Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Zusammenfassung

Lokalen Drug-Delivery, die submandibulären Drüsen ist Interesse an Verständnis Speicheldrüse Biologie und für die Entwicklung neuer Therapeutika. Wir präsentieren Ihnen eine aktualisierte und detaillierte Retroductal Injektion Protokoll, entworfen, um Lieferung Genauigkeit und experimentelle Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die enthaltenen Anwendung ist die Lieferung von Polymeren Nanopartikel.

Zusammenfassung

Zwei gemeinsame Ziele der Speicheldrüse Therapeutika sind Vorbeugung und Heilung von Gewebe Dysfunktion nach entweder autoimmune oder Strahlung Verletzung. Durch die Bereitstellung von bioaktiver Verbindungen, die lokal auf die Speicheldrüsen, können mehr Gewebe Konzentrationen sicher im Vergleich zu systemischen Verabreichung erreicht werden. Darüber hinaus können Effekte aus extra glanduläre Anhäufung von Material aus Zielgewebe drastisch reduziert werden. In diesem Zusammenhang ist Retroductal Injektion eine weit verbreitete Methode für die Untersuchung von Speicheldrüse Biologie und Pathophysiologie. Retroductal Gabe von Wachstumsfaktoren, Primärzellen, adenovirale Vektoren und niedermolekulare Medikamente hat sich gezeigt, zur Unterstützung der Drüse Funktion in der Umgebung der Verletzung. Wir haben zuvor gezeigt, die Wirksamkeit einer Retroductally eingespritzt Nanopartikel-SiRNA Strategie zur Drüse Funktion nach Bestrahlung aufrecht zu erhalten. Hier ist eine sehr effektive und reproduzierbare Methode Nanomaterialien an der murinen mandibulären Drüse durch Wharton Leitung Verwaltung detailliert (Abbildung 1). Wir beschreiben den Zugriff auf die Mundhöhle und die notwendigen Schritte zur cannulate Wharton gelegt werden, mit weiteren Beobachtungen dienen als Qualitätskontrollen während des Verfahrens zu skizzieren.

Einleitung

Speicheldrüse Dysfunktion hat viele Ursachen, einschließlich Sjögren Syndrom, eine Autoimmun vermittelte Verlust von sekretorischen Funktionsgewebe und Strahlung induzierte endodontischen (RIH), eine gemeinsame Sequella von Kopf und Nacken Krebs Strahlentherapie¹. Speichel Funktionsverlust aufgrund entweder Bedingung prädisponiert zu mündlichen und systemische Infektion, Karies, Verdauungs- und schlucken Dysfunktion, Sprachstörungen und schweren Depressionen^1,2,3Personen. Infolgedessen leidet der Lebensqualität erheblich, mit Interventionen zur Linderung der Symptome, anstatt Heilung⁴begrenzt. Um neuartige Therapien in Vivozu untersuchen, ist es von Interesse, bioaktive Verbindungen, die direkt auf die Speicheldrüse zu verwalten.

Retroductal Injektion ist eine wertvolle Methode, um liefern bioaktive Verbindungen direkt an die Speicheldrüsen und die Wirksamkeit zu testen, bei Krankheit, Verletzung, oder unter normalem Gewebe Homöostase. Die drei großen Speicheldrüsen sind der Parotis (PG), der mandibulären (SMG) und der Sublingual (SLG), alle welche leer in die Mundhöhle durch Ausscheidungsorgane Kanäle. Die Anatomie der Murine SMG ermöglicht direkten Zugang durch Kanülierung der Wharton Kanal, befindet sich in dem Boden der Mundhöhle unter der Zunge⁵. Anschluss an die Kanülierung SOLVATISIERTE Drogen kann direkt an die SMG verabreicht werden. Nach Retroductal Lieferung beschränkt sich extra glanduläre Diffusion durch die umliegenden Gewebe Kapsel regelt den Austausch von Material mit den umliegenden Strukturen⁶. Die SMG seinen Kanal sind beim Menschen ähnlich strukturiert und werden routinemäßig bei SMG Chirurgie und Sialoendoscopy⁷aufgerufen. In Mensch und Maus ist das PG ebenfalls über Stensen Rohr in die bukkale Schleimhaut⁸erreichbar.

In murinen Modellen der RIH wurde SMG Retroductal Injektion zur liefern Therapeutika wie Wachstumsfaktoren, Primärzellen, adenovirale Vektoren, Zytokine und antioxidativen Verbindungen zu modulieren die zelluläre Reaktion auf eine Verletzung, und reduzieren Sie die daraus resultierenden Gewebe Schaden^{5,9,10,11,12,13,14,15,16}. Die wichtigste klinische Erfolg Retroductal Injektion ist die Verwaltung von adenoviralen Vektor direkten Ausdruck von einem Wasserkanal (Aquaporin-1; AQP1) bei Patienten nach der Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Krebs-¹⁷.

Zuvor haben wir entwickelt und gezeigt, die Wirksamkeit eines Retroductally injiziert Polymeren Nanopartikel-SiRNA-Systems zum Schutz der Speicheldrüse Funktion von RIH^11,18,19,20. Als Erweiterung unserer bisherigen Arbeit zeigen hier, wir, unser Protokoll für Retroductal SMG Injektion mittels eindringmittel beschrifteten Nanopartikel (NP) laden und liefern sonst schwerlösliche^21,22, Medikamente ²³.

Wir haben die NP aus einem Diblock Copolymers bestehend aus Poly (Styrol-Alt-Maleinsäure anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) durch reversible Addition Kette Fragmentierung (FLOß) Polymerisation, wie zuvor beschrieben²¹. synthetisiert. Durch lösungsmittelaustausch zusammensetzen selbst dieser Polymere spontan in Micelle NP Strukturen mit einem hydrophoben innen- und hydrophilen außen²¹. Die NPs sind mit Texas-rot Fluorophore, die Überprüfung der NP-Lieferung in den Drüsen zu gestatten, ohne das Tier gekennzeichnet. Live Animal Imaging und SMG Immunohistochemistry zeigt sich bei 1 h und 1 Tag nach der Injektion.

Dies aktualisiert und reproduzierbare Kanülierung Protokoll sollte damit andere Retroductal Injektion zu erreichen. Wir erwarten, dass diese raffinierte Technik für in Vivo Studien und therapeutische Entwicklung^24,25von entscheidender Bedeutung.

Protokoll

Alle in-Vivo -Verfahren unten beschriebenen stimmten die Universität vom Tier Ressourcen an der University of Rochester, Rochester, NY.

1. Vorbereitung

1. Schneiden Sie 32G intrakraniellen Katheter Schlauch mit Draht 3 cm des Schlauches eine abgeschrägte Ende, ca. 45° zur Längsachse zu bilden. Bestätigen Sie, dass der Draht mindestens 1 cm länger als die Röhre.
2. Laden Sie 50 µL PSMA Nanopartikel Lösung (Abbildung 1), oder einem anderen Injektionsmaterial in eine Hamilton-Spritze. Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Barotrauma beim Einspritzen, befestigen Sie den Katheter Schlauch mit der Mandrin entfernt, an der Spritze und vertreiben Sie Totvolumen zu.
3. Überprüfen Sie die Injektionslösung um sicherzustellen, dass die Nanopartikel voll SOLVATISIERTE duktale Behinderung nach der Verabreichung zu verhindern ist.
4. Bereiten Sie Atropin Lösung 0,1 mg/ml.
   Hinweis: Da Atropin lichtempfindlich ist und nimmt im Laufe der Zeit, diese Lösung sollte am Tag der Injektion, und lichtgeschützt bis verabreicht.

(2) den Zugriff auf und Visualisieren von duktalen Einstiegspunkt

1. Wiegen Sie C57/BL6 Mäuse mit einer Analysenwaage.
2. Mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, Betäuben Sie Mäuse mit einem intraperitoneal injizierten steriler Kochsalzlösung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort, wenn die Maus reagiert nicht mehr auf Reize, die in der Regel innerhalb von 5 bis 10 min nach der Injektion auftritt.
   Hinweis: Dieses Verfahren auch unter Isofluran durchgeführt werden, sondern erfordert eine benutzerdefinierte bugnase, die Zugriff auf die Mundhöhle ermöglicht.
3. Um Trockenheit während des Verfahrens zu verhindern, gelten Sie Schmiermittel für Augen und platzieren Sie den Mauszeiger in Bauchlage auf einer benutzerdefinierten Bühne.
   Hinweis: Um angemessene Bedingungen für Intra-orale Verfahren beizubehalten, Werkzeuge sollten nicht desinfiziert oder vor jedem Gebrauch sterilisiert.
4. Öffnen der Mundhöhle durch die Sicherung der Oberkiefer-Schneidezähne über einen metallischen Strahl, und verwenden Sie eine elastisches Band, nach unten gerichtete Spannung hinter den Unterkiefer Schneidezähne (Abbildung 2A) anzuwenden.
5. Richten Sie die Maus unter dem sezierenden Mikroskop, so dass die Unterseite des Kiefers visualisiert wird.
6. Um den Mund zu verbreitern, verwenden Sie einen benutzerdefinierte, geschwungenen Stahl Retraktor Spannung die bukkale Schleimhaut auf bilateraler Ebene zuweisen.
7. Um die submandibulären Papillen zu visualisieren, greifen Sie und heben Sie vorsichtig die Zunge aus dem Boden der Mundhöhle mit stumpfen Pinzette.
   Hinweis: Die Papillen erscheinen als zwei blasse Ausbuchtungen unter der Zunge (Abb. 2 b).
8. Um die Visualisierung und weitere Manipulation in der Mundhöhle zu erleichtern, legen Sie Baumwolle zwischen der Zunge und die bukkale Schleimhaut.

(3) duktale Kanülierung und Linie Platzierung

1. Mit feinen, greifen gebogenen Pinzette Katheter Schlauch mit der Draht-Einschub. Richten Sie für eine optimale manuelle Steuerung während Kanülierung den Schlauch mit der Krümmung der Zange (Abb. 3A).
2. Bewegen Sie mit dem sezierenden Mikroskop die Zange und Draht in das Blickfeld.
   Hinweis: Das Kabel sollte aus den Rohren herausragt.
3. Sanft Druck in den unteren Teil einer mandibulären Papille mit dem Draht eingelassen um eine kleine, oberflächlich, Schleimhaut Punktion (0,076 mm Durchmesser) zu produzieren, die später den Katheter Schlauch (0,25 mm Durchmesser) ermöglichen wird. Wenn Widerstand gestoßen ist, schneiden Sie frische abgeschrägte Tipps, Schläuche und Kabel Einschub mit scharfen sezierenden Schere.
4. Zurückziehen Sie nach dem Einstieg der Mandrin, und bestätigen Sie das sezierenden Mikroskop das Vorhandensein von Speichel auf die Einstichstelle. Vermeiden Sie kraftvoll oder plötzliche Bewegung (Rückzug oder einfügen) der das Stilett, das möglicherweise dazu führen, dass Blutungen oder duktale Integrität.
5. Ziehen Sie das Stilett innerhalb der Schläuche (Abb. 3 b).
6. Um sicherzustellen, dass die Injektion Schläuche in Wharton Kanal öffnen passt, legen Sie Schläuche, enthält das Stilett als starre Leitfaden in der zuvor erstellten Punktion (Abbildung 2 C).
   Hinweis: Wenn nicht rasch durchgeführt werden, kann lokale Schwellung Wiedereinfügen verhindern.
7. Um Gegendruck von längeren duktale Obstruktion zu verhindern, zurückziehen der Schläuche. Überprüfen Sie um sicherzustellen, dass eine Öffnung, unter Mikroskopie, sichtbar in der mandibulären Papille gesehen werden kann. Wenn sichtbare Blutung auftritt, entfernen Sie das Stilett und erneut ab Schritt 3.2 auf der gegnerischen mandibulären Papillen.
8. Verwalten Sie, ohne die Maus zu bewegen, intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Atropin Lösung, Speichelfluss während des Verfahrens zu reduzieren. Warten Sie ca. 5-10 Minuten.
9. Fassen Sie das Ende der Spritze Schlauch, und legen Sie in der Öffnung das sezierenden Mikroskop (Abbildung 3). Wenn Widerstand gestoßen ist, schneiden Sie eine frischen abgeschrägte Ende Schlauch und Reattempt.
10. Sobald der Schlauch innerhalb der mandibulären Papille ist, langsam vorwärts 3-5 mm in den Kanal. Lassen Sie den Schlauch aus der Zange.
11. Um die Dichtung zwischen der Rohrleitung und der mandibulären Papille zu verbessern, trocknen Sie die Schnittstelle durch sanft abtupfen mit Gaze für 1 min.
12. Überprüfen Sie um sicherzustellen, dass die Position des Schlauches während der Trocknung nicht verschoben hat.

4. Injektion

1. Material mit einer Rate von 10 µL/min. Inspect zu bestätigen, dass die Maus sediert bleibt und keine Zeichen der Bedrängnisses (Abb. 2D zeigt) zu injizieren.
   Hinweis: Injektionen von 15-50 µL sind gut verträglich. Injektion von größeren Mengen kann Barotrauma führen.
2. Behalten Sie im Anschluss an die Injektion Spritze Druck für 5 min um die Beibehaltung des Materials innerhalb Whartons Luftkanal und SMG (Abbildung 4) zu verbessern. Überprüfen Sie die submandibulären Papille regelmäßig, um sicherzustellen, dass die Schläuche die ductal Öffnung nicht beendet wird.
3. Mit feinen Pinzette, fassen und vorsichtig den Schlauch vom mandibulären Papillen zurücktreten.
   Hinweis: Es ist normal, einige Flüssigkeit Austritt aus den Papillen zu beobachten.
4. Entfernen Sie die Aufrollvorrichtung und Baumwolle aus der Mundhöhle vor dem Bewegen der Maus von der Bühne.
   Hinweis: Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die Maus nicht mit anderen Mäusen bis vollständig erholt untergebracht ist.

5. Überprüfung und Analyse

Hinweis: Eine in-Vivo Imaging System (IVIS) kann verwendet werden zur Aufbewahrung von eindringmittel beschrifteten Nanopartikel nach Injektion (wie gezeigt 1 h und 24 h nach der Injektion in Abbildung 5) zu beurteilen.

1. Um Fluoreszenzsignal innerhalb der SMG durch die Haut sichtbar zu machen, entfernen Sie das ventrale Fell über die SMGs entweder durch rasieren oder mit einem chemischen Enthaarungsmittel.
   Hinweis: Nach Euthanasie, SMG Gewebe kann auch geerntet werden, wurde behoben (Übernachtung in 4 % Paraformaldehyd) und gebeizt verwenden Immunohistochemistry zur Bestätigung der Persistenz von eindringmittel beschrifteten NP einen Tag nach der Injektion (Abbildung 6).

Ergebnisse

Retroductal Injektion einsetzbar, NPs auf der murinen SMG (Abbildung 1) zu verwalten. Hier liefern wir 50 µg PSMA NPs mit Texas Red Fluorophore beschriftet.

Die richtige Platzierung der Maus ermöglicht einfachen Zugang und Visualisierung von dem Boden der Mundhöhle (Abbildung 2A-B). Die submandibulären Papillen sind als zwei fleischigen Ausbuchtunge...

Diskussion

Retroductal Injektion ist entscheidend für lokalisierte Drug-Delivery, die Speicheldrüse. Diese Technik findet Anwendung in screening-Therapeutika für Bedingungen einschließlich der Sjögren-Syndrom und RIH^9,10,28. Direkte Medikamentenabgabe in der SMG durch Retroductal Injektion bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber systemischen Verabreichung in seinem Potential, Ziel-Effekte, darunter Immunaktivierung

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pilocarpine hydrochloride	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-9	Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline Solution	Medline	RDI30296H	Saline
Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Curved Forceps
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Straight Forceps
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12	Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes	Fisher Scientific	22362566	Capillary tubes
Lubricant Eye Ointment	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	Statistical Software
Cotton tipped applicator	Medline	MDS202000	Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"	BD	7629	Syringe for intraperitoneal injection