Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

요약

여기, 선물이 3D 문화와 제 브라를 사용 하 여 항 암 제 coumarins의 전 임상 심사.

초록

생체 외에서 그리고 vivo에서 새로운 치료제의 전 임상 심사 암 약물 발견에 필수적인 도구입니다. 비록 인간의 암 세포 선 2 차원 (차원) 단층 세포 배양에서 치료 화합물에 대응, 더 순수 관련 모델에서 약물의 효능을 이해 하 3 차원 배양 시스템 개발 되었다. 최근 몇 년 동안, 패러다임의 변화는 3D 문화 시스템, 더 정확 하 게 종양 microenvironment를 흉내 낸 새로운 분자의 힘을 확인 하기 위해 전 임상 연구에서 관찰 되었다. 이러한 시스템 보다 생리 적으로 관련 된 방식으로 질병 상태를 특성화 하 고 더 나은 기계적 통찰력 및 주어진된 분자의 약리 효능을 이해 하는 데 도움이. 또한, 암 모델 vivo에서 개선 추세와 함께 zebrafish vivo에서 종양의 형성을 평가 하 고 치료제의 효과 연구 하는 중요 한 척추 모델로 떠오르고 있다. 여기, 우리 조사 hydroxycoumarin OT48의 치료 효능 하거나 폐 암 세포 라인 A549 BH3 mimetics와 함께 식민지 대형 분석 실험 (CFA), 회전 타원 체 형성 분석 결과 (SFA) 등 세 가지 다른 3D 문화 시스템을 사용 하 여 및 zebrafish xenografts vivo에서 .

서문

암은 세포 돌연변이 의해 발생 하 고 결과적으로 생 화 확 적인 신호 경로 통제 세포 분열 및 세포 죽음에 저항을 트리거링 혼란 된다. 종양 소화, 신경, 순환 시스템 및 이후에 이웃 조직¹의 생리 기능을 방해합니다. 광범위 한 연구 노력에도 불구 하 고 암²세계 가장 널리 퍼진 생명이 질병에 남아 있다. 정밀 의학 미래 암 치료의 기초로 인식 하고있다. 임상 결과 개선 하기 위해 기존 약물과 함께에서 새로운 분자 엔티티를 정기적으로 테스트 합니다.

그러나, 새로운 효율적인 표적으로 한 치료의 개발과 관련 된 중요 한 제한 중 약물 노출³의 정확한 생물 학적 결과 시뮬레이션 하기 위해 일반적으로 사용 되는 분석의 실패 이다. 암 약물 발견 여전히 대부분 암 세포 선에서⁴임상 시험 확인 하기 어려운 차원 단층 문화에서 교양 치료제의 효능을 테스트에 의존 합니다. 따라서, 더 나은 종양 vivo에서⁵의 기본 기능을 모방 하는 더 나은 암 모델을 개발 하는 관심이 있다. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 모델에 증가 관심 3D 종양 모델⁵생산 향상된 방법론의 개발에 결과.

여기, 우리는 깊이 비보에 분석 실험에 함께 더 전에 BH3 mimetics hydroxycoumarin OT48⁶ 의 힘의 이해를 향상 시킬 수 있도록 세 개의 다른 3D 셀 문화 기술로 접근을 제시. 우리의 방법은 식민지 및 SFAs는 vivo에서 종양 형성에 따라 검사 추가 폐 암 세포에서 OT48 및 BH3 mimetics의 조합의 효능을 확인 하 고 생활에서 암 진행 모니터링 zebrafish 모델에 결합의 구성 유기 체입니다.

식민지 대형 분석 실험 정기적으로 모두 고체 뿐만 아니라 조 혈 암에 대 한 항 암 제의 효능을 평가 하는 데 사용 됩니다. 분석 결과 무한정 증식 하 고 식민지⁷을 형성 하는 세포의 능력을 결정 합니다. 셀의 능력을 형성 하는 식민지에는 항 암 제의 효과 수의 감소 및 식민지의 크기에 의해 결정 됩니다.

Spheroids 종양 모델 생체 외에서 나타내고 제 에이전트는 저가 심사 플랫폼 역할. Spheroids는에 성장 하는 셀의 집계 또는 3D 매트릭스에 포함 된. 이 접근은 마약 검사 및 종양 성장, 확산 및 면역 상호 작용⁸의 연구에 널리 사용 됩니다.

완전히 새로운 약물의 속성 이해, vivo에서 실험 설치류에 필수적 이다. 그러나,이 전통적인 메서드는 비용과 시간이 소요 됩니다. 최근 몇 년 동안, zebrafish (Danio rerio) 널리 공부 실험실 유기 체를 저렴 하 고 빠르게 인상 되었다. 종양은 zebrafish 대표 3D 셀 문화 접근에서 하지만 척추⁹의 vivo에서 설정 내에서 개발.

전부, 사용 여기 CFAs, SFAs zebrafish vivo에서 종양 형성 등 3 가지 3D 문화 접근 BH3 mimetics 함께에서 폐 암 A549 세포 모델에서 hydroxycoumarin OT48의 항 암 제 용량을 설명 합니다.

프로토콜

1. 식민지 대형 분석 실험

1. 20000 셀/cm² RPMI1640의 15 ml에서의 농도에서 문화 A549 세포 세포 배양 10 보충 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 37 ° C, 5% CO₂CO₂ 배양 기에서 75 c m² 플라스 크에 1% 항생제.
2. 실험의 날에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 7 분 400 x g 에서 원심 분리 하 여 50, 000 셀을 수집 하 고 다시 1 x 살 균 PBS (인산 염 버퍼) 1.5 mL 튜브에의 100 µ L에서 세포를 일시 중단.
3. multipipette와 함께 15 mL 튜브에서 반 고체 스 기반 매체 (MCBM)의 1.1 mL을 분배. 각 조건에 대 한 튜브를 준비 합니다.
4. P200 micropipette를 사용 하 여 MCBM의 1.1 ml FBS의 110 µ L를 추가 합니다.
5. 1, 000 셀/mL에서 씨앗 셀입니다. 재고 솔루션 (50000 셀 1 x PBS의 100 µ L)에서 2.4 µ L 세포 현 탁 액의 수집 P2 micropipette 사용 하 고 10% 보충 하는 MCBM의 1.1 mL에 추가 FBS.
6. 셀, 추가한 후 소용돌이 MCBM와 셀을 잘 혼합 하 최고 속도로 그들을 수직으로 잡고 1 분에 대 한 관.
7. 테스트 화합물 (OT48 혼자 또는 조합에서 A1210477으로)을 추가 합니다. 제어로 별도 튜브 준비 용 매 사용에 대 한 (여기 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)). 각 조건에 대 한 추가 볼륨과 화합물의 농도 따라 용 컨트롤 용 매 화합물, 테스트의 희석에 대 한 사용 하는 용 매로 인 한 부작용에 대 한 평가의 가장 높은 농도 포함 됩니다.
8. 1 분 동안 소용돌이 튜브.
9. 각 분석 결과 대 한 12 음 셀 문화 접시의 센터 P1000 micropipette와 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.
10. 살 균 물의 1 mL와 함께 빈 우물 또는 습도 안정 시키기 위해 1 x PBS를 채우십시오.
11. 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 10 일 동안 배양 배지를 품 어.
12. 10 일 후 부 화, 각 잘 1 mg/mL의 최종 농도 도달 하는 MTT (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium 브 로마 이드) 재고 솔루션 (5 mg/mL)의 200 µ L를 추가 합니다.
13. 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 10 분을 품 어. 실행 가능한 식민지 바뀝니다 바이올렛.
14. 흰색 배경 플레이트 (라스 화이트 디 아 트레이)를 사용 하 여 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오. 다음 설정을 사용 합니다: 방법, 디지털화; 노출 유형, 정밀; 노출 시간, 수동, 1 초; 감도/해상도, 높은 해상도입니다. Tiff 형식에 이미지를 저장 합니다.
15. ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 가능한 식민지를 계량. 선택 메뉴 "이미지 | 유형 | 8 비트 "입니다. 선택 메뉴 "조정 | 임계값 "입니다. 제어 임계값을 설정 하 고 모든 조건;에 대 한 일정 하 게 유지 선택 메뉴 "분석 | 입자 분석 ". 데이터를 저장 하 고 그래픽 표현에 대 한 통계 소프트웨어와 분석.

2. 회전 타원 체 형성 분석 결과

1. 10 %FBS 1% 항생제로 보충 RPMI 1640 매체의 15 mL와 75 c m² 플라스 크에 20000 셀/c m² 의 농도에 문화 A549 세포.
2. 실험 당일 준비는 96 U-바닥판 잘.
3. 이미 관심 (여기 50 µ M OT48) 및 A1210477의 20 µ M의 화합물을 포함 하는 우물으로 접시 10, 000 셀입니다. 세포 배양의 100 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 그대로 외부 경계와 균일 한 spheroids를 형성 하는 세포의 수는 양식 spheroids에 적절 한 간주 됩니다.
4. 37 ° C, 5% CO₂에 인큐베이터에서 3 일 동안 품 어.
5. 3 일 후 부 화, 4 x 확대와 함께 가벼운 현미경을 사용 하 여 spheroids의 이미지를 캡처하십시오.

3. 제 브라가 종이 식 분석 결과

참고:이 기술 접근 회로도 (그림 1)으로 시각 이다.

1. 재고 시 약의 준비
   1. Danieau의 솔루션 x 30의 1 리터를 준비: 1740 mM NaCl, 21 m KCl m, 12 mM MgSO₄∙7H₂O, 18 m m Ca (₃)₂및 150 mM HEPES. 7.6 pH 미터를 사용 하 여 버퍼의 pH를 조정 합니다.
   2. 1% (50 x) tricaine 솔루션 준비: 20mg 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) 2 mL의 증류수에 녹.
   3. 1% 페 놀 레드-PBS 솔루션 준비: 198 µ L의 1.5 µ L 튜브의 소독된 PBS 솔루션 들을 페 놀 레드 나트륨 소금 솔루션의 추가 2 µ L.
   4. 3% 스 준비: Danieau의 솔루션 x 1의 100 mL에 스의 3 세대를 추가.
2. Zebrafish 계란 생산 및 부 화
   1. 별도 한 여성 및 파티션 탱크에 한 남성 zebrafish 어둠 속에서 28.5 ° C에서 UV 살 균 및 필터링 된 수돗물으로 가득합니다. 분리의 24 h 후 물고기 짝짓기를 시작 하는 두 남녀의 혼합. 짝짓기 탱크의 수정 된 난 자 신선한 Danieau 솔루션의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 전송.
   2. 세 번 Danieau의 솔루션의 5 mL와 함께 계란을 세척. 세척, 피 펫 및 신선한 솔루션의 5 mL에 계란을 발음 신중 하 게. 8 h 28.5 ° c.에 대 한 품 어
      1. Danieau의 솔루션에 외피의 8 h 후 0.03 %1-페 닐-2-thiourea 착 색을 억제 (PTU)를 포함 하는 Danieau의 솔루션을 변경 합니다. 오염을 방지 하기 위해 불투명 계란 (unfertilized 또는 포함 미 개발된 태아) 밖으로 정렬.
3. 태아 dechorionation
   1. 24 시간 수정 (hpf), dechorionate zebrafish 태아 날카로운 집게를 사용 하 여 게시할 수 있습니다. 0.03 %Danieau 솔루션에서 해칭 태아를 품 어 48까지 28.5 ° C에서 통해 hpf.
4. 복합 치료 세포 준비
   1. 20000 셀/cm² 25 cm² 문화 플라스 크 씨 A549 세포. 뿌리기의 24 h 후 추가 화합물 (50 µ M에서 여기 OT48 및 또는 20 µ M에서 A1210477) 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 24 h에 대 한. 하지만 세포 죽음으로 그들을 저지 하는 세포의 생존 능력을 유지 하기 위해 각 화합물에 대 한 치료 시간을 설정 합니다. 이 시간은 개별적으로 설정 해야 포인트 기준 세포 생존 능력, 형태학 및 분자 마커.
   2. 치료의 끝 전에 2 h, 얼룩 세포 형광 셀 추적기의 4 µ M로 37 ° C, 5% CO₂CM Dil 염료. 외피의 2 시간 후 0.05% 트립 신-EDTA, 셀 trypsinize 그리고 10⁶ 세포 주입 전에 페 놀 레드-PBS 솔루션의 50 µ L 희석.
5. 이 종이 식 형성에 대 한 암 세포의 마이크로 주입
   1. 그들은 한 접시에 정착 될 때까지 5 분 0.02 %tricaine 솔루션에서 zebrafish를 anesthetize.
   2. (외부 직경 (OD) 유리 모 세관) 1.0 m m는 micropipette 끌어당기는 당겨 (설정 프로그램: p: 300, 열: 260, 당겨: 60, 벨: 50, 및 시간: 200). 주사기는 날카로운 가장자리를 생산 하는 microcapillary를 잘라. 로드 셀/페 놀 레드의 20 µ L 함께 microcapillaries-PBS 솔루션. 사출 압력을 설정 하 고 하는 걸 2 시간 주입 당 nL.
   3. 주사 6 ~ 10 여 른 골목에 100-200 셀 주사 3 ~ 5 주사 통해 nL. 주입 후 물고기를 통해 솔루션을 포함 하는 신선한 Danieau 솔루션의 5 mL에 10 ~ 30 분에 대 한 복구할 수 있습니다. 디스패치 통해 솔루션을 포함 하는 Danieau의 솔루션의 1 mL 24-잘 접시에는 생선과 28.5 ° c.에서 72 h에 대 한 품 어
   4. 외피의 72 h 후 물고기 0.02 %tricaine 솔루션에서 anesthetize 고 스 3%의 하락을 가진 유리 슬라이드에 고정. 620 750의 파장에서 형광 현미경 검사 법에 의해 5 x 사진을 찍어 nm.
   5. ImageJ 소프트웨어에 의해 형광 종양의 크기를 계량. 선택 메뉴 "분석 | 측정 "입니다. 형광 신호에 해당 하는 값을 저장 하 고 그래픽 표현에 대 한 통계 소프트웨어와 분석.

결과

그림 2, 폐암 A549 했다 시드 MCBM에서 식민지를 형성 하 OT48와 치료 후 또는 표시 농도에서 BH3 모방 A1210477와 선 세포. 결과 조합 크게 감소 번호, 크기 및 식민지의 총 면적 외피의 10 일 후에 나타났다.

그림 3에서는 A549 세포 BH3 모방 A1210477와 혼자 또는 조합에서 OT48로 치료 했다 고 양?...

토론

MCBM으로 얻은 식민지 형성의 속도 셀 형식에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 비 부착 한 세포에 대 한 식민지의 수는 부착 세포에 비해 훨씬 높은. 우리가 관찰 A549 세포 10 일 후 30 ~ 40 식민지를 형성 했다. 이전 우리 보고 다른 백혈병 세포에 대 한 식민지의 수 200 ~ 250⁹사이입니다. 우리의 결과 OT48 혼자 혼자 식민지의 수의 상당한 감소를 생성 하지 않았다 보여주었다. 그러나, BH3 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials required for colony formation assays
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml tube	Hyundai Micro	H20015	RT
12 well plate	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230	-20 C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
Materials required for spheroid formation assay
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate	Corning	3474	RT
Microscopy	Nikon	Eclipse TS100	RT
Materials required for zebrafish xenografts
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicillin-streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Cell culture flask T25	SPL	70025	RT
Cell culture flask T75	SPL	70075	RT
Cell culture flask T175	SPL	71175	RT
1.5ml tube	Extragene	Tube-170-C	RT
24 well plate	SPL	30024	RT
Petridish	SPL	10100	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	71382	RT
Potassium chloride (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil dye	Invitrogen	C7001	-20 C°
Glass capillary	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipette puller	Shutter instrument, USA	P-97	RT
Micro injector	World Precision Instruments	PV820	RT
Syringe	KOVAX	1ml	RT
Micro loader	Eppendorf	5242956003	RT
Glass slide	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Fluorescence microscopy	Leica	DE/DM 5000B	RT