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摘要

在伏隔核中多巴胺 D1-alpha 受体的鉴定对于澄清中枢神经系统疾病中 D1 受体功能障碍至关重要。我们进行了一个新的 rna 原位杂交检测, 以可视化单个 RNA 分子在特定的大脑区域。

摘要

在中枢神经系统中, D1-alpha 亚型受体 (Drd1α) 是最丰富的多巴胺 (DA) 受体, 在调节神经元生长发育中起着至关重要的作用。然而, Drd1α受体异常调解行为反应和调节工作记忆功能的机制尚不清楚。本研究采用一种新的 RNA原位杂交方法, 从伏隔核 (NAc) 区和黑质地区的大相关电路中确定多巴胺 Drd1α受体和酪氨酸羟化酶 (TH) RNA 的表达,分别.Drd1α在 NAc 中的表达式显示了一个 "离散点" 染色模式。Drd1α表达的性别差异明显。相比之下, TH 显示了 "聚集" 的染色图案。对于 TH 表达, 雌性大鼠比雄性动物显示每个细胞更高的信号表达。本文的方法提供了一种新的原位杂交技术, 用于调查中枢神经系统疾病进展过程中多巴胺系统功能障碍的变化。

引言

巴多巴胺系统的功能失调涉及多种认知疾病的临床症状进展。多巴胺 D1 受体存在于脑前额皮质 (PFC) 和巴区域, 严重影响认知过程1, 包括工作记忆、时间处理和机车行为2,3,4,5,6,7. 以往的研究表明, 多巴胺 D1 受体的变化与注意缺陷多动障碍 (ADHD)8的进展有关, 精神分裂症9的认知症状10和应力易感性11。具体地说, 在精神分裂症中, 正电子发射断层扫描 (PET) 研究表明, 前额皮质多巴胺 D1 受体的结合能力与认知缺陷和阴性症状的存在有很大关系11。多巴胺 D1 受体调节的前额皮质兴奋神经元的树突生长缓解了应激敏感性。此外, D1 受体在内侧前额皮质 (mPFC) 神经元中的击倒可以增强社会失败应激引起的社会回避12。

在这里, 我们介绍了一种新的 rna原位杂交技术, 以可视化的单一 RNA 分子在细胞与新鲜冰冻组织样本。目前的技术比现有文献中存在的方法有多种优势。首先, 目前的程序保留了组织的空间和形态背景, 并进行了新鲜冷冻组织样本, 以便其他程序需要新鲜的, 非嵌入组织可以结合目前的方法。福尔马林固定和石蜡嵌入组织的类似程序表明, 可以使用 RNA原位杂交技术13实现单转录分辨率。RNA 在单一转录水平上的检测提供了对低拷贝数表达的卓越敏感性, 同时也有机会将基因表达与其他核酸检测方法无法实现的单个细胞水平进行比较,如聚合酶链反应 (PCR) 技术。此外, 目前的方法通过高度特异的 rna 探针, 通过与单目标 rna 转录的杂交, 并在检测中按顺序绑定到信号放大分子的级联来维持高信噪比的图像。系统.最后, 目前的技术提供了一个机会, 以评估多个生物系统与其特定目标专有探针, 而不是限制我们的调查只有一类系统相关的标记, 如蛋白质检测免疫组化方法。

在我们的研究中, 我们使用这种新的 RNA原位杂交来评估 Drd1α受体表达在伏核 (NAc) 和酪氨酸羟化酶 (TH) 表达在黑质 (信噪比) 中的男性和女性 F344/N 大鼠。创新的 RNA原位杂交使我们能够同时调查影响 da 吸收和大释放的机制, 提高我们对巴 da 系统复杂性的理解。这里, 我们描述了新鲜冰冻脑切片的程序, 并提供了不同染色模式的数据分析方法: "离散点" 或 "簇"。

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研究方案

实验性议定书经美国南卡罗来纳州大学动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准 (联邦保证号: A3049-01)。

1. 新鲜冰冻脑切片的制备

  1. 使用 F344/N 鼠株: 每性别三只大鼠, 13 月龄, 体重约320克。
  2. 将七氟醚浓度调整为 5% (过量七氟醚)。在呼吸停止后继续接触七氟醚。
  3. 斩首鼠, 并删除大脑。
  4. 在5分钟的组织收获中, 将大鼠的大脑浸入液氮中, 十五年代。
  5. 平衡大脑到-20 °c 在恒温器1小时。
  6. 剪切30µm 节并转移到幻灯片上 (请参阅材料表)。
  7. 从伏隔核区域选择节, 大约2.76 毫米到2.28 毫米, 前 Bregma14。
  8. 根据大鼠的立体定向脑结构, 将大鼠脑从嗅球中连续切片到伏隔核区域。
  9. 将示例装载到幻灯片上。将各节保持在-20 摄氏度, 使其干燥10分钟。
  10. 立即浸泡在预冷4% 多聚甲醛的幻灯片1小时在4摄氏度。
  11. 将幻灯片置于室温 (RT) 的乙醇梯度增加: 50% 乙醇为5分钟;70% 乙醇为5分钟;100% 乙醇5分钟。
  12. 重复用新鲜的100% 乙醇。
  13. 将幻灯片放在吸水纸上, 风干。
  14. 使用障碍笔在每个节周围绘制一个屏障 (请参阅材料表)。让屏障完全干燥1分钟。

2. 脑部前处理

  1. 打开烤箱, 将温度设置为摄氏40摄氏度。
  2. 添加3滴 (90 µL) 预处理4试剂 (参见材料表) 在每个脑部 (每张幻灯片一节)。
  3. 在 RT 中孵化出30分钟的切片。
  4. 将幻灯片在 1x pbs 中浸没1分钟, 用新鲜的 1x pbs 重复。
    注: 幻灯片不应停留在 1x PBS 超过15分钟。

3. RNA 原位杂交荧光复用试验

  1. 在水浴中, 将目标探头加热10分钟至40摄氏度, 然后冷却至 RT。
  2. 将 RNA 试剂 (例如, 安培 1-4 FL) 放在 RT 上。
  3. 从带有吸水纸的幻灯片中取出多余的液体, 然后放回幻灯片架上 (请参阅材料表)。
  4. 在样品切片上添加3滴 (90 µL) 的 Drd1α探针 (C1)。在40摄氏度孵育2小时。
  5. 浸泡在1x 洗涤缓冲器在 RT 2 分钟的幻灯片. 用新鲜的1x 洗涤缓冲器重复。
  6. 从幻灯片上取出多余的液体, 用吸水纸将其放回幻灯片架上 (请参阅材料表)。
  7. 在样品片上添加3滴 (90 µL) 的安培 1-FL。孵育30分钟, 在40摄氏度。
  8. 浸泡在1洗涤缓冲的幻灯片2分钟的 RT. 重复使用新鲜的1wash 缓冲区。
  9. 从幻灯片上取出多余的液体, 用吸水纸将其放回幻灯片架上 (请参阅材料表)。
  10. 在样品片上添加3滴 (90 µL) 的安培 2-FL。孵育15分钟, 在40摄氏度。
  11. 浸泡在1x 洗涤缓冲器在 RT 2 分钟的幻灯片. 用新鲜的1x 洗涤缓冲器重复。
  12. 从幻灯片上取出多余的液体, 用吸水纸将其放回幻灯片架上 (请参阅材料表)。
  13. 在样品片上添加3滴 (90 µL) 的安培 3-FL。孵育30分钟, 在40摄氏度。
  14. 浸泡在1x 洗涤缓冲器的幻灯片在 RT 2 分钟. 用新鲜的1x 洗涤缓冲器重复。
  15. 从幻灯片上取出多余的液体, 用吸水纸将其放回幻灯片架上 (请参阅材料表)。
  16. 在样本切片上添加3滴 (90 µL) 安培 4-FL Alt A。孵育15分钟, 在40摄氏度。
  17. 浸泡在1x 洗涤缓冲器在 RT 2 分钟的幻灯片. 用新鲜的1x 洗涤缓冲器重复。
  18. 从幻灯片中取出多余的液体, 并立即将2滴安装试剂 (请参阅材料表) 放到每一节上。
  19. 在每个脑部放置一个22毫米22毫米盖玻片 (参见材料表)。
  20. 在黑暗中存放幻灯片2-8 °c 直到干燥。
  21. 打开共焦显微镜, 切换到60X 目标。
  22. 用共焦显微镜获取 Z 栈图像。有关共聚焦成像的详细过程, 请参阅补充视频。
  23. 在伏隔核地区获取 Drd1α标记细胞的图像 (激发: 488 nm;发射: 515/30 nm)。
    注意: 不要让大脑切片在孵化步骤之间进行干燥。

4. 数据分析

  1. 半定量分析染色模式: "离散点"。
    1. 要识别图像中的单个细胞, 请执行 DAPI 染色作为核标记。然而, 分析脑组织的某些部位仍然很难, 因为它有多种类型的细胞, 它们的细胞核和/或细胞形态不规则。在这里, 两位经验丰富的研究人员分别分配图像中的每个细胞来定义细胞区域。
    2. 根据每个单元格使用特定条件 (图 1B) 的点数, 直观地评分代表共焦图像中的每个单元格。
    3. 确定每个类别中的总单元格数并除以总单元格编号 x100 创建相对频率图, 以显示所有组织部分 (图 2A) 和男性和女性在每个类别中单元格的百分比频率。单独 (图 2E)。
    4. 将所有以前类别中的单元格总和除以单元格编号 x100, 以确定所有组织节 (图 2B) 和男性和女性的累计频率 (图 2F)。
  2. 统计分析 "离散点" 染色模式 (可选)。
    1. 检查每个单元格的点数, 以提供一个在本质上为序数的分类变量 (即从最低单元表达式 (1) 到最高单元格表达式 (9) 的单元格数, 以进行进一步的统计分析。
    2. 在对描述性统计进行检查后, 使用三主要方法: 壁炉 Haenszel 统计, 曼-惠特尼 U 测试和克鲁斯卡尔. 沃利斯测试。虽然精确的统计方法将依赖于实验设计和感兴趣的研究问题, 但统计决策树 (图 4) 可能有助于对分析方法做出决策。
  3. 量化在感兴趣区域的信号强度 (ROI) 的染色模式: "簇"。
    1. 使用以下公式计算每个图像的信号强度:
      信号强度 = ROI 图像的总强度 (平均背景强度 x 总图像区域)
    2. 计算 ROI 图像内的单元格总数, 以便对每个单元格的近似信号表达式求值。在信号强度/图像中的组差异以及单元格/图像的数目可能会引起关注, 考虑可能有助于在信号表达式/单元格中看到的组差异的机制 (图 3B-3D)。
  4. 统计分析 "簇" 染色模式 (可选)。
    1. 检查信号表达式/单元格, 以提供连续变量以进行进一步的统计分析。使用两种方法, 包括一个独立的样本 t 检验和方差分析, 根据在设计中包含的主体因素的数量。统计决策树 (图 4) 可以帮助做出有关最适当的统计方法的决策。

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结果

本研究观察了 F344/N 大鼠中 NAc 多巴胺 D1-alpha 受体 (Drd1α) 中 RNA 表达的 "离散点" 染色模式 (图 1A)。单个的荧光信号很容易被识别出来, 可以被看作是单个的 "点", 每一个都代表细胞内的一个 RNA 转录。对于显示 "离散点" 染色模式的 NAc 的图像, 我们使用半定量分析 (图 1A、图 2A& 2B) 来评估动态表?...

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讨论

在本协议中, 我们描述了一种新的用于新鲜冷冻脑切片的原位杂交技术, 以评估伏核 (NAc) 和酪氨酸羟化酶 (TH) 在黑质 (信噪比) 区的表达 Drd1α受体表达。我们还提供了不同染色模式的数据分析方法: "离散点" 或 "簇"。

包括了成功的多重荧光 RNA原位杂交试验的关键步骤。一旦斩首鼠, 取出大脑, 在5分钟内将大脑冷冻在液氮中. 保持大脑部分在-20 °c 直到4% 多聚甲醛固?...

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披露声明

声明没有利益冲突。

致谢

目前的工作得到了国家卫生研究院 (NIH) 赠款 HD043680、MH106392、DA013137 和 NS100624 的支持。部分基金由 NIH T32 的生物医学行为科学培训补助金提供。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
HybEZ Oven systemAdvanced Cell Diagnostics 310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1aAdvanced Cell Diagnostics 317031Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics 320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoryH-4000
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rackFisher ScientificNC9837976
Tissue-Tek staining dishFisher ScientificNC0731403
Precision General Purpose BathsThermoFisher ScientificTSGP28
Pretreatment 4Advanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagentLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850parts of kits
EZ-C1 software packageNikon Instrumentsversion 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,version 9.4

参考文献

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

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