Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Özet

Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.

Özet

Roman terapötik ajanlar içinde in vitro ve in vivo önceden klinik tarama çoğu kanser ilaç keşif önemli bir araçtır. Her ne kadar insan kanser hücre hatları 2D (boyutlu) monolayer hücre kültürlerinde terapötik bileşiklerin yanıt, 3D kültür sistemleri daha fizyolojik ilgili modelleri ilaçların etkinliğini anlamak için geliştirilmiştir. Son yıllarda, daha doğrusu tümör microenvironment taklit eden 3D kültür sistemlerinde yeni moleküller potens doğrulamak için önceden klinik araştırma bir paradigma kayması gözlendi. Bu sistemler daha fizyolojik ilgili bir şekilde hastalık durumu karakterize ve daha iyi mekanik kavrama ve belirli bir molekül farmakolojik potens anlayış kazanmak için yardım. Ayrıca, in vivo kanser modelleri iyileştirilmesinde mevcut trendi ile zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu değerlendirmek ve terapötik ajanlar etkisini incelemek için önemli bir omurgalı model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, biz Hidroksikumarin OT48 tedavi edici etkinliği tek başına veya akciğer kanseri hücre kültürünü A549 BH3 mimetics ile birlikte koloni oluşumu deneyleri (CFA), küresel oluşumu tahlil (SFA) dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür sistemleri kullanarak araştırdık ve vivo zebra balığı xenografts.

Giriş

Kanser tarafından hücresel mutasyonlar neden olur ve sonuç olarak biyokimyasal sinyal yolları kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücre ölümü direnç tetikleyen bozdu. Tümörleri sindirim, sinir, dolaşım sistemi ve daha sonra komşu dokulara¹fizyolojik fonksiyonları müdahale. Kapsamlı bir araştırma, kanser dünya²' deki en yaygın hayatı tehdit eden hastalık imlere rağmen. Hassas tıp gelecekteki kanser tedavi temel olarak kabul edilmiştir. Yeni moleküler varlıklar klinik sonuç geliştirmek için mevcut uyuşturucu ile birlikte düzenli olarak test edilir.

Ancak, yeni verimli hedefli tedaviler gelişimi ile ilişkili önemli kısıtlamalar uyuşturucu pozlama³tam biyolojik sonucu benzetimini yapmak için yaygın olarak kullanılan deneyleri başarısızlığın biridir. Kanser ilaç keşif hala çoğunlukla terapötik ajanlar etkinliğinin klinik⁴' te doğrulamak zor olan 2D monolayer kültürde kültürlü kanser hücre hatlarında test dayanır. Bu nedenle, daha iyi taklit tümörler vivo içinde⁵yerel özelliklerini daha iyi kanser modelleri geliştirmek için büyüyen bir ilgi vardır. Son yıllarda, 3D kültür modelleri artan bir ilgi 3D tümör modelleri⁵üretmek için geliştirilmiş yöntemleri geliştirmede sonuçlandı.

Burada, bir yaklaşım içinde derinlik vivo deneyleri daha önce BH3 mimetics ile birlikte OT48⁶ Hidroksikumarin potens anlayış geliştirmek için izin üç farklı 3D hücre kültürü teknikleri ile mevcut. Daha fazla akciğer kanser hücrelerini OT48 ve BH3 mimetics arada etkinliğini doğrulamak ve kanser bir yaşam ilerlemesinde izlemek için bir zebra balığı modelini temel bir vivo içinde tümör oluşumu testi ile koloni ve SFAs birleştirerek bizim Yöntem oluşur organizma.

Koloni oluşumu deneyleri düzenli olarak hem katı hem de hematopoetik kanserler için antikanser ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Tahlil süresiz olarak çoğalırlar ve koloniler⁷oluşturmak için hücre yeteneğini belirler. Antikanser Ajan etkisi yetenek hücre oluşturan colony sayısı azalması ve/veya koloniler boyutunu tarafından belirlenir.

Pulcuklarının vitro tümör modelleri temsil ve antikanser maddeleri için bir düşük maliyetli tarama platform olarak hizmet. Pulcuklarının süspansiyon büyüyen hücresi ya da 3D dizey içinde gömülü. Bu yaklaşım yaygın uyuşturucu tarama ve tümör büyüme, yayılmasını önleme ve bağışıklık etkileşim⁸çalışmalar için kullanılır.

Tamamen yeni bir ilaç özelliklerini anlamak için in vivo deneyler kemirgenler üzerinde esastır. Ancak, geleneksel bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) daha ucuz ve daha hızlı yükseltmek için yaygın olarak okudu laboratuvar organizma oldu. Tümör zebra balığı temsil bir 3D hücre kültür yaklaşımda ama içinde vivo ayarındaki omurgalı⁹geliştirdi.

Tamamen, biz burada Hidroksikumarin OT48 BH3 mimetics ile birlikte bir akciğer kanseri A549 hücre modelindeki antikanser kapasitesini göstermek için CFAs, SFAs ve zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu da dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür yaklaşımları kullanın.

Protokol

1. koloni oluşumu deneyleri

1. Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm² RPMI1640 15 ml bir konsantrasyon, hücre kültürü 10 ile desteklenmiş orta % FBS (Fetal sığır Serum) ve CO₂ kuluçka CO₂37 ° C ve % 5, 75 cm² şişeye %1 antibiyotik.
2. Deneme günü, bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek. Santrifüjü 400 x g 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 7 min için de tarafından 50.000 hücreleri toplamak ve 1 x steril PBS (fosfat tamponlu tuz) 1,5 mL tüpler 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma.
3. 15 mL tüpler bir multipipette ile yarı katı methylcellulose tabanlı Orta (MCBM) 1.1 mL dağıtmak. Bir tüp her koşul için hazırlayın.
4. FBS 110 µL P200 micropipette kullanarak MCBM için 1.1 mL ekleyin.
5. 1000 hücre/mL, Tohum hücreleri. Hisse senedi çözüm (1 x PBS 100 µL 50.000 hücreleri) hücre süspansiyon, 2.4 µL toplamak bir P2 micropipette kullanarak ve MCBM % 10 ile desteklenmiş 1.1 mL için eklemek FBS.
6. Hücreleri, ekledikten sonra girdap tüpler için 1dk onları tutan dikey olarak en yüksek hızda MCBM ve hücreler iyice karıştırın.
7. Test bileşikler (OT48 tek başına veya birlikte A1210477 ile) ekleyin. Bir denetim olarak ayrı bir tüp hazırlamak için kullanılan çözücü (burada dimetil sülfoksit (DMSO)). Bileşikleri ve her koşul için eklenen hacim konsantrasyonu bağlı olarak, solvent denetim solvent testi bileşik, dilutions için çözücü tarafından kaynaklanan olumsuz etkileri için değerlendirmek için kullanılan en yüksek konsantrasyonu içerir.
8. Girdap tüpler 1 dakika.
9. Her tahlil için karışımı P1000 micropipette ile 1 mL merkezine de 12-şey hücre kültür plaka ekleyin.
10. Boş wells ile 1 mL steril su veya nem stabilize etmek için 1 x PBS doldurun.
11. Kültür plakaları bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂10 gün kuluçkaya.
12. Kuluçka, 10 gün sonra 200 µL MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromür) hisse senedi çözümünün (5 mg/mL) 1 mg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için her şey için ekleyin.
13. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂10 min kuluçkaya. Kalıcı koloniler dönecek violet.
14. Beyaz arka plan plaka (LAS beyaz dia tepsi) kullanarak bir dijital kamera ile çekim. Kullanma ertesi gün koyma: Yöntem, dijital ortama; Pozlama türü, hassas; Çekim hızı, el kitabı, 1 saniye; Hassasiyet/çözünürlük, yüksek çözünürlüklü. Resmi TIFF formatında kaydedin.
15. Kalıcı koloniler ImageJ yazılım kullanarak ölçmek. Seç menüsünü "görüntü | Türü | 8 bit". Seç menüsünü "ayarlama | Eşik". Eşik denetimine ayarlayın ve tüm koşulları için sabit tutmak; Seç menüsünü "Analyze | «««Analiz"parçacıkları. Verileri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.

2. küresel oluşumu tahlil

1. Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm² ' 75 cm² şişeler bir konsantrasyon ile 15 mL RPMI 1640 orta % 10 FBS ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiştir.
2. Deneme günü, 96 hazırlamak de U-alt plaka.
3. Bileşik faiz (OT48, burada 50 µM) ve/veya A1210477 20 µM içeren bir kuyuya plaka 10.000 hücre. Hücre kültür ortamının 100 µL için son ses düzeyini ayarlayın. Sağlam bir dış kenarlığı ile Tekdüzen pulcuklarının oluşturan hücreleri formu pulcuklarının için yeterli kabul edilir.
4. Bir kuluçka 37 ° C'de ve % 5 CO₂3 gün kuluçkaya.
5. Kuluçka 3 gün sonra 4 x büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak pulcuklarının görüntülerini yakalamak.

3. zebra balığı Xenograft tahlil

Not: Bu teknik yaklaşım bir şematik (Şekil 1) görüntülenir.

1. Hisse senedi reaktifler hazırlanması
   1. 30 Danieau'nın çözüm x 1 L hazırlamak: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO₄∙7H₂O, 18 mM Ca (NO₃)₂ve 150 mM HEPES. PH metre kullanarak 7,6 arabelleğe pH için ayarlayın.
   2. %1 (50 x) tricaine çözüm hazırlamak: 20 mg 2 mL distile su içinde etil 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) geçiyoruz.
   3. %1 fenol Red-PBS çözeltisi hazırlamak: fenol Red sodyum tuz solüsyonu 1,5 µL tüp içinde sterilize PBS çözümün 198 µL için Ekle 2 µL.
   4. %3 methylcellulose hazırlamak: 1 Danieau'nın çözüm x 100 ml methylcellulose 3 g ekleyin.
2. Zebra balığı yumurta üretimi ve kuluçka
   1. Ayrı bir kadın ve bir erkek zebra balığı bir bölüm tank karanlıkta 28.5 ° C'de UV sterilize ve filtre uygulanmış musluk suyu ile dolu. Ayrılık 24 saat sonra balık çiftleşme başlatmak için her iki cinsiyette karıştırın. Döllenmiş yumurta çiftleşme tankından 5 mL taze Danieau'nın çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
   2. Yumurta 3 kez 5 mL Danieau'nın çözeltisi ile yıkayın. Yıkama için dikkatle yumurta bir pipet ve 5 mL taze çözüm de aktarmak ile Aspire edin. 28.5 ° C'de 8 h için kuluçkaya
      1. Kuluçka Danieau'nın çözüm içinde 8 h sonra %0,03 1-fenil-2-Tioüre (pigmentasyon inhibe PTU) içeren Danieau'nın eriyik-e doğru değiştirmek. Kontaminasyonu önlemek için opak yumurta (döllenmemiş veya içeren gelişmemiş embriyo) sıralamak.
3. Embriyo dechorionation
   1. 24 saat sonrası döllenme (hpf), keskin forseps kullanarak dechorionate zebra balığı embriyo. Damızlık embriyo % 0.03 ile Danieau'nın çözümde kuluçkaya PTU 48 kadar 28.5 ° C'de hpf.
4. Bileşik tedavi hücre hazırlık
   1. Tohum A549 hücreleri 20.000 hücre/cm² 25 cm² kültür şişeler'de. Tohum 24 saat sonra bileşikler ekleyin (50 µM, burada OT48 ve ve/veya A1210477, 20 µM) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂24 h için. Tedavi süresi her bileşik için hücrelerin canlılık korumak için ama onları hücre ölüme doğru işlemek için ayarlayın. Bu sefer noktası ihtiyaçlarını tek tek ayarlamak için hücre canlılığı, Morfoloji ve moleküler işaretleyiciler dayalı.
   2. 2 h tedavi sonundan önce leke hücreleri floresan hücre izci 4 µM ile 37 ° C ve % 5 CO₂CM-Dil boya. 2 h, kuluçka sonra % 0.05 tripsin-EDTA içeren hücreleri trypsinize ve fenol Red-PBS çözüm enjeksiyon önce 50 µL 10⁶ hücrelerde sulandırmak.
5. Mikro-enjeksiyon xenograft oluşumu için kanser hücrelerinin
   1. Onlar bir agar plaka üzerinde sakinleşene kadar zebra balığı 5 min için %0,02 tricaine çözümünde anestezi.
   2. 1.0 mm (dış çapı (OD) cam kapiller) tarafından bir micropipette çektirmenin çekin (Program ayarları: P: 300, ısı: 260, çekin: 60, VEL: 50 ve Saat: 200). Microcapillary bir keskin kenar üretmek için bir şırınga ile kesti. Yük microcapillaries hücre/fenol Red 20 µL ile-PBS çözüm. Ayarla enjeksiyon basıncı ve 2 dağıtmak için zaman nL enjeksiyon başına.
   3. 100-200 hücreleri sarısı kesesi içine enjekte ederek 6 ila 10 tarafından enjekte nL 3-5 enjeksiyon yoluyla. Enjeksiyon sonra balık 10-30 dk için 5 mL taze Danieau'nın çözüm PTU solüsyon içeren kurtarmak izin. 1 mL PTU solüsyon içeren Danieau'nın çözeltisi ile 24-şey plakalar Merkez balık vardır ve 28.5 ° C'de 72 h için kuluçkaya
   4. 72 h, kuluçka sonra balık %0.02 tricaine çözümünde anestezi ve % 3 methylcellulose bir damla ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz. Bir dalga boyu 620-750, floresans mikroskobu tarafından 5 x fotoğraf çekmek nm.
   5. ImageJ yazılım tarafından floresan tümör boyutunu ölçmek. Seç menüsünü "Analyze | Ölçü birimi". Floresan sinyal karşılık gelen değerleri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.

Sonuçlar

Şekil 2' de, akciğer kanseri hücre satırı A549 MCBM içinde form kolonilere OT48 ile tedavi sonra tek başına veya birlikte belirtilen konsantrasyonlarda BH3 mimetic A1210477 ile seribaşı. Sonuçlar kasanın numarası, boyut ve kolonilerin toplam yüzey alanı kuluçka 10 gün sonra azaltılacağını olduğunu gösterdi.

Şekil 3' te A549 hücreleri ile OT48 te...

Tartışmalar

Koloni oluşumu MCBM ile elde edilen oranda hücre türüne bağlıdır. Genellikle, yapışık olmayan hücreler için koloni sayısı çok daha yüksek yapisan hücrelere karşılaştırılır. A549 hücreleri 10 gün sonra 30-40 kolonileri oluşturduğu görülmektedir. Daha önce farklı lösemi hücreleri için kolonileri sayısının 200-250⁹arasında olduğunu bildirdin. Sonuçlarımız OT48 yalnız kolonileri yalnız sayısı önemli bir azalma getirmedi gösterdi. Ancak, BH3 ile birlikte ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials required for colony formation assays
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml tube	Hyundai Micro	H20015	RT
12 well plate	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230	-20 C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
Materials required for spheroid formation assay
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate	Corning	3474	RT
Microscopy	Nikon	Eclipse TS100	RT
Materials required for zebrafish xenografts
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T25	SPL	70025	RT
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
Cell culture flask T175	SPL	71175	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
24 well plate	SPL	30024	RT
Petridish	SPL	10100	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	71382	RT
Potassium chloride (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil dye	Invitrogen	C7001	-20 C°
Glass capillary	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipette puller	Shutter instrument, USA	P-97	RT
Micro injector	World Precision Instruments	PV820	RT
Syringe	KOVAX	1ml	RT
Micro loader	Eppendorf	5242956003	RT
Glass slide	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Fluorescence microscopy	Leica	DE/DM 5000B	RT