Injection de nanoparticules de Retroductal à la glande submandibulaire Murine

Résumé

Locaux de médicaments vers les glandes sous-maxillaires est intéressant en biologie de glande salivaire de compréhension et pour le développement de nouvelles thérapeutiques. Nous présentons un protocole d’injection retroductal mise à jour et détaillées, destiné à améliorer la précision de livraison et de la reproductibilité expérimentale. L’application présentée ici est la livraison de nanoparticules polymériques.

Résumé

Deux objectifs communs de la glande salivaire thérapeutique sont la prévention et le traitement des dysfonctions tissulaires suivant une auto-immunes ou rayonnements des blessures. En fournissant localement des composés bioactifs vers les glandes salivaires, teneurs plus élevées en tissu peuvent être réalisées en toute sécurité par rapport à l’administration systémique. En outre, hors tissu cible peuvent être réduites considérablement les effets d’extra glandulaire accumulation de matière. À cet égard, l’injection de retroductal est une méthode largement utilisée pour l’étude des glandes salivaires biologie et la physiopathologie. Retroductal administration de facteurs de croissance, les cellules primaires, vecteurs viraux et médicaments à petites molécules a été démontrée à l’appui de la glande dans le cadre de la blessure. Nous avons déjà montré l’efficacité d’une stratégie de nanoparticules-siARN retroductally injecté pour maintenir la fonction de la glande après irradiation. Ici, une méthode très efficace et reproductible pour administrer des nanomatériaux pour la glande submandibulaire murine par canal de Wharton est détaillée (Figure 1). Nous décrivons accéder à la cavité buccale et décrivent les étapes nécessaires au canal de Wharton cannulate, outre les observations servant de contrôles qualité tout au long de la procédure.

Introduction

Dysfonctionnement des glandes salivaires a plusieurs étiologies, y compris le syndrome de Sjögren, une perte de médiation auto-immune du tissu sécréteur fonctionnel et rayonnement induit hypoptyalisme (RIH), une commune séquelle de radiothérapie du cancer tête et du cou¹. Perte de fonction salivaire en raison ou l’autre condition prédispose les individus à infections buccodentaires et systémiques, la carie, dysfonction digestive et déglutition, trouble de la parole et dépression majeure^1,2,3. En conséquence, qualité de vie souffre considérablement, avec des interventions limitées à la palliation des symptômes plutôt que de guérir⁴. Afin d’étudier de nouveaux traitements en vivo, il est intéressant d’administrer les composés bioactifs directement à la glande salivaire.

Retroductal injection est une méthode utile pour livrer des composés bioactifs directement vers les glandes salivaires et de tester l’efficacité dans les maladies, blessures, ou en vertu de l’homéostasie tissulaire normale. Les trois glandes salivaires principales sont la glande parotide (PG), la sous-maxillaire (SMG) et la sublinguale (SLG), tous de quel vide dans la cavité buccale par l’intermédiaire de conduits excréteurs. L’anatomie de la murine SMG permet un accès direct par le biais de canulation du canal de Wharton, situé dans le plancher de la bouche sous la langue⁵. Après la canulation, solvatés médicaments peuvent être administrés directement à la SMG. Suite retroductal livraison, diffusion extra glandulaire est restreinte par la capsule de tissu environnant qui régit l’échange de documents avec entourant les structures⁶. Le SMG et sa gaine sont structurés de la même façon chez les humains et sont systématiquement accessibles au cours de la SMG chirurgie et sialoendoscopy⁷. Chez les humains et les souris, le PG est également accessible par l’intermédiaire de Sténon dans la muqueuse buccale⁸.

Dans les modèles murins de RIH, injection retroductal SMG a été utilisée pour livrer des produits thérapeutiques, y compris les facteurs de croissance, les cellules primaires, vecteurs viraux, cytokines et composés antioxydants pour moduler la réponse cellulaire à l’injure et réduire le les tissus des dommages^{5,9,10,11,12,13,14,15,16}. Le plus notable succès clinique de retroductal injection est l’administration d’un vecteur adénoviral pour diriger l’expression d’un canal d’eau (aquaporine 1 ; AQP1) chez les patients ayant le rayonnement pour la tête et du cou, cancer du¹⁷.

Auparavant, nous avons développé et démontré l’efficacité d’un système de nanoparticules polymériques-siARN retroductally injecté pour protéger la glande salivaire de RIH^11,18,19,20. Ici, dans le prolongement de nos travaux antérieurs, nous démontrons notre protocole pour l’injection de SMG retroductal à l’aide d’une NANOPARTICULE fluorescent étiquetée (NP) capable de charger et livrer autrement peu solubles médicaments^{21,22, 23}.

Nous avons synthétisé la NP d’un copolymère à deux blocs de poly (styrène-alt-maléique anhydride)-b-poly(styrene) (LMFP) par le biais de polymérisation de fragmentation (RAFT) chaîne addition réversible, comme décrit plus haut²¹. Grâce à l’échange de solvant, ces polymères spontanément s’auto-assembler en structures NP micelle avec un hydrophobe intérieur et hydrophile extérieur²¹. Les NPs sont étiquetés avec un fluorophore Texas-rouge pour permettre la vérification de la livraison de NP dans les glandes sans pour autant sacrifier l’animal. Vivre l’imagerie animale et immunohistochimie SMG est affiché à 1 h et 1 jour après l’injection.

Cette mise à jour et protocole reproductible canulation devrait permettre à d’autres réaliser l’injection de retroductal. Gageons que cette technique raffinée deviendra critique pour des études in vivo et développement thérapeutiques^24,25.

Protocole

Toutes les procédures en vivo décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité Université sur les ressources animales à l’Université de Rochester, Rochester, NY.

1. préparation

1. Utilisez un tuyau de 32G cathéter intracrânienne avec incrustation de fil, couper 3 cm du tube pour former une extrémité biseautée, environ 45° à l’axe longitudinal. Confirmer que le fil soit au moins 1 cm de plus que le tube.
2. Charge 50 µL de solution de nanoparticules LMFP (Figure 1), ou autre matériel d’injection, une seringue de Hamilton. Pour réduire la probabilité de barotraumatisme pendant l’injection, fixer la tubulure du cathéter, avec le stylet enlevé, à la seringue et expulser le volume mort.
3. Inspecter la solution d’injection afin d’assurer que la nanoparticule est entièrement solvatés pour éviter l’obstruction canalaire après l’administration.
4. Préparer la solution de l’atropine à 0,1 mg/mL.
   Remarque : Parce que l’atropine est sensible à la lumière et se dégrade au fil du temps, cette solution devrait être faite le jour de l’injection et abrie de la lumière jusqu'à ce que les administrés.

2. accès et visualisation de Point d’entrée canalaire

1. Peser les souris C57/BL6 en utilisant une balance analytique.
2. À l’aide d’une seringue 0,5 mL avec aiguille 29 x ½", anesthésier la souris avec une solution saline stérile injectée par voie intrapéritonéale de xylazine kétamine et 10 mg/kg de 100 mg/kg. Passez à l’étape suivante lorsque la souris ne répond plus aux stimuli, qui survient généralement dans les 5 à 10 min après l’injection.
   Remarque : Cette procédure peut également être réalisée sous isoflurane, mais nécessitera un cône de nez personnalisé qui permet l’accès à la cavité buccale.
3. Pour prévenir le dessèchement pendant la procédure, appliquer du lubrifiant sur les yeux et placez la souris dans une position couchée sur une scène personnalisée.
   Remarque : Pour maintenir des conditions appropriées pour procédure intra-buccaux, outils devraient être désinfectés ou stérilisés avant chaque utilisation.
4. Ouvrir la cavité buccale en sécurisant les incisives maxillaires sur une poutre métallique et une bande élastique permet d’appliquer une tension vers le bas derrière les incisives mandibulaires (Figure 2 a).
5. Aligner la souris sous le microscope à dissection, telle que la base de la mâchoire est visualisée.
6. Afin d’élargir la bouche, utiliser un enrouleur acier incurvé, personnalisé pour appliquer une tension sur le plan bilatéral à la muqueuse buccale.
7. Pour visualiser les papilles sous-mandibulaire, saisir et soulevez doucement la langue du plancher de la bouche avec une pincette émoussé.
   Remarque : Les papilles seront affiche comme deux protubérances pâles située sous la langue (Figure 2 b).
8. Pour faciliter la visualisation et la manipulation plus loin dans la cavité buccale, placez le coton entre la langue et la muqueuse buccale.

3. canalaire canulation et Placement de la ligne

1. Employer les fine pince courbée, saisir tubulure du cathéter avec l’encart de fil. Pour un contrôle manuel optimal pendant la canulation, aligner le tube avec la courbure de la pince (Figure 3 a).
2. En utilisant le microscope à dissection, déplacer la pince et le fil dans le champ de vision.
   Remarque : Le fil doit dépasser de la tubulure.
3. Exercez une légère pression sur la base d’une papille sous-maxillaire, en utilisant le fil encastré pour produire une perforation petite, superficielle, muqueuse (0,076 mm de diamètre) qui facilitera l’entrée plus tardive de la tubulure du cathéter (0,25 mm de diamètre). Cas de résistance, coupées fraîches conseils biseautés sur le tube et le médaillon de fil avec des ciseaux de dissection pointu.
4. Suite à l’entrée, retirer le stylet et, en utilisant le microscope à dissection, confirment la présence de la salive sur le site de ponction. Évitez le mouvement énergique ou soudaine (retrait ou insertion) du stylet qui peut provoquer des saignements ou compromettre l’intégrité canalaire.
5. Rétracter le stylet dans le tube (Figure 3 b).
6. Afin d’assurer que tube d’injection s’adaptera dans un conduit de Wharton ouverture, insérer le tube contenant le stylet comme un guide rigide dans la ponction faite précédemment (Figure 2 C).
   Remarque : Si ne pas exécutés rapidement, gonflement local peut empêcher de ré-insertion.
7. Pour empêcher la contre-pression de l’obstruction canalaire prolongée, retirer le tube. Inspecter pour vérifier qu’une ouverture, visible en microscopie, peut être vu dans la papille sous-maxillaire. En cas de saignement visible, retirer le stylet et retentez de l’étape 3.2 sur les papilles sous-maxillaire adverses.
8. Sans bouger la souris, administrer une injection intrapéritonéale de la solution de l’atropine 1 mg/kg, pour réduire la salivation lors de la procédure. Attendre 5-10 min.
9. Saisir l’extrémité de la tubulure de la seringue et l’insérer dans l’orifice en utilisant le microscope à dissection (Figure 3). Cas de résistance, couper une extrémité biseautée fraîche pour le tubage et la reattempt.
10. Une fois que le tube est en place au sein de la papille sous-mandibulaire, avancer lentement 3-5 mm dans le conduit. Communiqué de la tubulure de la pince.
11. Afin d’améliorer l’étanchéité entre le tube et la papille sous-mandibulaire, sécher l’interface en tamponnant doucement avec de la gaze pendant 1 min.
12. Inspecter pour confirmer que la position du tuyau n’a pas changé pendant le séchage.

4. injection

1. Injecter le matériau à un taux de 10 µL/min. inspecter pour confirmer que la souris reste sous sédation et ne montre pas de signes de détresse (Figure 2D).
   NOTE : Les Injections de 15 à 50 µL sont bien tolérées. Barotraumatisme peut entraîner l’injection de plus gros volumes.
2. Suite à l’injection, maintenir la pression de la seringue pendant 5 min améliorer la rétention des matières dans SMG (Figure 4) et le canal de Wharton. Inspecter la papille sous-maxillaire périodiquement pour s’assurer que tube ne ferme pas l’orifice du canal artériel.
3. À l’aide de pinces fines, saisir et retirer délicatement le tube les papilles sous-maxillaire.
   Remarque : Il est normal d’observer certains évacuation fluide de la papille.
4. Supprimer l’enrouleur et le coton de la cavité buccale avant de passer la souris de la scène.
   Remarque : L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. En outre, assurez-vous que la souris n’est pas logée avec d’autres souris jusqu'à ce que complètement guéri.

5. vérification et analyse

Remarque : An in vivo Imaging System (IVIS) peut être utilisé pour évaluer la rétention des nanoparticules fluorescent étiquetés après injection (comme indiqué 1 h et 24 h après l’injection dans la Figure 5).

1. Pour mieux visualiser un signal fluorescent au sein de la SMG à travers la peau, enlever la fourrure ventrale recouvrant le SMGs soit par rasage ou à l’aide d’un dépilatoires chimiques.
   Remarque : Après l’euthanasie, SMG tissu peut aussi être récolté, fixe (nuit à la paraformaldéhyde à 4 %) et souillé par immunohistochimie pour confirmer la persistance du NP fluorescent étiqueté un jour après l’injection (Figure 6).

Résultats

Retroductal injection peut être utilisée pour administrer NPs à la SMG murin (Figure 1). Ici, nous livrons 50 µg LMFP NPs étiqueté avec Texas Red fluorophore.

Positionnement correct de la souris permet l’accès facile et visualisation du plancher de la bouche (Figure 2 a-B). Les papilles sous-maxillaires sont identifiées comme deux protubéranc...

Discussion

Retroductal injection est critique pour la livraison de drogue localisé à la glande salivaire. Cette technique possède des applications dans le dépistage des agents thérapeutiques pour les conditions, y compris le syndrome de Sjögren et RIH^9,10,28. Administration des médicaments directement dans le SMG par injection retroductal fournit un avantage clé sur une administration systémique dans son potentiel à réduire les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pilocarpine hydrochloride	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-9	Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline Solution	Medline	RDI30296H	Saline
Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Curved Forceps
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Straight Forceps
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12	Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes	Fisher Scientific	22362566	Capillary tubes
Lubricant Eye Ointment	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	Statistical Software
Cotton tipped applicator	Medline	MDS202000	Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"	BD	7629	Syringe for intraperitoneal injection