Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

Résumé

Identification du récepteur D1-alpha de dopamine dans le noyau accumbens est critique pour clarifier le dysfonctionnement du récepteur D1 au cours d’une maladie du système nerveux central. Nous avons effectué un roman RNA essai in situ hybridation avec pour visualiser des molécules d’ARN unique dans une zone spécifiques du cerveau.

Résumé

Dans le système nerveux central, les récepteurs de sous-type D1-alpha (Drd1α) sont le plus abondant récepteur de dopamine (DA), qui joue un rôle essentiel dans la régulation du développement et croissance neuronale. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent les anomalies du récepteur Drd1α interceptent les réponses comportementales et moduler la fonction de mémoire de travail sont encore peu claires. Grâce à un roman RNA essai in situ hybridation avec, la présente étude a identifié dopamine Drd1α du récepteur et la tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression de circuits axés sur la DA dans le noyau accumbens (NAc) et région de substantia nigra (SNR), respectivement. Drd1α expression dans le CNA présente « point discret » modèle de marquage. Différences de sexe clair dans l’expression de Drd1α ont été observés. En revanche, TH montre un patron de coloration « groupée ». Au sujet de l’ÉNIÈME expression, rates affichent une expression plus élevée de signal par cellule par rapport à des animaux mâles. Les méthodes présentées ici fournissent une technique d’hybridation roman sur place pour enquêter sur les changements dans le dysfonctionnement du système dopamine au cours de la progression de la maladie du système nerveux central.

Introduction

Dysfonctionnement du système de dopamine striatale est impliqué dans la progression des symptômes cliniques observés dans plusieurs maladies neurocognitives. Les récepteurs dopaminergiques D1 sont présents dans le cortex préfrontal (PFC) et les régions striatum du cerveau et influencent fortement les processus cognitifs¹, y compris le travail de mémoire, traitement temporel et comportement locomotive^{2,3 , 4 , 5 , 6 , 7}. études antérieures élucidé que changements de récepteurs de la dopamine D1 étaient associés à la progression de l’attention-hyperactivité trouble de (l’attention THADA)⁸, les symptômes neurocognitifs dans la schizophrénie^9, stress et ¹⁰ susceptibilité¹¹. Plus précisément, dans la schizophrénie, par émission de positrons (TEP) études ont indiqué que la capacité de liaison des récepteurs de la dopamine D1 dans le cortex préfrontal était fortement liée à des déficits cognitifs et la présence de symptômes négatifs¹¹. La croissance dendritique des neurones excitateurs dans le cortex préfrontal, réglementés par les récepteurs de la dopamine D1 atténue la sensibilité aux stress. En outre, la précipitation du récepteur D1 dans les neurones du cortex préfrontal médial (MFPC) pourrait améliorer la défaite sociale induite par le stress social évitement¹².

Ici, nous présentons une nouvelle technique d’hybridation in situ RNA de visualiser des molécules d’ARN seul dans une cellule avec des échantillons de tissus frais congelés. La technique actuelle possède plusieurs avantages par rapport aux méthodes qui existent au sein de la littérature actuelle. Tout d’abord, la procédure actuelle conserve le contexte spatial et morphologique du tissu et a été réalisée sur des échantillons de tissus frais congelés afin que les autres procédures nécessitant fraîches, tissus non incorporé peuvent être combinés avec les méthodes actuelles. Des procédures similaires dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont illustré que résolution unique de transcription peut être réalisée en utilisant un RNA in situ hybridation technique¹³. Détection de l’ARN au niveau de la transcription unique offre une sensibilité supérieure à l’expression de numéro de faibles copies ainsi que la possibilité de comparer l’expression des gènes au niveau des cellules individuelles ne peuvent être réalisées par d’autres méthodes de détection des acides nucléiques, comme les techniques de polymérase de réaction en chaîne (PCR). En outre, la méthode actuelle tient à jour des images avec un rapport signal sur bruit élevé grâce à des sondes d’ARN très spécifiques qui sont hybridées aux transcriptions d’ARN cible unique et séquentiellement liés avec une cascade de molécules d’amplification de signal dans la détection système. Enfin, la technologie actuelle offre la possibilité d’évaluer les systèmes biologiques multiples avec ses sondes propriétaires spécifique à la cible, plutôt que de limiter notre enquête à la seule catégorie des marqueurs liés au système telles que la détection de la protéine par Méthodes d’immunohistochimie.

Dans notre étude, nous avons utilisé ce roman RNA in situ hybridation afin d’évaluer l’expression des récepteurs Drd1α dans le noyau accumbens (NAc) et l’expression de la tyrosine hydroxylase (TH) dans la substantia nigra (SNR) de rats F344/N mâles et femelles. L’innovants RNA in situ hybridation nous a permis d’étudier les mécanismes influencer l’absorption DA et DA communiqué simultanément, en améliorant notre compréhension des complexités du système striatal DA. Nous décrivons ici la procédure pour les tranches de cerveau frais-congelé et proposent des méthodes d’analyse de données pour différentes colorations : « point discret » ou « clusters ».

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Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par l’utilisation Comité (IACUC) à la University of South Carolina et animalier (numéro d’assurance fédérale : A3049-01).

1. préparation des Sections de cerveau congelé frais

1. Utiliser la souche de rat F344/N : trois rats de chaque sexe, 13 mois, poids environ 320 g.
2. Ajuster la concentration de sévoflurane à 5 % (surdose de sévoflurane). Continuer l’exposition sévoflurane après la respiration s’arrête pendant une minute supplémentaire.
3. Décapiter le rat et enlever le cerveau.
4. Submerger le cerveau de rat dans l’azote liquide pendant 15 s à 5 min de la récolte de tissus.
5. Equilibrer le cerveau à-20 ° C dans un cryostat pendant 1 h.
6. Coupes de 30 µm et transfert sur glissières (voir Table des matières).
7. Sélectionner les sections de la région du noyau accumbens, environ 2,76 mm à 2,28 mm antérieur Bregma¹⁴.
8. Trancher en permanence le cerveau de rat de bulbe olfactif à travers la région du noyau accumbens selon la structure du cerveau stéréotaxiques du rat.
9. Monter des échantillons sur les diapositives. Conserver les sections à-20 ° C pendant 10 minutes sécher.
10. Immerger immédiatement les lames dans le paraformaldéhyde préalablement réfrigérées de 4 % pendant 1 h à 4 ° C.
11. Déposer les lames dans un gradient croissant d’éthanol à température ambiante (RT) : 50 % EtOH pendant 5 min ; 70 % EtOH pendant 5 min ; et 100 % EtOH pendant 5 min.
12. Répéter avec frais 100 % EtOH.
13. Placer les lames sur du papier absorbant et sécher à l’air.
14. Dessiner une barrière autour de chaque section avec un stylo de la barrière (voir Table des matières). Laissez la barrière sécher complètement pendant 1 min.

2. un pré-traitement des Sections du cerveau

1. Allumez le four et réglez la température à 40 ° C.
2. Ajouter 3 gouttes (90 µL) de réactif de prétraitement 4 (voir la Table des matières) sur chaque section du cerveau (une section par lame).
3. Incuber les sections pendant 30 min à température ambiante.
4. Submerger les diapositives en 1 x PBS PDT 1 min à RT. Repeat avec frais 1 x PBS.
   Remarque : Les diapositives ne devraient pas rester dans du PBS 1 x pendant plus de 15 min.

3. ARN In Situ hybridation fluorescente essai Multiplex

1. Réchauffer la sonde de la cible pendant 10 min à 40 ° C dans un bain-marie et laisser refroidir puis RT.
2. Placez le réactif RNA (p. ex., Amp FL 1-4) à température ambiante.
3. Retirer le liquide en excès de diapositives avec du papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
4. Ajouter 3 gouttes (90 µL) de la sonde Drd1α (C1) sur la tranche de l’échantillon. Incuber pendant 2 h à 40 ° C.
5. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 minutes à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
6. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
7. Ajouter 3 gouttes (90 µL) d’Amp 1-FL sur la tranche de l’échantillon. Incuber 30 min à 40 ° C.
8. Submerger les diapositives dans le tampon de 1 lavage pendant 2 min à RT. Repeat avec tampon de 1wash frais.
9. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
10. Ajouter 3 gouttes (90 µL) d’Amp 2-FL sur la tranche de l’échantillon. Incuber pendant 15 min à 40 ° C.
11. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 minutes à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
12. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
13. Ajouter 3 gouttes (90 µL) d’Amp 3-FL sur la tranche de l’échantillon. Incuber 30 min à 40 ° C.
14. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 min à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
15. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
16. Ajouter 3 gouttes (90 µL) de l’Amp 4-FL-Alt A sur la tranche de l’échantillon. Incuber pendant 15 min à 40 ° C.
17. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 minutes à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
18. Retirer le liquide en excès de diapositives et de placer immédiatement 2 gouttes de réactif de montage (voir Table des matières) sur chaque section.
19. Placez une lamelle de 22 mm 22 mm (voir Table des matières) sur chaque section du cerveau.
20. Conserver les diapositives dans l’obscurité entre 2 et 8 ° C jusqu'à sec.
21. Allumez le microscope confocal et passer à un objectif de X 60.
22. Obtenir des images de Z-pile avec un microscope confocal. Voir la vidéo supplémentaire pour une procédure détaillée d’imagerie confocale.
23. Acquisition d’images de Drd1α marqué des cellules dans la région du noyau accumbens (Excitation : 488 nm ; Emission : 515/30 nm).
    Remarque : Ne pas laisser le cerveau sections sécher entre les étapes d’incubation.

4. analyse des données

1. Semi-quantitativement analyser le modèle de coloration : « points discrets ».
   1. Pour identifier la cellule individuelle de l’image, effectuer la coloration DAPI comme marqueur nucléaire. Toutefois, il est toujours difficile d’analyser certaines parties du tissu cérébral, car il a plusieurs types de cellules avec une forme irrégulière de noyaux ou de cellules. Ici, deux chercheurs expérimentés assigner séparément chaque cellule d’images pour définir la zone de cellules.
   2. Le score visuellement chaque cellule dans les images confocales représentatifs basé sur le nombre de points par la cellule à l’aide de critères précis (Figure 1 b).
   3. Déterminer le nombre total de cellules dans chaque catégorie et diviser par le nombre total de cellules x100 pour créer des graphiques de fréquence relative qui affichent la fréquence pourcentage des cellules au sein de chaque catégorie pour toutes les coupes de tissus (Figure 2 a) et pour les hommes et les femmes séparément (Figure 2E).
   4. Diviser la somme des cellules dans toutes les catégories précédentes par le nombre total de cellules x100 pour déterminer la fréquence cumulée des cellules pour toutes les coupes de tissus (Figure 2 b) et pour les hommes et les femmes séparément (Figure 2F).
2. D’analyser statistiquement les « points discrets » coloration motif (facultatif).
   1. Examiner le nombre de points par la cellule pour fournir une variable catégorique qui est ordinale en nature (c'est-à-dire, le nombre de cellules qui entrent dans chaque grade de plus faible expression de cellule (1) à la plus haute expression de la cellule (9)) pour approfondir les analyses statistiques.
   2. Après examen des statistiques descriptives, utilisez trois approches principales : une statistique de Mantel-Haenszel, un test U de Mann-Whitney et un test de Kruskal-Wallis. Bien que l’approche statistique précis sera dépendant de la question de conception et de la recherche expérimentale d’intérêt, un arbre de décision statistique (Figure 4) peut aider à prendre des décisions au sujet de son approche analytique.
3. Quantifier l’intensité du signal dans la région d’intérêt (ROI) pour le modèle de marquage : « clusters ».
   1. Calculer l’intensité du signal de chaque image à l’aide de l’équation suivante :
      Intensité du signal = intensité totale de l’image ROI - (fond moyenne intensité × Total image zone)
   2. Compter le nombre total de cellules au sein de l’image ROI pour calculer l’expression signal approximative par cellule. Les différences de groupe dans l’intensité du signal/image ainsi que le nombre de cellules/image peuvent être intéressant d’examiner les mécanismes qui peuvent contribuer à des différences de groupe chez signal expression/cellule (Figure 3 b-3D).
4. D’analyser statistiquement les « clusters » coloration motif (facultatif).
   1. Examinons l’expression signal/cellule afin de fournir une variable continue pour une analyse statistique plus poussée. Utiliser deux approches, y compris un échantillon indépendant t-test et analyse de variance (ANOVA), basé sur le nombre de facteurs inter-sujets incluses dans la conception. Un arbre de décision statistique (Figure 4) peut aider à prendre des décisions concernant l’approche statistique la plus appropriée.

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Résultats

La présente étude a observé une « points discrets » modèle pour l’expression de RNA dans les récepteurs de la dopamine D1-alpha (Drd1α) de marquage du CNA rats F344/N (Figure 1 a). Signaux de fluorescence individuels ont été facilement identifiés et peuvent être considérées comme simples « points », qui représentent chacune un seul transcrit dans la cellule. Pour les images du CNA qui affichent les « points discrets » modèle de mar...

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Discussion

Dans le présent protocole, les auteurs décrivent une nouvelle technique d’hybridation in situ pour des tranches de cerveau frais congelé afin d’évaluer l’expression des récepteurs Drd1α dans le noyau accumbens (NAc) et expression de tyrosine hydroxylase (TH) dans la région de la substantia nigra (SNR). Nous fournissons également des méthodes d’analyse de données pour différentes colorations : « point discret » ou « clusters ».

Les étapes essentielles pour ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HybEZ Oven system	Advanced Cell Diagnostics	310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1a	Advanced Cell Diagnostics	317031	Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2	Advanced Cell Diagnostics	314651-C2	Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit	Advanced Cell Diagnostics	320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratory	H-4000
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
4% paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack	Fisher Scientific	NC9837976
Tissue-Tek staining dish	Fisher Scientific	NC0731403
Precision General Purpose Baths	ThermoFisher Scientific	TSGP28
Pretreatment 4	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent	Life Technologies	P36930
Amp 1-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
Amp 2-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
Amp 3-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
Amp 4-FL-Alt A	Advanced Cell Diagnostics	320850	parts of kits
EZ-C1 software package	Nikon Instruments		version 3.81b
SAS/STAT Software	SAS Institute, Inc.,		version 9.4