التقييم السريري بيواكتيفيتي OT48 الكومارين السرطان الماغنيسيوم وفحوصات تشكيل مستعمرة، وتكثيفها الزرد

Summary

وهنا، نقدم الفحص السريري من السرطان كومارينس استخدام الثقافة 3D والزرد.

Abstract

فحص ما قبل السريرية في المختبر و في فيفو من العوامل العلاجية الرواية أداة أساسية في اكتشاف الأدوية السرطان. على الرغم من أن خطوط خلايا السرطان البشرية تستجيب للمركبات العلاجية في 2D أحادي الطبقة (الأبعاد) خلية الثقافات، وضعت نظم الثقافة 3D لفهم مدى فعالية العقاقير في النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. في السنوات الأخيرة، لوحظ تحولاً نموذجياً في البحوث السريرية قبل التحقق من فاعلية الجزيئات الجديدة في نظم الثقافة 3D، ومحاكاة أكثر دقة وورم المكروية. هذه الأنظمة تميز حالة المرض بطريقة أكثر فسيولوجيا ذات صلة وتساعد على اكتساب أفضل آليا إلى المعرفة والفهم للفاعلية الدوائية لجزيء معين. وعلاوة على ذلك، ومع الاتجاه الحالي في تحسين نماذج السرطان في فيفو ، برز الزرد فقاريات نموذجا هاما لتقييم في فيفو تشكيل الورم ودراسة أثر العوامل العلاجية. هنا، نحن التحقيق في الفعالية العلاجية هيدروكسيكومارين OT48 وحدها أو في تركيبة مع mimetics BH3 في خط خلية سرطان الرئة A549 باستخدام ثلاثة نظم الثقافة 3D مختلفة بما في ذلك فحوصات تشكيل مستعمرة (CFA)، كروي تشكيل المقايسة (SFA) و في فيفو تكثيفها الزرد.

Introduction

سرطان ناجم عن الطفرات الخلوية، ونتيجة لذلك تتعطل مسارات الإشارات البيوكيميائية تسبب في انقسام الخلايا غير المنضبط والمقاومة لموت الخلايا. أورام تتداخل مع الوظائف الفسيولوجية لنظم الدورة الدموية، الجهاز الهضمي والجهاز العصبي، و الأنسجة المجاورة في وقت لاحق¹. وعلى الرغم من الجهود البحثية واسعة النطاق، يظل السرطان أمراض تهدد الحياة الأكثر انتشارا في العالم². اعترف الطب الدقيقة كأساس لعلاجات السرطان مستقبلا. الكيانات الجزيئية الجديدة يتم اختبارها بشكل روتيني في تركيبة مع العقاقير الموجودة لتحسين النتائج السريرية.

ومع ذلك، أحد القيود الهامة المرتبطة بتطوير علاجات جديدة تستهدف كفاءة هو فشل الاختبارات المستخدمة عادة لمحاكاة نتائج البيولوجية الدقيقة للمخدرات التعرض³. اكتشاف المخدرات السرطان لا يزال معظمها يعتمد على اختبار فعالية العوامل العلاجية في خطوط خلايا السرطان المستزرعة في 2D أحادي الطبقة الثقافات، مما يصعب من التحقق من صحة في التجارب السريرية⁴. ولذلك، هناك اهتمام متزايد بتطوير نماذج سرطان أفضل تقليد أفضل الميزات الأصلية للأورام في فيفو⁵. في السنوات الأخيرة، أدى اهتمام متزايد في نماذج الثقافة 3D تطوير المنهجيات المحسنة لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد الورم⁵.

نقدم هنا، هو نهج مع ثلاث تقنيات استزراع خلية 3D مختلفة مما يسمح بتحسين فهم فاعلية هيدروكسيكومارين OT48⁶ في تركيبة مع mimetics BH3 قبل أكثر في العمق في فيفو فحوصات. يتكون لدينا طريقة للجمع بين مستعمرة وسفاس مع فيفو ورم تشكيل اختبار استناداً إلى نموذج الزرد لمواصلة التحقق من فعالية الجمع بين mimetics OT48 و BH3 في خلايا سرطان الرئة، ورصد تطور السرطان في العيش الكائن الحي.

وتستخدم بشكل روتيني فحوصات تشكيل مستعمرة لتقييم فعالية عوامل السرطان للسرطان سواء الصلبة وكذلك المكونة للدم. الإنزيم يحدد قدرة خلية تتكاثر إلى أجل غير مسمى وتشكيل المستعمرات⁷. أثر عامل السرطان على المستعمرة تشكل قدرة الخلايا يتحدد بخفض عدد و/أو حجم المستعمرات.

تمثل نماذج في المختبر الورم الماغنيسيوم وتكون بمثابة منصة فحص منخفضة التكلفة لوكلاء السرطان. الماغنيسيوم مجاميع خلايا تنمو في تعليق أو مضمن في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. وهذا النهج يستخدم على نطاق واسع لفحص المخدرات ودراسات للورم النمو والانتشار والمناعة التفاعل⁸.

لفهم خصائص دواء جديد تماما، من الضروري إجراء تجارب في فيفو على القوارض. ومع ذلك، هذه الطريقة التقليدية مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. وفي السنوات الأخيرة، أصبح الزرد (دانيو rerio) كائن مختبر دراسة على نطاق واسع هو أرخص وأسرع لرفع. تطوير أورام في نهج الثقافة الخلية تمثل 3D الزرد ولكن ضمن الإعداد في فيفو من الفقاريات⁹.

بالإجمال، نحن نستخدم هنا ثلاثة نهج ثقافة 3D مختلفة منها الماليين وسفاس الزرد في فيفو تشكيل الورم لإثبات قدرة السرطان هيدروكسيكومارين OT48 في نموذج خلية A549 سرطان الرئة في تركيبة مع BH3 mimetics.

Protocol

1-مستعمرة تشكيل فحوصات

1. خلايا A549 الثقافة في تركيز من 20,000 خلايا/سم² في 15 مل RPMI1640 الخلية المتوسطة الثقافة تستكمل مع 10% FBS (الجنين المصل البقري) والمضادات الحيوية % 1 في قارورة² 75 سم في حاضنة₂ CO في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
2. في يوم التجربة، تحديد تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير. جمع الخلايا 50,000 بالطرد المركزي في 400 x ز لمدة 7 دقائق في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتعليق إعادة الخلايا في 100 ميليلتر من 1 x العقيمة PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) في أنابيب 1.5 مل.
3. الاستغناء عن 1.1 مل من شبه الصلبة المتوسطة المستندة إلى ميثيلسيلولوسي (مكبم) في أنابيب 15 مل مع مولتيبيبيتي. إعداد أنبوب واحد لكل حالة.
4. إضافة 110 ميليلتر من FBS إلى 1.1 مل مكبم باستخدام ميكروبيبيتي P200.
5. خلايا البذور في 1,000 خلايا/مل. جمع 2.4 ميليلتر من تعليق خلية من الحل الأسهم (الخلايا 50,000 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x) استخدام ميكروبيبيتي P2، وإضافة إلى 1.1 مل مكبم وتستكمل مع 10% FBS.
6. بعد إضافة الخلايا، دوامة الأنابيب ل 1 دقيقة، عقد منها عمودياً على أعلى سرعة لمزج الخلايا ومكبم جيدا.
7. إضافة اختبار المركبات (OT48 وحدها أو في تركيبة مع A1210477). إعداد أنبوب منفصلة كعنصر تحكم للمذيبات المستخدمة (هنا ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])). اعتماداً على تركيز المركبات وحجم المضافة لكل شرط، ستشمل مراقبة المذيبات أعلى تركيز للمذيبات المستخدمة لتخفيف اختبار المركب، لتقييم الآثار الضارة الناجمة عن المذيبات.
8. دوامة الأنابيب لمدة 1 دقيقة.
9. لكل فحص، إضافة 1 مل المخلوط مع ميكروبيبيتي P1000 إلى مركز لوحة الثقافة الخلية 12-جيدا جيدا.
10. سد الآبار فارغة مع 1 مل الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني x 1 لتحقيق الاستقرار في الرطوبة.
11. احتضان ثقافة لوحات لمدة 10 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
12. وبعد 10 أيام حضانة، إضافة 200 ميليلتر محلول الأسهم (بروميد ميثيلثيازوليلديفينيل-تيترازوليوم) MTT (5 ملغ/مل) لكل بئر للوصول إلى نهائي بتركيز 1 ملغ/مل.
13. احتضان 10 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. سوف تتحول المستعمرات قابلة للحياة البنفسجي.
14. التقاط الصور باستخدام كاميرا رقمية باستخدام لوحة خلفية بيضاء (لاس ديا الأبيض صينية). استخدم الإعدادات التالية: الأسلوب، رقمنة؛ نوع التعرض، والدقة؛ زمن التعرض للضوء، دليل، 1 ثانية؛ حساسية/القرار، عالية الدقة. حفظ الصورة في تنسيق tiff.
15. التحديد الكمي للمستعمرات قابلة للتطبيق باستخدام برنامج إيماجيج. اختر القائمة "صورة | نوع | 8 بت ". اختر القائمة "ضبط | عتبة ". تعيين العتبة إلى السيطرة وتبقى ثابتة لجميع الظروف؛ اختر القائمة "تحليل | تحليل الجزيئات ". حفظ البيانات وتحليلها باستخدام برنامج الإحصاء لتمثيل رسومي.

2-كروي تكوين الإنزيم

1. خلايا A549 الثقافة في تركيز من 20,000 خلايا/سم² في 75 سم² قوارير مع 15 مل متوسط RPMI 1640 تستكمل مع المضادات الحيوية FBS و 1% 10%.
2. في يوم التجربة، تعد من 96 جيدا U-أسفل لوحة.
3. لوحة 10,000 الخلايا في بئر الذي يحتوي بالفعل على مجمع الفائدة (هنا 50 ميكرون من OT48) و/أو 20 ميكرون من A1210477. ضبط الحجم النهائي إلى 100 ميليلتر من مستنبت الخلية. عدد الخلايا التي تشكل الماغنيسيوم موحدة مع حد خارجي سليمة يعتبر كافياً الماغنيسيوم النموذج.
4. احتضان لمدة 3 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية وفي شركة 5%₂.
5. بعد 3 أيام حضانة، التقاط صور الماغنيسيوم استخدام مجهر خفيفة مع 4 x التكبير.

3-الزرد Xenograft الإنزيم

ملاحظة: هو تصور هذا النهج التقني تخطيطي (الشكل 1).

1. إعداد الكواشف الأسهم
   1. تحضير 1 لتر 30 × الحل دانيو: 1740 مم كلوريد الصوديوم و 21 مم بوكل، 12 مم MgSO₄∙7H₂س، 18 ملم Ca (لا₃)₂و 150 مم هيبيس. ضبط لدرجة الحموضة من المخزن المؤقت إلى 7.6 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
   2. إعداد 1% (50 س) تريكيني الحل: حل 20 ملغ من إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (تريكيني) في 2 مل ماء المقطر.
   3. تحضير محلول الفينول الحمراء-برنامج تلفزيوني 1%: إضافة 2 ميليلتر الفينول الأحمر الصوديوم الملح حل ميليلتر 198 الحل برنامج تلفزيوني معقمة في أنبوب 1.5 ميليلتر.
   4. إعداد methylcellulose 3%: إضافة الجيل الثالث 3g ميثيلسيلولوسي إلى 100 مل 1 × الحل دانو.
2. إنتاج البيض الزرد والحضانة
   1. أنثى واحدة منفصلة وواحد الزرد الذكور في خزان قسم مليئة بماء الصنبور تعقيم الأشعة فوق البنفسجية والتي تمت تصفيتها في 28.5 درجة مئوية في الظلام. بعد 24 ساعة من انتهاء الخدمة، مزيج من الأسماك من كلا الجنسين لبدء التزاوج. نقل البويضات المخصبة من خزان التزاوج إلى طبق بتري يحتوي على 5 مل من محلول الطازجة دانو.
   2. أغسل البيض ثلاث مرات مع 5 مل من محلول في دانيو. بعناية للغسيل، نضح البيض مع ماصة ونقل إلى 5 مل من محلول الطازجة. احتضانها ح 8 عند 28.5 درجة مئوية.
      1. بعد 8 ح الحضانة في حل دانو، تغيير إلى دانو في محلول يحتوي على 0.03% 1-فينيل-2-ال (PTU) تمنع التصبغ. فرز البيض غير شفاف (المخصبة أو تحتوي على أجنة متخلفة) لمنع التلوث.
3. ديتشوريونيشن الجنين
   1. ح 24 وظيفة التسميد (hpf)، ديتشوريوناتي الزرد الأجنة باستخدام الملقط حادة. تبني الأجنة الفقس في حل دانو مع 0.03% PTU في 28.5 درجة مئوية حتى 48 هبف.
4. إعداد الخلايا المعالجة بالمجمع
   1. خلايا A549 البذور 20,000 خلايا/سم² في قوارير الثقافة² 25 سم. بعد 24 ساعة من البذر، إضافة مركبات (OT48 هنا في 50 ميكرومتر وو/أو A1210477 في 20 ميكرومتر) ح 24 في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. إعداد وقت المعالجة لكل مجمع للحفاظ على سلامة الخلايا ولكن الالتزام بها تجاه موت الخلية. هذا الوقت احتياجات النقطة التي ستنشأ على حدة استناداً إلى جدوى خلية ومورفولوجيا والمؤشرات الجزيئية.
   2. 2 ح قبل نهاية العلاج، صبغ الخلايا وصمة عار مع 4 ميكرومتر لتعقب خلية الفلورسنت ديل سم في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. بعد 2 ساعة حضانة، تريبسينيزي الخلايا التي تحتوي على 0.05% التربسين-يدتا، وتمييع 10⁶ خلايا في 50 ميليلتر من حل الفينول الحمراء-برنامج تلفزيوني قبل الحقن.
5. الصغير-حقن الخلايا السرطانية لتشكيل إكسينوجرافت
   1. تخدير الزرد في حل تريكيني 0.02 في المائة لمدة 5 دقائق حتى أنها تستقر على صفيحة أجار.
   2. سحب من 1.0 مم (خارج القطر (OD) الزجاج الشعرية) بساحبة ميكروبيبيتي (إعدادات البرنامج: p: 300، والحرارة: 260، سحب: 60، حطي: 50، والوقت: 200). قص ميكروكابيلاري مع حقنه لإنتاج على حافة حادة. تحميل ميكروكابيلاريس مع 20 ميليلتر من خلية/الفينول الأحمر-حل برنامج تلفزيوني. تعيين ضغط الحقن، وحان الوقت للاستغناء عن 2 nL للحقنة.
   3. حقن الخلايا 100-200 كيس ألمح بالحقن 6 إلى 10 nL عن طريق الحقن 3 إلى 5. بعد الحقن، تسمح للأسماك لاسترداد لمدة 10 إلى 30 دقيقة في 5 مل الطازجة دانو الحل الذي يتضمن الحل PTU. إرسال الأسماك في لوحات 24-جيدا مع 1 مل من محلول دانو ليحتوي على حل PTU واحتضانها ح 72 في 28.5 درجة مئوية.
   4. بعد 72 ساعة حضانة، تخدير الأسماك في حل تريكيني 0.02% وشل على شريحة زجاجية مع قطره ميثيلسيلولوسي 3%. تأخذ 5 x صور بالميكروسكوب fluorescence في موجه من 620 إلى 750 نانومتر.
   5. التحديد الكمي لحجم الأورام الفلورسنت بالبرمجيات إيماجيج. اختر القائمة "تحليل | التدبير ". حفظ القيم المقابلة لإشارة الفلورسنت وتحليلها باستخدام برنامج الإحصاء لتمثيل رسومي.

النتائج

في الشكل 2، سرطان الرئة الخلية خط A549 كان المصنف في مكبم على شكل مستعمرات بعد العلاج مع OT48 وحدها أو في تركيبة مع A1210477 BH3 mimetic في تركيزات المشار إليه. وأظهرت النتائج أن التركيبة انخفاضا ملحوظا العدد والحجم والمساحة الكلية للمستعمرات بعد 10 أيام حضانة.

Discussion

معدلات تكوين مستعمرة الحصول عليها مع مكبم يعتمد على نوع الخلية. عادة، هو عدد المستعمرات للخلايا غير ملتصقة، أعلى بكثير مقارنة بالخلايا ملتصقة. ولاحظنا أن خلايا A549 شكلت مستعمرات 30 إلى 40 بعد 10 أيام. سابقا قد أبلغنا لخلايا اللوكيميا المختلفة أن عدد المستعمرات ما بين 200 إلى 250⁹. وأظ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials required for colony formation assays
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml tube	Hyundai Micro	H20015	RT
12 well plate	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230	-20 C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
Materials required for spheroid formation assay
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate	Corning	3474	RT
Microscopy	Nikon	Eclipse TS100	RT
Materials required for zebrafish xenografts
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T25	SPL	70025	RT
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
Cell culture flask T175	SPL	71175	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
24 well plate	SPL	30024	RT
Petridish	SPL	10100	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	71382	RT
Potassium chloride (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil dye	Invitrogen	C7001	-20 C°
Glass capillary	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipette puller	Shutter instrument, USA	P-97	RT
Micro injector	World Precision Instruments	PV820	RT
Syringe	KOVAX	1ml	RT
Micro loader	Eppendorf	5242956003	RT
Glass slide	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Fluorescence microscopy	Leica	DE/DM 5000B	RT