حقن نانوحبيبات ريترودوكتال للغدة اللهاة مورين

Summary

إيصال الأدوية المحلية الغدد اللهاة من الفائدة في فهم بيولوجيا الغدة اللعابية وتطوير علاجات جديدة. نقدم بروتوكولا حقن ريترودوكتال محدثة ومفصلة، تهدف إلى تحسين دقة التسليم وإمكانية تكرار نتائج تجريبية. تطبيق المقدمة في هذه الوثيقة هو تقديم الجسيمات النانوية البوليمرية.

Abstract

اثنين من الأهداف المشتركة للمداواة الغدة اللعابية هي الوقاية والعلاج من خلل الأنسجة بعد أما المناعة الذاتية أو ضرر الإشعاع. بتسليم المركبات الحيوية النشطة محلياً الغدد اللعابية، يمكن تحقيق تركيزات الأنسجة أكبر بأمان مقابل الإدارة النظامية. وعلاوة على ذلك، قبالة النسيج المستهدف الحد من الآثار من خارج غدي تراكم المواد يمكن جذريا. وفي هذا الصدد، حقن ريترودوكتال الطريقة مستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في الغدة اللعابية البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية. لقد ثبت الإدارة ريترودوكتال لعوامل النمو والخلايا الأولية وناقلات أدينوفيرال والأدوية جزيء صغير لدعم وظيفة الغدة في الإعداد للإصابة. وقد أظهرنا سابقا فعالية استراتيجية نانوحبيبات-siRNA ريترودوكتالي حقن للحفاظ على وظيفة الغدة بعد التشعيع. هنا، هو مفصل طريقة فعالة للغاية واستنساخه لإدارة المواد النانوية للغدة اللهاة مورين من خلال مجرى الهواء في وارتون (الشكل 1). تصف الوصول إلى تجويف الفم، وتحدد الخطوات اللازمة للقناة كانولاتي وارتون، مع مزيد من الملاحظات تخدم كالتحقق من جودة طوال فترة الإجراءات.

Introduction

وقد خلل الغدة اللعابية مسببات عديدة، بما في ذلك المتلازمة في سيورغن، فقدان المناعة الذاتية وساطة الأنسجة الافرازية الوظيفية، والإشعاع الناجم عن هيبوساليفيشن (هيام)، سكولا مشتركة للرأس والرقبة السرطان العلاج الإشعاعي¹. فقدان وظيفة اللعاب بسبب أما الشرط عند الأفراد للإصابة الفموية والجهازية وتسوس الأسنان، والخلل في الجهاز الهضمي والبلع، والنطق والاكتئاب الكبرى^1،،من²³. كنتيجة لذلك، إلى حد كبير يعاني نوعية الحياة، مع تدخلات محدودة للتخفيف من الأعراض بدلاً من علاج⁴. للتحقيق في رواية العلاجات في فيفو، الاهتمام بإدارة المركبات النشطة بيولوجيا مباشرة الغدة اللعابية.

حقن ريترودوكتال وسيلة قيمة لتوصيل المركبات النشطة بيولوجيا مباشرة إلى الغدد اللعابية واختبار الفعالية في المرض والإصابة، أو في إطار التوازن أنسجة طبيعية. الغدد اللعابية الرئيسية الثلاثة هي النكفية (PG) واللهاة (SMG)، وتحت اللسان (SLG)، كل من فيها فارغة في تجويف الفم من خلال القنوات مطرح. تشريح الفاري إس أم جي تصاريح الوصول المباشر من خلال كانوليشن للقناة في وارتون، الموجودة في أرضية الفم تحت اللسان⁵. وبعد كانوليشن، ومذاوبة المخدرات يمكن أن تدار مباشرة إلى إس أم جي. في أعقاب تسليم ريترودوكتال، مقيد نشرها خارج غدي بالكبسولة الأنسجة المحيطة بها التي تنظم تبادل المواد مع المحيطة بهياكل⁶. إس أم جي وفي مجرى الهواء هي منظم على نحو مماثل في البشر، ويتم الوصول إليها بشكل روتيني أثناء الجراحة وسيالوندوسكوبي إس أم جي⁷. في البشر والفئران، جزء من الغرام بالمثل يمكن الوصول إليها عبر مجرى الهواء في ستينسين في الغشاء المخاطي الشدقى⁸.

في نماذج هيام مورين، استخدمت حقن ريترودوكتال إس أم جي لتقديم العلاجات بما في ذلك عوامل النمو والخلايا الأولية، ناقلات أدينوفيرال، السيتوكينات، والمركبات المضادة للأكسدة تعدل الاستجابة الخلوية للإصابة، وتقليل ما يترتب على ذلك الأنسجة الضرر^{5،9،10،11،12،13،14،،}من¹⁵¹⁶. ويعد نجاح السريرية أبرز حقن ريترودوكتال إدارة ناقلات أدينوفيرال مباشرة التعبير عن قناة المياه (Aquaporin 1؛ AQP1) في المرضى بعد بالإشعاع ل سرطان الرأس والرقبة¹⁷.

سابقا، لدينا نمواً وأظهرت نجاعة نظام siRNA نانوحبيبات البوليمرية ريترودوكتالي حقن لحماية وظيفة الغدة اللعابية من هيام^11،18،،من¹⁹²⁰. وكامتداد لعملنا الماضية، هنا، نظهر لدينا بروتوكول لحقن SMG ريترودوكتال استخدام نانوحبيبات مسمى فلوريسسينتلي (NP) قادرة على تحميل وإيصال خلاف ذلك ضعيفة الذوبان المخدرات^{2221،، 23}.

أننا قد المركبة NP من كوبوليمر ديبلوك تتألف من بولي (ستايرين-alt-هيدرازيد anhydride)-b-poly(styrene) (بسمة) من خلال إضافة عكسها سلسلة التجزئة (الطوافة) البلمرة، كما هو موضح سابقا²¹. من خلال تبادل المذيبات، هذه البوليمرات عفويا ذاتيا تجميع في الهياكل التي أرستها مذيل مع مسعور الداخلية وماء خارجي²¹. تتم تسمية مصادر القدرة النووية مع فلوروفوري الأحمر تكساس للسماح بتحقق التسليم التي أرستها في الغدد دون التضحية بالحيوان. يعيش تصوير الحيوان ويظهر SMG immunohistochemistry في ح 1 و 1 يوم بعد الحقن.

هذا تحديث واستنساخه cannulation البروتوكول ينبغي أن تمكن الآخرين من أجل تحقيق حقن ريترودوكتال. ونحن نتوقع أن يصبح هذا الأسلوب المكرر عاملاً حاسما في فيفو الدراسات والتنمية العلاجية^24،25.

Protocol

كافة في فيفو الإجراءات المبينة أدناه بموافقة "اللجنة الجامعة" على "الموارد الحيوانية" في جامعة روتشستر، روتشستر، نيويورك.

1-إعداد

1. استخدام أنابيب القسطرة داخل الجمجمة ز 32 مع اقحم الأسلاك، قطع 3 سم الأنابيب لتشكيل حد مشطوب الحواف، حوالي 45 درجة على محور طويل. التأكد من أن السلك أطول من الأنبوب 1 سم على الأقل.
2. تحميل 50 ميليلتر من بسمة نانوحبيبات الحل (الشكل 1)، أو حقن مواد أخرى، في محقن هاملتون. لتقليل احتمالية الرضح الضغطي أثناء الحقن، إرفاق أنابيب القسطرة، مع ستيليت إزالتها، للمحاقن وطرد حجم القتلى.
3. فحص الحل الحقن لضمان نانوحبيبات تماما ومذاوبة لمنع انسداد الأقنية بعد الإدارة.
4. تحضير محلول الأتروبين عند 0.1 مغ/مل.
   ملاحظة: نظراً لأن الأتروبين هي حساسة للضوء، ويحط على مر الزمن، هذا الحل ينبغي ي يوم الحقن، ومحمية من الضوء حتى تدار.

2-الوصول إلى وتصور نقطة دخول الأقنية

1. وزن فئران C57/BL6 استخدام رصيد التحليلي.
2. استخدام المحاقن 0.5 مل مع 29 x ½ "إبرة، تخدير الفئران مع إينترابيريتونيلي حقن المحلول الملحي عقيمة من 100 مغ/كغ xylazine الكيتامين و 10 مغ/كغ. للانتقال إلى الخطوة التالية عند الماوس لم يعد يستجيب للمنبهات، الذي يحدث عادة في غضون 5 إلى 10 دقيقة بعد الحقن.
   ملاحظة: هذا الإجراء أيضا يمكن أداؤها تحت إيسوفلوراني، ولكن سيتطلب مخروط الآنف مخصصة التي تسمح بالوصول إلى تجويف الفم.
3. لمنع حدوث جفاف أثناء الإجراء، تطبيق مواد التشحيم للعيون ووضع الماوس في موقف معرضة في مرحلة مخصصة.
   ملاحظة: للحفاظ على الظروف الملائمة للإجراء داخل الفم، أدوات ينبغي تطهيرها أو تعقيمها قبل كل استعمال.
4. فتح تجويف الفم بتأمين القواطع فكي علوي عبر شعاع معدنية، واستخدام عصابة مرنة لتطبيق التوتر النزولي خلف القواطع الفك السفلي (الشكل 2A).
5. قم بمحاذاة الماوس تحت مجهر تشريح أن هو تصور قاعدة الفك.
6. لتوسيع الفم، واستخدام مخصصة، منحنى ضام الصلب لتطبيق التوتر على الصعيد الثنائي للغشاء المخاطي الشدقى.
7. تصور الحليمات اللهاة، فهم ورفع اللسان بلطف من الكلمة الفم باستخدام الملقط حادة.
   ملاحظة: سوف تظهر نتوءات كنتوءات باهتة اثنين تحت اللسان (الشكل 2).
8. للتخفيف من التصور ومزيد من التلاعب داخل تجويف الفم، ضع القطن بين اللسان والغشاء المخاطي الشدقى.

3-الأقنية Cannulation وموضع الخط

1. استخدام غرامة، فهم الملقط المنحنية، أنابيب القسطرة مع اقحم الأسلاك. للتحكم اليدوي الأمثل أثناء كانوليشن، محاذاة الأنبوب مع انحناء الملقط (الشكل 3A).
2. باستخدام مجهر تشريح، نقل الملقط وسلك في مجال الرؤية.
   ملاحظة: ينبغي أن بروز السلك من الأنبوب.
3. الضغط برفق في قاعدة واحدة الحليمة اللهاة باستخدام الأسلاك اقحم لإنتاج ثقب صغير، وسطحية، والأغشية المخاطية (0.076 مم) الذي سيسهل دخول لاحق من أنابيب القسطرة (0.25 مم). إذا تم مصادفة المقاومة، قص نصائح مشطوف جديدة في كل من أنابيب وأسلاك اقحم مع مقص تشريح حاد.
4. عقب الدخول، سحب ستيليت، واستخدام مجهر تشريح، تأكيد وجود اللعاب في موقع الثقب. تجنب حركة قوية أو مفاجئة (أما الانسحاب أو الإدراج) من ستيليت قد يسبب نزيفا أو تعرض للخطر سلامة الأقنية.
5. التراجع عن ستيليت داخل الأنابيب (الشكل 3B).
6. للتأكد من أن أنابيب الحقن سوف تدخل في مجرى الهواء وارتون لفتح، إدراج الأنابيب التي تحتوي على ستيليت كدليل جامدة في ثقب تم إجراؤه من قبل (الشكل 2 ج).
   ملاحظة: إذا لم تنجز بسرعة، قد تمنع تورم المحلية إعادة الإدراج.
7. لمنع الضغط الخلفي من انسداد الأقنية المطول، سحب الأنبوب. فحص للتأكد من أن فتحه، تظهر تحت المجهر، يتبين في الحليمة اللهاة. في حالة حدوث نزيف مرئية، إزالة ستيليت وريتيمبت من الخطوة 3.2 في الحليمات اللهاة المتعارضة.
8. دون تحريك الماوس، إدارة الحقن داخل حل الأتروبين 1 مغ/كغ، لتقليل اللعاب أثناء الإجراء. انتظر 5-10 دقيقة.
9. فهم نهاية الأنبوب المحاقن، وإدراج في فتحه استخدام مجهر تشريح (الشكل 3). إذا تم مصادفة المقاومة، قطع حد مشطوب الحواف طازجة إلى الأنبوب ويتم.
10. مرة واحدة الأنابيب في مكان داخل الحليمة اللهاة، ببطء التقدم 3-5 ملم في القناة. الإفراج عن الأنبوب من الملقط.
11. تحسين الختم بين الأنبوب والحليمة اللهاة، جاف الواجهة من النشاف برفق مع الشاش لمدة 1 دقيقة.
12. فحص للتأكد من أن وضع الأنابيب لا تحول أثناء التجفيف.

4-حقن

1. حقن المواد بمعدل 10 ميليلتر/دقيقة فحص للتأكد من أن الماوس لا يزال مخدراً ولا تظهر عليه بوادر للشدة (الشكل 2D).
   ملاحظة: يتم أيضا التسامح مع حقن من 15-50 ميليلتر. يمكن أن يؤدي الحقن بكميات أكبر في الرضح الضغطي.
2. وبعد الحقن، الحفاظ على ضغط حقنه لمدة 5 دقائق لتحسين الاحتفاظ بالمواد داخل مجرى الهواء في وارتون و SMG (الشكل 4). فحص الحليمة اللهاة بشكل دوري التأكد من أن الأنابيب عدم الخروج من الفوهة الأقنية.
3. استخدام الملقط غرامة، فهم وسحب الأنبوب بلطف من الحليمات اللهاة.
   ملاحظة: من الطبيعي أن نلاحظ بعض خروج السائل من الحليمات.
4. إزالة ضام والقطن من تجويف الفم قبل تحريك الماوس من المرحلة.
   ملاحظة: هذا الحيوان لا ينبغي أن تترك غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن الماوس لا يقع مع الفئران الأخرى حتى شُفي تماما.

5-التحقق والتحليل

ملاحظة: في فيفو نظام التصوير (إيفيس) يمكن أن تستخدم لتقييم الاحتفاظ بجسيمات نانوية المسمى فلوريسسينتلي بعد الحقن (كما هو مبين ح 1 و 24 ساعة بعد الحقن في الشكل 5).

1. أفضل تصور إشارة مضيئة داخل إس أم جي عن طريق الجلد، إزالة الفراء البطني تغمر جيه أما بالحلاقة أو استخدام مزيل الشعر كيميائية.
   ملاحظة: في أعقاب القتل الرحيم، SMG الأنسجة يمكن أيضا أن تحصد ثابتة (بين عشية وضحاها في بارافورمالدهيد 4 ٪) والملون باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري للتأكد من استمرار وجود NP المسمى فلوريسسينتلي يوم واحد عقب الحقن (الشكل 6).

النتائج

يمكن استخدام حقن ريترودوكتال لإدارة مصادر القدرة النووية إلى SMG مورين (الشكل 1). هنا، نحن نقدم 50 ميكروغرام "بسمة لأمان" المسمى مع فلوروفوري "الأحمر تكساس".

يسمح الموضع الصحيح للماوس سهلة الوصول والتصور للكلمة الفم (

Discussion

حقن ريترودوكتال أمر حاسم لإيصال الأدوية مترجمة إلى الغدة اللعابية. هذا الأسلوب له تطبيقات في فحص العوامل العلاجية للشروط بما في ذلك متلازمة شيغرن وهيام^9،10،28. إيصال الأدوية مباشرة إلى إس أم جي عن طريق الحقن ريترودوكتال يوفر ميزة رئيسية عل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pilocarpine hydrochloride	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-9	Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline Solution	Medline	RDI30296H	Saline
Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Curved Forceps
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Straight Forceps
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12	Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes	Fisher Scientific	22362566	Capillary tubes
Lubricant Eye Ointment	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	Statistical Software
Cotton tipped applicator	Medline	MDS202000	Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"	BD	7629	Syringe for intraperitoneal injection