JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Идентификация Дофаминовый рецептор D1-альфа в прилежащем имеет решающее значение для прояснения дисфункции рецептор D1 во время болезни центральной нервной системы. Мы исполняли Роман РНК в situ гибридизация пробирного визуализировать одной молекулы РНК в области конкретных мозга.

Аннотация

В центральной нервной системе подтип рецепторов D1-альфа (Drd1α) является наиболее распространенных рецептора допамина (DA), которая играет жизненно важную роль в регулировании нейрональных роста и развития. Однако лежащих в основе Drd1α рецептор аномалии посреднической поведенческих реакций и модулирует функции памяти рабочих механизмов по-прежнему неясны. С помощью Роман РНК в situ гибридизация пробирного, текущего исследования определили допамина Drd1α рецептор и тирозина гидроксилазы (TH) РНК выражение от связанных с DA цепь в nucleus accumbens (NAc) области и региона substantia nigra (SNR), соответственно. Drd1α выражение в Североатлантическом совете показывает «дискретные точка» окрашивание шаблон. Четкие половые различия в Drd1α выражении наблюдались. В противоположность этому й показывает шаблон «кластерной» окрашивание. Что касается й выражение самок крыс отображается выражение выше сигнала на ячейку относительно Мыжские животные. Представленные здесь методы предоставляют Роман в situ гибридизация техника для изучения изменений в дисфункции системы допамина при прогрессировании заболевания центральной нервной системы.

Введение

Дисфункция системы допамина полосатой участвует в прогрессии клинические симптомы, наблюдаемые в нескольких нейрокогнитивный заболеваний. Приемные устройства допамина D1 присутствуют в префронтальной коре (ПФУ) и полосатой регионах мозга и сильно влияние когнитивные процессы1, включая рабочей памяти, временной обработки и тепловоз поведение2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. предыдущие исследования раскрыты, что изменения приемные устройства допамина D1 были связаны с прогрессированием внимания гиперактивности дефицита расстройства (СДВГ)8, нейрокогнитивный Симптомы шизофрении9, 10 и стресс восприимчивость11. Конкретно в шизофрении, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) исследования показали, что способность привязки D1 рецепторы допамина в префронтальной коре высоко была связана с познавательных дефицитов и наличие негативных симптомов11. Дендритных рост возбуждающих нейронов в префронтальной коре, регулируется рецептора допамина D1 снимает стресс восприимчивости. Кроме того сногсшибательно рецептор D1 в медиальной префронтальной коры головного мозга (mPFC) нейронов может повысить социальный поражения стресс индуцированного социальной избежания12.

Здесь мы представляем Роман технику РНК в situ гибридизация визуализировать одной молекулы РНК в клетке с образцами тканей свежемороженые. Настоящий метод имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, которые существуют в рамках текущей литературы. Во-первых нынешняя процедура сохраняет контекст пространственных и морфологических ткани и была исполнена на образцы тканей свежемороженые так, что другие процедуры, требующие свежие, невстроенный тканей могут быть объединены с текущими методами. Аналогичные процедуры в формалин исправлена и парафин врезанных тканей показали, что один транскрипции урегулирование может быть достигнуто с помощью РНК в situ гибридизация техника13. Обнаружение на уровне одного транскрипции РНК предоставляет улучшенные чувствительность к низкой копии номер выражения, а также возможность сравнить экспрессии генов на уровне отдельных ячеек, которые не могут быть достигнуты другими методами обнаружения нуклеиновой кислоты, такие методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того текущий метод поддерживает изображения с высоким соотношением сигнал шум через весьма специфические РНК зонды которые гибридизированных к одной цели РНК стенограммы и последовательно связаны с Каскад молекул усилители сигнала для обнаружения системы. Наконец настоящий технология обеспечивает возможность оценить несколько биологических систем с ее целевой объект специфического несвободных зондов, а не ограничивая наши расследования только один класс маркеров, связанных с системой, например обнаружение белка методы иммуногистохимии.

В нашем исследовании мы использовали этот роман РНК в situ гибридизация для оценки Drd1α экспрессии рецепторов в прилежащем ядре (NAc) и тирозина гидроксилазы (TH) выражение в Substantia (SNR) F344/N крыс обоего пола. Инновационный РНК в situ гибридизация позволило нам изучить механизмы, влияющие на поглощение да и да релиз одновременно, улучшение нашего понимания сложности системы полосатой да. Здесь, мы описать процедуру свежемороженые мозга ломтиками и предоставляют методы анализа данных для различных шаблонов окрашивание: «дискретные точка» или «группы».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Экспериментальный протокол был одобрен животное уход и использование Комитет (IACUC) в университете Южной Каролины (федеральные гарантии номер: A3049-01).

1. Подготовка секций свежий замороженные мозга

  1. Используйте F344/N штамм крыса: три крыс каждого пола, 13 месяцев, вес примерно 320 g тела.
  2. Отрегулируйте севофлюран концентрации до 5% (передозировка севофлюран). После дыхание останавливается за дополнительную минуту продолжение севофлюран экспозиции.
  3. Обезглавить крыса и удалить мозга.
  4. Опускайте мозга крысы в жидком азоте для 15 s в течение 5 мин ткани урожая.
  5. Сбалансировать мозга до-20 ° C в криостат для 1 h.
  6. Вырезать 30 мкм секций и перенести на слайды (см. Таблицу материалы).
  7. Выберите разделы из ядра accumbens региона, примерно 2.76 мм до 2,28 мм впереди Bregma14.
  8. Непрерывно срез мозга крысы от обонятельные луковицы через ядро accumbens региона согласно структуре стереотаксического мозга крысы.
  9. Установите образцы на слайды. Держите разделы при-20 ° C для 10 мин для просушки.
  10. Сразу же погружайте слайды в предварительно охлажденные параформальдегида 4% за 1 час при 4 ° C.
  11. Место слайды в рост этанола градиента при комнатной температуре (RT): 50% EtOH 5 мин; 70% EtOH 5 мин; и 100% EtOH за 5 мин.
  12. Повторите с свежими 100% EtOH.
  13. Место слайды на чистую фильтровальную бумагу, а воздух сухой.
  14. Нарисуйте барьер вокруг каждого раздела с помощью пера барьер (см. Таблицу материалы). Пусть барьер сухой полностью за 1 мин.

2. Предварительная обработка участков мозга

  1. Включите духовку и установите температуру до 40 ° C.
  2. Добавить 3 капли (90 мкл) реагента 4 предварительной обработки (см. Таблицу материалы) на каждой секции мозга (один раздел на слайд).
  3. Инкубировать в разделах 30 мин на RT.
  4. Опускайте слайды ПБС за 1 мин на RT. Repeat с свежими ПБС.
    Примечание: Слайды не должны оставаться в однократном ПБС более чем на 15 мин.

3. РНК в Situ гибридизация флуоресцентные мультиплекс Assay

  1. Теплый целевой зонд для 10 мин при 40 ° C на водяной бане, а затем охладить до RT.
  2. Место реагент РНК (например, Amp FL 1-4) на RT.
  3. Удалите избыток жидкости из слайдов с фильтровальной бумаги и место обратно на слайд стойки (см. Таблицу материалы).
  4. Добавьте 3 капли (90 мкл) Drd1α зонда (C1) на интервала. Проинкубируйте втечение 2 ч при температуре 40 ° C.
  5. Опускайте слайды в 1 x мыть буфер для 2 минут с свежий 1 x мыть буфера на RT. Repeat.
  6. Удалите лишнюю жидкость из слайдов с фильтровальной бумаги и место обратно на стойку слайд (см. Таблицу материалы).
  7. Добавьте 3 капли (90 мкл) Amp 1-FL на интервала. Инкубируйте 30 мин при 40 ° C.
  8. Опускайте слайды в буфере 1 умывальник на 2 мин на RT. Repeat с свежими 1wash буфера.
  9. Удалите лишнюю жидкость из слайдов с фильтровальной бумаги и место обратно на стойку слайд (см. Таблицу материалы).
  10. Добавьте 3 капли (90 мкл) Amp 2-FL на интервала. Инкубируйте 15 мин при 40 ° C.
  11. Опускайте слайды в 1 x мыть буфер для 2 минут с свежий 1 x мыть буфера на RT. Repeat.
  12. Удалите лишнюю жидкость из слайдов с фильтровальной бумаги и место обратно на стойку слайд (см. Таблицу материалы).
  13. Добавьте 3 капли (90 мкл) Amp 3-FL на интервала. Инкубируйте 30 мин при 40 ° C.
  14. Опускайте слайды в 1 x мыть буфер для 2 мин на RT. Repeat с свежий 1 x мыть буфера.
  15. Удалите лишнюю жидкость из слайдов с фильтровальной бумаги и место обратно на стойку слайд (см. Таблицу материалы).
  16. Добавьте 3 капли (90 мкл) Amp 4-FL-Alt A на интервала. Инкубируйте 15 мин при 40 ° C.
  17. Опускайте слайды в 1 x мыть буфер для 2 минут с свежий 1 x мыть буфера на RT. Repeat.
  18. Удалите лишнюю жидкость из слайдов и немедленно место 2 капель реагента монтажа (см. Таблицу материалы) на каждой секции.
  19. Место coverslip 22 мм 22 мм (см. Таблицу материалы) над каждой секции мозга.
  20. Хранить слайды в темноте при температуре 2-8 ° C до полного высыхания.
  21. Включите конфокального микроскопа и переключиться на 60 X цели.
  22. Получите Z-стек изображений с помощью конфокального микроскопа. Смотрите дополнительные видео подробно процедуры конфокальная томография.
  23. Получение изображений Drd1α помечены клетки в регионе nucleus accumbens (возбуждения: 488 нм; Эмиссия: 515/30 Нм).
    Примечание: Не позволяйте мозга, что разделы высохнуть между шагов инкубации.

4. анализ данных

  1. Полу-количественно анализировать окрашивание закономерность: «дискретных точек».
    1. Для идентификации отдельной ячейки из образа, выполняют DAPI окрашивание как ядерной маркер. Однако до сих пор трудно анализировать определенные части мозговой ткани, так как он имеет несколько типов клеток с неправильной формы ядрах или клетки. Здесь два опытных исследователей отдельно назначить каждой ячейки из изображений, чтобы определить область ячейки.
    2. Визуально оценка каждой ячейки в пределах представитель конфокальный изображений, основанный на количество точек на ячейке с помощью конкретных критериев (рис. 1B).
    3. Определение числа общей ячейки в каждой категории и разделить на число ячейке x100 для создания относительной частоты графики, отображающие процент частоты ячейки в пределах каждой категории для всех разделов ткани (рисунок 2A) и для мужчин и женщин отдельно (Рисунок 2E).
    4. Разделите сумму ячеек в рамках всех предыдущих категорий ячейке номер x100, чтобы определить совокупные частоты клеток для всех разделов ткани (рис. 2B) и для мужчин и женщин отдельно (Рисунок 2F).
  2. Статистически анализируем «дискретные точки «окрашивание шаблон (необязательно).
    1. Проверьте количество точек на ячейку предоставлять категориальной переменную, порядковый номер в природе (то есть, количество ячеек, которые попадают в каждой категории ранга низкие клеток выражения (1) к высшим выражением клетки (9)) для дальнейшего статистического анализа.
    2. После изучения описательной статистики, использовать три основных подхода: каминные-Haenszel статистики, тест U Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. Хотя точный статистический подход будет зависеть экспериментальной разработки и исследования вопрос о интерес, дерево статистических решений (рис. 4) может помочь в принятии решений, касающихся аналитический подход.
  3. Количественную оценку интенсивности сигнала в регионе интереса (ROI) для окрашивания шаблон: «кластеры».
    1. Расчет интенсивности сигнала каждого изображения, используя следующее уравнение:
      Интенсивность сигнала = общая интенсивность ROI изображения - (средняя фоновая интенсивности × всего изображения район)
    2. Подсчитать общее количество клеток в пределах изображения ROI для вычисления выражение приблизительное сигнала в клетку. Группа различия в интенсивности сигнала и изображения, а также количество клеток/изображения могут представлять интерес для рассмотрения механизмов, которые могут способствовать групповых различий в сигнал выражение/ячейку (рис. 3Б-3D).
  4. Статистически анализируем «кластеры» окрашивание шаблон (необязательно).
    1. Просмотрите выражение/сотовый сигнал для обеспечения непрерывной переменной для дальнейшего анализа. Использование двух подходов, включая независимые t тест и дисперсионный анализ (ANOVA), основанный на количество факторов между предметы включены в дизайн. Статистическое решение дерево (Рисунок 4) могут помочь в принятии решений относительно наиболее подходящего статистического подхода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Настоящее исследование наблюдается «дискретных точек» окрашивание шаблон для выражения РНК в дофаминовых рецепторов D1-альфа (Drd1α) САС в F344/N крыс (рис. 1A). Флуоресценции отдельных сигналов были легко идентифицированы и может рассматриваться как единый ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем Роман технику в situ гибридизация свежемороженые мозга фрагментов для оценки Drd1α экспрессии рецепторов в прилежащем ядре (NAc) и тирозина гидроксилазы (TH) выражение в регионе nigra substantia (SNR). Мы также предоставляем методы анализа данных для различных шаблон?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Существует без конфликта интересов объявить.

Благодарности

Настоящей работы были поддержаны национальные институты здравоохранения (NIH) грантов, HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624. Частичные фонд оказали NIH T32 обучения Грант в биомедицинских и поведенческих наук.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HybEZ Oven systemAdvanced Cell Diagnostics 310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1aAdvanced Cell Diagnostics 317031Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics 320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoryH-4000
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rackFisher ScientificNC9837976
Tissue-Tek staining dishFisher ScientificNC0731403
Precision General Purpose BathsThermoFisher ScientificTSGP28
Pretreatment 4Advanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagentLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
EZ-C1 software packageNikon Instrumentsversion 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,version 9.4

Ссылки

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133D1 Drd1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены