JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Anlayış Tükürük bezi Biyoloji ve roman therapeutics gelişimi için yerel ilaç dağıtım submandibular bezleri için ilgilendirir. Biz teslim doğruluk ve deneysel tekrarlanabilirlik artırmak için tasarlanmış bir güncel ve ayrıntılı retroductal enjeksiyon Protokolü mevcut. Burada sunulan polimer nano tanecikleri teslimini uygulamasıdır.

Özet

Tükürük bezi therapeutics iki ortak hedefleri vardır önleme ve tedavi de takip doku disfonksiyon otoimmün veya radyasyon yaralanma. Yerel olarak biyoaktif bileşikler tükürük bezleri sunarak, daha fazla doku konsantrasyonları güvenli bir şekilde karşı sistemik yönetim elde edilebilir. Ayrıca, hedef doku malzeme ekstra salgı birikimi etkileri önemli ölçüde azaltılabilir. Bu bağlamda, retroductal enjeksiyon Tükürük bezi Biyoloji ve patofizyolojisi soruşturma için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Büyüme faktörleri, Primer hücre, adenoviral Vektörler ve küçük molekül uyuşturucu Retroductal İdaresi yaralanma ayarında bezi işlevi desteklemek için gösterilmiştir. Biz daha önce bezi işlevi ışınlama takip korumak için bir retroductally enjekte nanopartikül-siRNA strateji etkinliğini göstermiştir. Burada, Nanomalzemeler fare submandibular bezi Wharton'ın kanal aracılığıyla yönetmek için son derece etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntılı (şekil 1). Biz ağız boşluğu erişim açıklar ve daha fazla olarak kullanılan prosedür boyunca kalite kontrolleri gözlemleri ile cannulate Wharton'ın kanal için gereken adımları özetlemektedir.

Giriş

Tükürük bezi disfonksiyon Sjoegren Sendromu, fonksiyonel salgı dokusu ve indüklenen radyasyon hyposalivation (RIH), baş ve boyun kanser radyoterapi1ortak bir sequella bir otoimmün aracılı kaybı da dahil olmak üzere pek çok etiologies vardır. Her iki koşul nedeniyle tükürük fonksiyon kaybı bireylerin oral ve sistemik enfeksiyon, diş çürüğü, sindirim ve yutma bozukluğu, konuşma bozukluğu ve Majör depresyon1,2,3açmaları. Sonuç olarak, yaşam kalitesini önemli ölçüde, için tedavi4yerine belirtiler palliation sınırlı müdahaleler ile uğrar. Roman terapiler vivo içindearaştırmak için doğrudan Tükürük bezi biyoaktif bileşikler yönetmek ilgi olduğunu.

Retroductal enjeksiyon doğrudan tükürük bezleri biyoaktif bileşikler teslim ve hastalık, yaralanma, veya normal doku homeostazı altında etkinliğini test etmek için değerli bir yöntemdir. Parotid (PG), çene (SMG) ve hapı (SLG), üç büyük tükürük bezleri vardır tüm boşaltım kanalı aracılığıyla oral kavite içine hangi boş. Antikorundan anatomisi SMG cannulation ağız dili5altında katında bulunan Wharton'ın kanalının aracılığıyla doğrudan erişime izin verir. Takip cannulation, solvated uyuşturucu doğrudan SMG için yönetilebilir. Retroductal teslimat ekstra glandüler Difüzyon yapıları6çevreleyen ile malzeme alışverişini düzenleyen çevreleyen doku kapsülü tarafından kısıtlanır. SMG ve onun kanal insanlarda benzer şekilde yapılandırılmıştır ve rutin SMG cerrahi ve sialoendoscopy7sırasında erişilir. İnsan ve fare PG aynı şekilde mukozasinin8' Stensen'ın kanal üzerinden erişilemez.

RIH fare modellerinde, SMG retroductal enjeksiyon büyüme faktörleri, Primer hücre, adenoviral Vektörler, sitokinler ve yaralanma için hücresel yanıt modüle ve sonucu olan azaltmak için antioksidan bileşikler de dahil olmak üzere tedavi sunmak için kullanılmıştır doku hasarı5,9,10,11,12,13,14,15,16. Retroductal enjeksiyon en önemli klinik başarısı bir su kanalı (Aquaporin 1; ifade yönlendirmek için adenoviral vektör bir ilçedir AQP1) hastalarda baş ve boyun kanser17için radyasyon ardından.

Daha önce biz geliştirdik ve tükürük bezi işlevi RIH11,18,19,20korumak için enjekte retroductally polimer nanopartikül-siRNA sistem etkinliğini gösterilen. Geçmiş çalışmalarımızın bir uzantısı olarak, burada, biz göstermek bizim protokolü kullanarak bir fluorescently etiketli nanopartikül (NP) yükleme ve aksi takdirde kötü çözünür teslim kabil retroductal SMG enjeksiyon için21,22, ilaçlar 23.

Poli (Stiren-alt-maleic anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) yoluyla tersine çevrilebilir ek zinciri parçalanma (Sal) polimerizasyonu,21daha önce açıklandığı gibi. oluşan bir diblock kopolimer üzerinden NP sentezlenmiş Solvent exchange üzerinden Bu polimerler kendiliğinden micelle NP yapılar bir hidrofobik ve hidrofilik iç dış21ile kendini topla. NPs hayvan ödün vermeden NP teslim bezlerin içine doğrulanmasına izin vermek için Texas-kırmızı fluorophore ile etiketlenir. Canlı hayvan görüntüleme ve SMG immünhistokimya 1 h ve 1 gün enjeksiyon takip gösterilir.

Bu güncellenir ve tekrarlanabilir cannulation Protokolü diğerleri retroductal enjeksiyon elde etmek etkinleştirmeniz gerekir. Biz bu rafine teknik in vivo çalışmalar ve terapötik geliştirme24,25için kritik olacak bekliyoruz.

Protokol

Aşağıda verilen tüm vivo içinde yordamlar hayvan kaynakları, Rochester Üniversitesi, Rochester, NY Üniversitesi Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hazırlık

  1. 32 G kafa içi kateter boru ile tel iç metin kullanılarak, eğimli bir sokak, yaklaşık 45 ° uzun eksen oluşturmak üzere hortumunun 3 cm kesme. Tel en az 1 cm boru daha uzun olduğunu doğrulayın.
  2. PSMA nanopartikül çözüm (şekil 1) 50 µL veya diğer enjeksiyon malzemesi Hamilton şırınga yükleyin. Enjeksiyon sırasında barotrauma olasılığını azaltmak için çıkarmak belgili tanımlık tenkıye stylet ile kateter boru takın ve ölü cilt sınırdışı.
  3. Enjeksiyon çözüm nanopartikül tam yönetim takip duktal tıkanıklığı önlemek için solvated olduğundan emin olmak için kontrol edin.
  4. Atropin çözüm 0.1 mg/mL, hazır olun.
    Not: atropin ışığa duyarlı ve zaman içinde alçaltır çünkü bu çözüm olmalı enjeksiyon günümdü ve yönetilen kadar ışıktan korunan.

2. erişim ve duktal giriş noktası görüntülenmesi

  1. C57/BL6 fareler bir analitik denge kullanarak tartın.
  2. 0.5 mL 29G x ½" iğne ile kullanarak, fareler 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine intraperitoneally enjekte bir steril serum fizyolojik solüsyonu ile anestezi. Fareyi artık genellikle 5-10 dk içinde enjeksiyon takip oluşur uyaranlara karşı yanıt verdiğinde aşağıdaki adıma geçin.
    Not: Bu yordam isoflurane altında da yapılabilir ama ağız boşluğu erişmesine izin veren özel bir burun konisi gerektirecektir.
  3. Kuruluk işlem sırasında önlemek için yağ gözler için uygulamak ve fare yüzükoyun sígara özel bir sahne alanı üzerine yerleştirin.
    Not: içi sözlü yordamı için uygun koşullar korumak için Araçlar dezenfekte olabileceği gibi her kullanımdan önce sterilize.
  4. Oral kavite üzerinde metal bir kiriş üst kesici dişler güvenli hale getirme açın ve aşağıya doğru gerilim Altçene ön dişler (şekil 2A) arkasında uygulamak için bir elastik bant kullanın.
  5. Öyle ki çene Bankası görselleştirildiği diseksiyon mikroskop altında fare hizalayın.
  6. Ağız genişletmek için özel, kavisli çelik Retraktörü gerginlik bilateral mukozasinin için uygulamak için kullanın.
  7. Submandibular papilla görselleştirmek için kavramak ve yavaşça dil künt forseps kullanarak ağız yerden kaldırın.
    Not: Papilla iki soluk çıkıntılar dil (şekil 2B) altında görünür.
  8. Oral kavite içinde görselleştirme ve düzenleme daha da kolaylaştırmak için dil ve yanak mukozasında arasında pamuk yerleştirin.

3. duktal Cannulation ve satır yerleştirme

  1. İyi kullanarak, kıvrımlı pensler, kateter boru tel ilave ile kavramak. Cannulation sırasında optimum manuel kontrol için boru forseps (şekil 3A) eğimi ile hizalayın.
  2. Diseksiyon mikroskop kullanarak, forseps ve tel görüş alanı taşıyın.
    Not: Tel üzerinden boru çıkıntılı.
  3. Yavaşça kateter hortumunun (0,25 mm çap) daha sonra girişi kolaylaştıracak bir küçük, yüzeysel, Mukozal ponksiyon (0,076 mm çap) üretmek için iç metin tel kullanarak bir çene papilla üsse doğru basınç uygulayın. Direnç ile karşılaşılırsa, boru ve tel ilave taze eğimli ipuçları keskin diseksiyon makasla kesme.
  4. Giriş, ardından stylet geri çekilin ve diseksiyon mikroskop kullanarak, tükürük ponksiyon sitesinde varlığını doğrulamak. Güçlü veya ani hareketi (para çekme veya ekleme) kanamaya neden veya duktal bütünlüğü tehlikeye stylet kaçının.
  5. Stylet boru (şekil 3B) içinde geri çek.
  6. Enjeksiyon boru açma Wharton'ın kanal uyacak emin olmak için daha önce yapılan delik (Şekil 2 C) içine sert bir rehber olarak stylet içeren tüp takın.
    Not: hızlı bir şekilde gerçekleştirilen değil ise, yerel şişlik ekleyen engel olabilir.
  7. Uzun süreli duktal tıkanıklığı arka baskısı önlemek için tüp çekilme. Bir açılış, mikroskobu altında görünür submandibular papilla görülebilir doğrulamak için kontrol edin. Görünür kanama meydana gelirse, stylet kaldırmak ve adım 3.2 karşıt submandibular papilla üzerinde deneyin.
  8. Fareyi hareket olmadan, mayi enjeksiyon işlemi sırasında salya azaltmak için 1 mg/kg atropin çözüm yönetmek. 5-10 dk bekle.
  9. Şırınga boru sonuna kavramak ve diseksiyon mikroskop (şekil 3 c) kullanarak ağız yerleştirin. Direnç ile karşılaşılırsa, taze bir eğimli sonunda boru ve yeniden kesti.
  10. Yavaş yavaş tüp içinde çene papilla yaptıktan sonra 3-5 mm kanal ilerlemek. Boru forseps üzerinden yayın.
  11. Submandibular papilla arasındaki tüp mühür artırmak için 1 dk. için gazlı bezle hafifçe Blot tarafından arayüzü kuru.
  12. Tüp konumunu kurutma sırasında kaymıştır değil olduğunu onaylamak için kontrol edin.

4. enjeksiyon

  1. 10 µL/dk. fare uyuşturulan kalır ve sıkıntı (şekil 2B) belirtileri gösteriyor değil onaylamak için kontrol oranında malzeme enjekte.
    Not: 15-50 µL enjeksiyonlari iyi tolere edilir. Daha büyük birimleri enjeksiyon içinde barotrauma neden olabilir.
  2. Enjeksiyonu, şırınga basınç malzeme Wharton'ın kanal ve SMG (şekil 4) içinde tutma geliştirmek 5 min için korumak. Submandibular papilla düzenli olarak boru duktal delikten çıkmak değil emin olmak için kontrol edin.
  3. İyi forseps kullanarak, kavramak ve yavaşça--dan çene papilla tüp çekilme.
    Not: Bazı sıvı çıkış papilla üzerinden gözlemlemek için normaldir.
  4. Retraktörü ve pamuk önce dokunaklı belgili tanımlık fare Sahne Alanı'ndan ağız boşluğu kaldırın.
    Not: sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar hayvan katılımsız bırakılmamalıdır. Ayrıca, fare ile diğer fareler kadar tamamen iyileşti bulunmaktadır değil emin olun.

5. doğrulama ve analiz

Not: Bir vivo içinde görüntüleme sistemi (IVIS) enjeksiyon (olarak gösterilen 1 h ve sonra enjeksiyon şekil 5' te 24 h) takip fluorescently etiketli nano tanecikleri tutma değerlendirmek için kullanılabilir.

  1. Deri yoluyla SMG floresan sinyal daha iyi görmek için tıraş ya da kimyasal bir depilatory kullanarak SMGs örten ventral kürk kaldırın.
    Not: Ötenazi, SMG doku aynı zamanda hasat edilebilir, (gece içinde %4 paraformaldehyde) sabit ve kalıcı bir enjeksiyon (şekil 6) aşağıdaki gün fluorescently etiketli NP onaylamak için immünhistokimya kullanarak lekeli.

Sonuçlar

Retroductal enjeksiyon NPs fare SMG (şekil 1) yönetmek için kullanılabilir. Burada, biz 50 µg PSMA NPs Texas kırmızı fluorophore ile etiketli teslim.

Fare uygun yerleştirme facile erişim ve görselleştirme (şekil 2A-B) ağız tabanının sağlar. Submandibular papilla iki etli çıkıntılar dil altında tanımlanır. Cannulation (

Tartışmalar

Retroductal enjeksiyon Tükürük bezi için yerelleştirilmiş ilaç dağıtım için önemlidir. Bu teknik Sjogren sendromu ve RIH9,10,28dahil olmak üzere koşullar terapötik ajanlar eleme içinde uygulama alanı vardır. Retroductal enjeksiyon yoluyla SMG içine doğrudan ilaç dağıtım bağışıklık harekete geçirmek11de dahil olmak üzere kapalı-hedef etkileri azaltmak için potansiyel sistem...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu yayında bildirilen araştırma diş Ulusal Enstitüsü ve Fasiyal araştırma (NIDCR) ve ulusal sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R56 DE025098, UG3 DE027695 ve F30 CA206296 altında Ulusal Kanser Enstitüsü (ncı) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. Bu eser de NSF DMR 1206219 ve IADR yenilik Oral bakım Ödülü (2016) tarafından desteklenmiştir.

IVIS deneyler yapmakta yardımını Jayne Gavrity teşekkür etmek istiyorum. Karen Bentley onun giriş ve EM yerine yardım için teşekkür etmek istiyorum. Pei-Lun Weng IHC ile yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum. Matthew Ingalls şekil hazırlık yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum. Dr. Elaine Smolock ve Emily Wu bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Pilocarpine hydrochlorideSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-9Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline SolutionMedlineRDI30296HSaline
Dumont #7 ForcepsFine Science Tools11274-20Curved Forceps
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-10Straight Forceps
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary TubesFisher Scientific22362566Capillary tubes
Lubricant Eye OintmentRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Statistical Software
Cotton tipped applicatorMedlineMDS202000Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"BD7629Syringe for intraperitoneal injection

Referanslar

  1. Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
  2. Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies. Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).
  3. Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life. Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).
  4. Vissink, A., et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).
  5. Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).
  6. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).
  7. Beahm, D. D., et al. Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature. International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).
  8. Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands. Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).
  9. Zheng, C., et al. Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands. Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).
  10. Okazaki, Y., et al. Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor. Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).
  13. Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).
  14. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).
  15. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  16. Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation. Cancer Research. , (2016).
  17. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).
  18. Arany, S., et al. Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).
  19. Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1. Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).
  20. Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System. ACS Nano. , (2017).
  21. Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells. Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).
  22. Wang, Y., et al. Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing. ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).
  23. Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).
  24. Kuriki, Y., et al. Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct. Journal of Visualized Experiments. (51), e3074 (2011).
  25. Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  26. Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing. Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).
  27. Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts. Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).
  28. Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. IL17: potential therapeutic target in Sjogren's syndrome using adenovirus-mediated gene transfer. Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksorunu 135Cannulationretrogradretroductalnanopartik lenet k r kbezi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır