Baths	ThermoFisher Scientific	TSGP28
Pretreatment 4	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent	Life Technologies	P36930
Amp 1-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
Amp 2-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
Amp 3-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
Amp 4-FL-Alt A	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
EZ-C1 software package	Nikon Instruments		version 3.81b
SAS/STAT Software	SAS Institute, Inc.,		version 9.4