JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

Özet

Merkezi sinir sistemi nöronal büyüme ve gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynar en bol (DA) dopamin reseptör D1-Alfa alt türü reseptör (Drd1α) olduğunu. Ancak, davranışsal yanıt arabuluculuk ve çalışma bellek işlevi modülasyonlu Drd1α reseptör anormallikler temel mekanizmaları hala pek açık değildir. Bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil kullanarak, geçerli çalışma Drd1α dopamin reseptör ve tirozin hidroksilaz (TH) RNA ifadeden DA ilgili devre nucleus accumbens (NAc) alan ve gözlemliyorum nigra bölgesinde (SNR), tespit anılan sıraya göre. Kak Drd1α ifadede "ayrı nokta deseni boyama" gösterir. Drd1α ifade açık cinsiyet farklılıkları tespit edildi. Buna ek olarak, TH "kümelenmiş" boyama desen gösterir. TH ifade ile ilgili dişi rats erkek hayvanlar göreli hücre başına daha yüksek bir sinyal ifadesi görüntülenir. Burada sunulan yöntemleri bir roman situ hibridizasyon Teknik Merkezi sinir sistemi hastalıkları ilerleme sırasında dopamin sistem disfonksiyon değişimler soruşturma için sağlar.

Giriş

Disfonksiyon striatal dopamin sisteminin birden çok nörobilişsel hastalıklarda gözlenen klinik belirtiler ilerlemesini ilgilenmektedir. Dopamin D1 reseptörleri prefrontal korteks (PFC) ve beynin striatal bölgeler varsa ve Bilişsel süreçler1bellek, zamansal işleme ve lokomotif davranış2,3 çalışmak dahil olmak üzere, ağır etkisi , 4 , 5 , 6 , 7. önceki çalışmalar aydınlatılmamıştır değişiklikleri reseptörlerinin dopamin D1 ilerlemesini dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB)8, şizofreni9, nörobilişsel belirtiler ile ilişkili bulunmuştur 10 ve stres duyarlılık11. Özellikle, şizofreni, Pozitron emisyon tomografisi (PET) çalışmalar dopamin D1 reseptörleri prefrontal cortices bağlama yeteneği son derece bilişsel açıkları ve negatif belirtiler11varlığı ile ilgili belirtti. D1 dopamin reseptör tarafından düzenlenir prefrontal korteks eksitatör nöronlar dendritik büyüme stres duyarlılık azaltır. Ayrıca, D1 reseptör medial prefrontal kortikal (mPFC) nöronlar içinde nakavt sosyal yenilgi sosyal kaçınma stres kaynaklı12geliştirmek.

Burada, tek RNA molekülleri ile taze donmuş doku örneklerini bir hücre görselleştirmek için RNA in situ hibridizasyon roman tekniği tanıtmak. Mevcut teknik içinde geçerli edebiyat mevcut yöntemleri üzerinde birden çok avantajları vardır. İlk olarak, geçerli yordam doku kayma ve morfolojik bağlamında korur ve böylece taze gerektiren diğer yordamlar, gömülü olmayan doku geçerli yöntemleri ile kombine taze donmuş doku örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Formalin sabit ve parafin gömülü dokularda benzer yordamlar tek transkripsiyon çözünürlük bir RNA in situ hibridizasyon tekniği13kullanılarak elde edilebilir gösterildiği. RNA tek transkripsiyon düzeyinde algılanması üstün hassasiyet düşük kopya numara ifadesi hem de diğer nükleik asit algılama yöntemlerle elde tek tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu karşılaştırmak için fırsat sağlar, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri gibi. Ayrıca, geçerli yöntem için tek hedef RNA transkript melezleşmiştir ve sıralı olarak algılama sinyali amplifikasyon molekülleri bir çağlayan ile bağlı çok özel RNA probları ile imge ile yüksek sinyal gürültü oranı korur sistem. Son olarak, günümüz teknolojisi soruşturmamız için yalnızca bir sınıf sistemi ile ilgili işaretleri tarafından protein algılaması gibi sınırlama yerine onun hedef özgü özel probları ile birden çok biyolojik sistemleri değerlendirmek için fırsat sağlar immünhistokimya yöntemleri.

Bizim çalışmada, biz bu roman RNA in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve gözlemliyorum nigra (SNR) tirozin hidroksilaz (TH) ifadesinde değerlendirmek için her ikisi erkek ve dişi F344/N fareler kullandık. Yenilikçi RNA in situ hibridizasyon DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistemin karmaşıklığı anlayışımızı geliştirmek mekanizmaları incelemek için bize etkin. Taze donmuş beyin dilimler ve veri analiz yöntemleri farklı boyama desenleri için sağlamak için burada, biz açıklayınız: "ayrı nokta" veya "kümeler".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deneysel protokol hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of South Carolina tarafından kabul edildi (federal güvence numarası: A3049-01).

1. taze donmuş beyin bölümleri hazırlanması

  1. F344/N sıçan zorlanma kullanın: her seks üç fareler 13 ay-in yaş, vücut ağırlığı yaklaşık 320 g.
  2. Sevoflurane konsantrasyonu % 5 (sevoflurane dozda) için ayarlayın. Sevoflurane maruz kalma durur bir dakika için nefes sonra devam.
  3. Fareyi başını kesmek ve beyin kaldırın.
  4. Sıçan beyin 15 için sıvı azot daldırın doku hasat 5 dk içinde s.
  5. -20 ° C'de 1 h için cryostat beyne equilibrate.
  6. 30 µm bölümleri kesilmiş ve ( Tablo malzemelerigörmek) slaytlar aktarın.
  7. Nucleus accumbens bölgesinden yaklaşık 2,76 mm Bregma14anterior 2.28 mm bölümleri tercih.
  8. Sürekli dilim olfaktör ampul nucleus accumbens bölgeye göre fare stereotaksik beyin yapısı ile fare beyninden.
  9. Örnek slaytlar üzerine monte. -20 ° c kuru için 10 dakika için bölümleri tutmak.
  10. Hemen bırakın önceden soğutulmuş %4 paraformaldehyde 4 ° C'de 1 h için slaytları
  11. Oda sıcaklığında (RT) artan bir etanol degrade slaytlar yer: % 50 alkol 5 dakika; % 70 alkol 5 dakika; ve %100 5 min için alkol.
  12. Taze %100 ile tekrar alkol.
  13. Slaytlar emici kağıt üzerine yerleştirin ve kuru hava.
  14. Bir bariyer her bölümün bariyer kalemle çizin ( Tablo malzemelerigörmek). 1 dk. tamamen kuru bariyer izin.

2. ön beyin bölümleri

  1. Fırını ve 40 ° c sıcaklık ayarla
  2. 3 damla (90 µL) Önarıtma 4 reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her beyin bölümünde (slayt başına bir bölüm).
  3. 30 dk RT. az için bölümleri kuluçkaya
  4. 1 x PBS RT. tekrar ediyorum, 1 dk. için taze 1 x PBS ile slaytları daldırın.
    Not: 1 x PBS 15dk daha uzun süre içinde slayt kalmamalıdır.

3. RNA In Situ hibridizasyon floresan Multiplex tahlil

  1. Hedef sonda bir su banyosunda 40 ° C'de 10 dakika sıcak ve sonra RT için cool
  2. RNA reaktif yerleştirin (örneğin, Amp 1-4 FL), RT.
  3. Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
  4. 3 damla (90 µL) örnek dilim üzerinde Drd1α inceleyebilirsek (C1) ekleyin. 40 ° C'de 2 h için kuluçkaya
  5. Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.
  6. Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
  7. Amp 1-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  8. Taze 1wash arabellek ile RT. tekrar 2 min için 1 yıkama tampon içindeki slaytları daldırın.
  9. Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
  10. Amp 2-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
  11. Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.
  12. Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
  13. Amp 3-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  14. Taze 1 yıkama arabellek x ile yıkama arabellek RT. tekrar 2 min için x 1 içindeki slaytları daldırın.
  15. Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
  16. Amp 4-FL-Alt A örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
  17. Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.
  18. Aşırı sıvı slaytlardan kaldırmak ve hemen montaj reaktif 2 damla yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her bölüme.
  19. 22 mm 22 mm coverslip yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her beyin bölümü üzerinde.
  20. Slaytları 2-8 ° C'de karanlık kadar kuru depolama.
  21. Confocal mikroskobunun açmak ve bir 60 X amaç için geçiş.
  22. Z-yığın görüntü confocal mikroskopla elde. Tamamlayıcı video confocal görüntüleme ayrıntılı yordam için bkz.
  23. Nucleus accumbens bölgedeki hücreler etiketli Drd1α görüntüleri (uyarma: 488 nm; Emisyon: 515/30 nm).
    Not: beyin bölümleri arasında kuluçka adımları kurumasına izin vermeyin.

4. veri analizi

  1. Boyama desen yarı kantitatif analiz: "ayrık noktalar".
    1. Görüntü tek hücre tanımlamak için DAPI nükleer bir işareti olarak boyama gerçekleştirmek. Ancak, birden çok türde hücre çekirdeği ve/veya hücreler düzensiz şekli ile olduğundan beyin doku bazı kısımlarını çözümlemek hala zordur. Burada, iki deneyimli araştırmacılar hücre bölgesi tanımlamak için görüntülerden her hücre ayrı olarak atayın.
    2. Görsel olarak her hücre içinde belirli bir ölçüte uyan (şekil 1B) kullanarak hücre başına nokta sayısını temel alan temsilcisi confocal görüntüleri puan.
    3. Her kategoride toplam cep numarasını belirlemek ve tüm doku bölümlerin (şekil 2A) hem kadın ve erkek için her kategori içindeki hücreleri yüzde frekans görüntüleyen göreli sıklığı grafikler oluşturmak için toplam hücresini sayı x100 bölmek ayrı ayrı (şekil 2E).
    4. Tüm önceden kategoriler içinde hücrelerin toplamı ayrı ayrı hücreleri tüm doku bölümlerin (şekil 2B) ve kadın ve erkek için toplu sıklığını belirlemek için toplam hücresini sayıya x100 bölme (şekil 2F).
  2. "Ayrık noktalar desen (isteğe bağlı) boyama" istatistiksel analiz.
    1. Sıralı (Yani, her rütbe en düşük hücre ifade (1) yüksek hücre ifadesi (9) kategoriye dahil hücre sayısı) doğada kategorik bir değişken sağlamak için hücre başına nokta sayısını inceleyin daha da İstatistiksel analizler için.
    2. Tanımlayıcı istatistik muayene sonrasında, üç ana yaklaşım kullanın: bir şömine-Haenszel istatistik, Mann-Whitney U testi ve Kruskal-Wallis testi. Kesin istatistiksel yaklaşım üzerine bağlı olacaktır, ancak faiz, istatistiksel karar ağacı (şekil 4) deneysel tasarım ve araştırma sorusu bir analitik yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.
  3. Desen boyama için sinyal şiddeti faiz (ROI) bölgesinde ölçmek: "kümeler".
    1. Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü sinyali yoğunluğunu hesaplamak:
      Sinyal şiddeti toplam yatırım Getirisi görüntü - (ortalama arka plan yoğunluğu × Toplam görüntü alanını) yoğunluğu =
    2. Toplam hücre başına yaklaşık sinyal ifade hesaplamak için yatırım Getirisi görüntü içindeki hücreleri saymak. Sinyal şiddeti/resim hem de hücreleri/resim sayısı grup farklılıkları sinyal ifade/hücrede görülen grup farklılıklara katkıda bulunabilir mekanizmaları dikkate ilgi olabilir (şekil 3B-3D).
  4. "Desen (isteğe bağlı) Boyama kümeleri" istatistiksel analiz.
    1. Daha fazla istatistiksel analiz için bir sürekli değişken sağlamak için sinyal ifade/hücre inceleyin. Kullanım tasarımında bir bağımsız örnek t-Testi ve konular arasındaki faktörler sayısına göre Varyans analizi (ANOVA), dahil olmak üzere iki yaklaşım dahil. İstatistiksel karar ağacı (şekil 4) en uygun istatistiksel yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Çalışmada "(şekil 1A) F344/N Sıçanlarda NAC desen dopamin D1-Alfa reseptörleri (Drd1α) RNA ifade için boyama bir ayrık noktalar" görülmektedir. Bireysel Floresans sinyalleri kolayca tespit edilmiştir ve görülebilir tek "nokta," her biri tek bir RNA transkript hücre içinde temsil eder. "Ayrık noktalar desen boyama" ekran görüntüleri için Kak, ifade yarı kantitatif analiz (şekil 1A, şek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol için in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve tirozin hidroksilaz (TH) ifade gözlemliyorum nigra (SNR) bölgesinde değerlendirmek için taze donmuş beyin dilimler için roman tekniği tarif. Ayrıca farklı boyama desenleri için veri analizi yöntemleri sağlar: "ayrı nokta" veya "kümeler".

Başarılı multiplex Floresans RNA in situ hibridizasyon tahlil için kritik adımlar dahil edilir. Don sıçan decapitating ve beyin, ka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Hiçbir bildirmek için çıkar çatışması vardır.

Teşekkürler

Mevcut işleri Sağlık (NIH) hibe HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklendi. Kısmi Fonu Biyomedikal davranış bilimleri NIH T32 eğitim grant tarafından sağlandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
HybEZ Oven systemAdvanced Cell Diagnostics 310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1aAdvanced Cell Diagnostics 317031Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics 320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoryH-4000
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rackFisher ScientificNC9837976
Tissue-Tek staining dishFisher ScientificNC0731403
Precision General Purpose BathsThermoFisher ScientificTSGP28
Pretreatment 4Advanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagentLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
EZ-C1 software packageNikon Instrumentsversion 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,version 9.4

Referanslar

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 133RNA hibridizasyondopamin D1 Alfa resept r Drd1in situn rolojikbiyolojik cinsiyets an

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır