Доклинические оценки отпорности противораковые кумарина OT48 сфероидов, колонии формирования анализов и ксенотрасплантатов данио рерио

Резюме

Здесь мы представляем доклинические скрининг противораковые кумарины, с использованием 3D культуры и данио рерио.

Аннотация

В пробирке и в естественных условиях доклинические скрининга новых терапевтических агентов являются важным инструментом обнаружения рака наркотиков. Хотя линий человеческих раковых клеток реагировать на терапевтические соединений в 2D (мерной) монослоя клеточных культур, чтобы понять эффективность препаратов в более физиологически соответствующих моделей были разработаны системы 3D культуры. В последние годы было отмечено парадигмы в доклинических исследованиях для проверки потенции новых молекул в 3D культуры системах, более точно имитирует микроокружения опухоли. Эти системы характеризуют состояние болезни более физиологически соответствующим образом и помочь получить более механистических постижения и понимания фармакологических потенции данной молекулы. Кроме того с текущей тенденцией в улучшении в естественных условиях модели рака, данио рерио стала важным позвоночных модель для оценки в естественных условиях образования опухоли и изучить влияние терапевтических агентов. Здесь, мы исследовали Терапевтическая эффективность hydroxycoumarin OT48 отдельно или в сочетании с BH3 mimetics в линии клеток рака легких A549 с помощью трех различных 3D культуры систем, включая колонии формирования анализов (CFA), сфероиде формирования пробирного (SFA) и в естественных условиях ксенотрасплантатов данио рерио.

Введение

Рак вызывается клеточных мутаций и как следствие биохимических сигнальные пути разрушаются, вызывая неконтролируемому делению клеток и устойчивость к смерти клетки. Опухоли мешают физиологических функций пищеварительной, нервной, сердечно-сосудистой систем и впоследствии соседних тканей¹. Несмотря на обширные исследования усилия рак остается наиболее распространенных опасных для жизни заболеваний в мире². Прецизионные медицины была признана как основа будущего рака терапии. Новых молекулярных структур регулярно тестируются в сочетании с существующих препаратов для улучшения клинических результатов.

Однако одним из значительных ограничений, связанных с развитием новой эффективной целевой терапии является неспособность часто используемых анализов для имитации итоги точные биологические воздействия наркотиков³. Обнаружение рака наркотиков по-прежнему главным образом опирается на тестирования эффективности терапевтических агентов в рак клеточных линий культивировали в 2D монослоя культур, которые трудно проверить в клинических испытаниях⁴. Таким образом существует растущий интерес для разработки лучше модели рака, которые лучше имитировать родной особенностей опухоли в vivo⁵. В последние годы растущий интерес к модели 3D культуры привело к разработке усовершенствованных методик производить 3D опухоли модели⁵.

Здесь мы представляем подход с тремя культуры различных 3D клеточные технологии, позволяющие улучшить понимание потенции hydroxycoumarin OT48⁶ в сочетании с mimetics BH3 раньше больше в глубину в vivo анализов. Наш метод состоит из сочетания колонии и ОТВС с в vivo опухоли формирования тест, основанный на zebrafish модель для дальнейшей проверки эффективности комбинации OT48 и BH3 mimetics в клетках рака легких и мониторинга прогрессии рака в живых организм.

Колонии формирования анализов обычно используются для оценки эффективности противоопухолевых агентов, как твердых, так и кроветворная рака. Assay определяет способность клетки размножаться бесконечно и формируют колонии⁷. Эффект противоопухолевых агентов на колонии, формирование способности клеток определяется снижение числа и/или размер колоний.

Сфероидов представляют в vitro модели опухоли и служить в качестве платформы лоу кост скрининга для противоопухолевых агентов. Сфероидов агрегаты клеток, растущих в суспензии или встроенные в матрице 3D. Такой подход широко используется для скрининга наркотиков и исследований опухолевого роста, распространение и иммунной взаимодействия⁸.

Чтобы полностью понять свойства нового препарата, важно проводить эксперименты в естественных условиях на грызунов. Однако этот обычных метод является дорогостоящим и трудоемким. В последние годы данио рерио (Danio рерио) стала широко изучены Лаборатория организма, что дешевле и быстрее, чтобы поднять. Опухоли разработан в подходе культура клеток представляют 3D данио рерио, но в рамках сотрудничества в vivo позвоночных⁹.

В общей сложности мы используем здесь три различных 3D культуры подходов, включая лигнин, ОТВС и данио рерио в естественных условиях образования опухоли продемонстрировать противоопухолевой потенциал hydroxycoumarin OT48 в легких Рак A549 клеток модели в сочетании с BH3 mimetics.

протокол

1. колонии формирования анализов

1. Культура клетки A549 в концентрации 20 000 клеток/см² в 15 мл RPMI1640 клетки питательной среды с 10% FBS (плода бычьим сывороточным) и 1% антибиотиков в колбе² 75 см в инкубатор CO₂ при 37 ° C и 5% CO₂.
2. В день эксперимента определения концентрации клеток с помощью Горяева. Собрать 50000 клетки центрифугированием при 400 x g 7 мин в пробки microcentrifuge 1,5 мл и вновь приостановить клетки в 100 мкл стерильные ПБС (фосфат буфер солевой) в 1,5 мл пробирок.
3. Отказаться от 1,1 мл полутвердых на основе метилцеллюлоза среды (MCBM) в 15 мл пробирок с multipipette. Подготовка одной трубки для каждого условия.
4. 110 мкл FBS, до 1,1 мл MCBM, с помощью микропипеткой P200.
5. Семена клетки на 1000 клеток/мл. Собирать 2.4 мкл суспензии клеток от Стоковый раствор (50 000 ячеек в 100 мкл ПБС) с использованием микропипеткой P2 и добавить в 1,1 мл MCBM, дополненный 10% FBS.
6. После добавления клетки, вихревой трубы за 1 мин, держа их вертикально на высокой скорости, чтобы перемешать MCBM и клетки.
7. Добавьте тест соединений (OT48 самостоятельно или в комбинации с A1210477). Подготовить отдельную трубу как элемент управления для использованного растворителя (здесь диметилсульфоксида (ДМСО)). В зависимости от концентрации соединений и объем, добавлены для каждого условия растворителей управления будет включать в себя самую высокую концентрацию растворителя используется для разбавления тест соединения, для оценки неблагоприятных последствий, вызванных растворителя.
8. Вихревой трубы на 1 минуту.
9. Для калибровочных добавьте 1 мл смеси с P1000 микропипеткой центр хорошо плиты культуры 12-ну клеток.
10. Заполните пустой скважин с 1 мл стерильной воды или 1 x PBS для стабилизации влажности.
11. Инкубируйте культуры пластин на 10 дней в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂.
12. После 10 дней инкубации добавьте 200 мкл раствора MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium бромид) штока (5 мг/мл) в каждой скважине до конечной концентрации 1 мг/мл.
13. Инкубируйте 10 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂. Жизнеспособных колоний превратит фиолетовый.
14. Захват изображения с цифровой камеры с использованием белом фоне пластины (LAS белый dia лоток). Используйте следующие параметры: метод, оцифровки; Выдержка тип, точность; Время экспозиции, руководство, 1 секунда; Чувствительность/резолюции, высоким разрешением. Сохраните изображение в формате tiff.
15. Количественно жизнеспособных колоний с помощью ImageJ программного обеспечения. Выберите меню «изображение | Тип | 8 bit». Выберите меню «настройки | Порог». Установить порог для контроля и поддержания постоянной для всех условий; Выберите меню «Анализ | Анализ частиц». Сохранить данные и анализировать с помощью статистики программного обеспечения для графического представления.

2. сфероида формирования Assay

1. Культура клетки A549 в концентрации 20 000 клеток/см² в 75 см² фляги с 15 мл среды RPMI 1640 с 10% FBS и 1% антибиотиков.
2. В день эксперимента, подготовить 96 хорошо U-днище.
3. Пластина 10 000 ячеек в колодец, который уже содержит соединение интереса (здесь 50 мкм OT48) или 20 мкм A1210477. Окончательного громкость до 100 мкл клеток питательной среды. Количество ячеек, которые образуют единый сфероидов с нетронутыми внешняя граница считается достаточным для формы сфероидов.
4. Инкубируйте 3 дней в инкубаторе при 37 ° C и на 5% CO₂.
5. После 3 дней инкубации захвата изображения с использованием световой микроскоп с увеличением 4 x сфероидов.

3. данио рерио ксенотрансплантата Assay

Примечание: Этот технический подход визуализируется как схема (рис. 1).

1. Подготовка запасов реагентов
   1. Подготовка 1 Л 30 x Danieau в решение: 1740 мм NaCl, 21 мм KCl, 12 мм MgSO₄∙7H₂O, 18 мм Ca (№₃)₂и 150 мм HEPES. Приспособиться к pH буфера с помощью рН метр 7.6.
   2. Приготовляют раствор 1% (50 x) tricaine: растворяют 20 мг этиловый метансульфонат 3-аминобензоат (tricaine) в 2 мл дистиллированной воды.
   3. Подготовка 1% раствор фенола Красного PBS: добавить 2 мкл соли раствора фенола Красного натрия до 198 мкл стерилизованные PBS раствора в трубу 1,5 мкл.
   4. Подготовка 3% метилцеллюлоза: добавить 3 g метилцеллюлоза до 100 мл 1 x Danieau в раствор.
2. Данио рерио производство яиц и инкубации
   1. Отдельные одна женщина и один мужчина данио рерио в раздел танк заполнены с УФ стерилизации и фильтрованной водопроводной водой в 28,5 ° C в темноте. После 24 ч разделения смесь рыбы обоих полов начать спаривания. Передавать оплодотворенные яйца от спаривания танк чашку Петри, содержащий 5 мл свежего Danieau раствора.
   2. Мыть яйца три раза с 5 мл раствора в Danieau. Для стирки, тщательно аспирационная яйца с пипеткой и передачи в 5 мл свежего раствора. Инкубируйте 8 h на 28,5 ° C.
      1. После 8 ч инкубации в Danieau и решение измените Danieau в раствор, содержащий 0,03% 1-фенил-2-тиомочевины (PTU) для подавления пигментации. Сортировать непрозрачный яйца (неоплодотворенные или содержащих неразвитой эмбрионов) для предотвращения загрязнения.
3. Dechorionation эмбрионов
   1. 24 h пост оплодотворение (hpf), dechorionate zebrafish эмбриона, используя острые щипцы. Инкубировать штриховкой эмбрионов в Danieau в растворе с 0,03% ПТУ на 28,5 ° C до 48 hpf.
4. Подготовка комплекса лечение клетки
   1. Семя A549 клеток на 20 000 клеток/см² в 25 см² культуры колбы. После 24 часов посева, добавить соединений (здесь OT48 на 50 мкм и или A1210477 на 20 мкм) для 24 h в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂. Настроить время лечения для каждого соединения для поддержания жизнеспособности клеток, но совершить их к смерти клетки. На этот раз точка должен быть индивидуально настроить основанные на жизнеспособность клеток, морфология и молекулярных маркеров.
   2. 2 ч до конца лечения, пятно клетки с 4 мкм люминесцентные клеток трекер красителя CM-Дил при 37 ° C и 5% CO₂. После 2 ч инкубации trypsinize клетки с 0,05% трипсина ЭДТА и развести 10⁶ клеток в 50 мкл раствора фенола Красного PBS до инъекции.
5. Микро инъекции клеток рака для формирования ксенотрансплантата
   1. Анестезировать данио рерио в 0,02% раствора tricaine за 5 мин до тех пор, пока они располагаются на плите агар.
   2. Тянуть 1,0 мм (вне диаметра (OD) стеклянный капилляр) съемник микропипеткой (настройки программы: P: 300, жара: 260, тянуть: 60, VEL: 50 и время: 200). Вырежьте микрокапиллярной с помощью шприца для образоваться острые края. Загрузить microcapillaries с 20 мкл клеток/фенола Красного-PBS решения. Установить давление впрыска и время отказаться от 2 nL на инъекцию.
   3. Придать желточного мешка 100 – 200 клеток путем инъекций 6-10 nL через 3-5 инъекций. После инъекции позволяют рыбы для восстановления для 10-30 мин в 5 мл свежего Danieau раствора, содержащего решение ПТУ. Диспетчеризации рыбы в 24-ну пластины с 1 мл раствора Danieau в раствор, содержащий ПТУ решения являются и инкубировать в течение 72 часов при 28,5 ° C.
   4. После 72 ч инкубации анестезировать рыбы в tricaine раствор 0,02% и иммобилизации на слайде стекла с капелькой метилцеллюлоза 3%. Возьмите фотографии 5 x по микроскопии флуоресцирования на длине волны 620 до 750 Нм.
   5. Определить размер флуоресцентные опухоли ImageJ программного обеспечения. Выберите меню «Анализ | Мера». Сохраните значения, соответствующие флуоресцентного сигнала и анализировать с помощью статистики программного обеспечения для графического представления.

Результаты

Рисунок 2рака легкого ячейки линия, которую A549 был посеян в MCBM форме колоний после лечения с OT48 отдельно или в сочетании с BH3 подражательный A1210477 в указанных концентрациях. Результаты показали, что сочетание значительно сократить число, размер и площадь...

Обсуждение

Темпы формирования колонии, полученные с MCBM, зависит от типа ячейки. Обычно для non сторонник клеток, количество колоний гораздо выше по сравнению с адэрентных клеток. Мы наблюдали, что клетки A549 образуется 30-40 колоний после 10 дней. Ранее мы сообщили для различных лейкозных клеток, что кол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials required for colony formation assays
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml tube	Hyundai Micro	H20015	RT
12 well plate	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230	-20 C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
Materials required for spheroid formation assay
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate	Corning	3474	RT
Microscopy	Nikon	Eclipse TS100	RT
Materials required for zebrafish xenografts
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T25	SPL	70025	RT
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
Cell culture flask T175	SPL	71175	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
24 well plate	SPL	30024	RT
Petridish	SPL	10100	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	71382	RT
Potassium chloride (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil dye	Invitrogen	C7001	-20 C°
Glass capillary	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipette puller	Shutter instrument, USA	P-97	RT
Micro injector	World Precision Instruments	PV820	RT
Syringe	KOVAX	1ml	RT
Micro loader	Eppendorf	5242956003	RT
Glass slide	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Fluorescence microscopy	Leica	DE/DM 5000B	RT