JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز التكامل التحوير وإنتاج مؤسس الفئران المحورة وراثيا بكفاءة عالية بحقنه بسيطة ناقل لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني البويضات المخصبة.

Abstract

لما يقرب من 40 عاماً، يمثل حقن الحمض النووي برونوكلير الطريقة القياسية لتوليد الفئران المحورة وراثيا مع التكامل العشوائي المتسلسلات. هذا إجراء روتيني ويستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم، وأن العقبة الرئيسية تكمن في ضعف فعالية التكامل التحوير، أدى إلى انخفاض عائد من الحيوانات مؤسس. أدمجت في المائة عدد قليل فقط من ولد بعد زرع بويضات مخصبة حقن الحيوانات التحوير. على النقيض من ذلك، الناقلة لينتيفيرال أدوات قوية لنقل الجينات التكاملية واستعمالها ترانسدوسي بويضات مخصبة يسمح الإنتاج ذات كفاءة عالية لمؤسس الفئران المعدلة وراثيا وبمتوسط إنتاج أعلى من 70%. وعلاوة على ذلك، أي سلالة الماوس يمكن استخدامها لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا و penetrance التعبير التحوير مرتفعة للغاية، فوق 80% مع لينتيفيرال ترانسجينيسيس وساطة مقارنة microinjection الحمض النووي. حجم الجزء الحمض النووي التي يمكن أن تكون البضائع المتجهة لينتيفيرال يقتصر على 10 كيلو بايت ويمثل القيد الرئيسي لهذا الأسلوب. استخدام بسيطة وسهلة لإجراء الحقن تحت zona pellucida من بويضات مخصبة، يمكن أن تنتج أكثر من 50 مؤسس الحيوانات في جلسة واحدة من microinjection. هذا أسلوب تكييف عالية لأداء، مباشرة في الحيوانات مؤسس والربح السريع والخسارة للدراسات الدالة أو إلى مناطق الحمض النووي الجينومي الشاشة لقدرتها على ضبط وتنظيم الجينات التعبير في فيفو.

Introduction

العمل الريادي جوردون et al. في عام 1980 وأظهرت أن حقن الحمض النووي بلازميد في الذكور برونوكلي من بويضات مخصبة بعد زرع في الفئران بسيودوبريجنانت، يمكن أن تسفر عن إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي تدمج بلازميد الحمض النووي1. المظاهرة أن الثدييات المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد كان له تأثير هائل على علوم الحياة العالمية، وفتح الطريق إلى حقول جديدة من البحث سواء بالنسبة للعلوم الأساسية والعلوم الطبية الحيوية متعدية الجنسيات. في العقود الأربعة الماضية، أصبح الحمض النووي microinjection ممارسة روتينية. على الرغم من أن تم إنتاج عدد هائل من الفئران المحورة وراثيا، غير قابلة للاستخدام الكامل لجميع سلالات الماوس الطريقة القياسية ويتطلب وقتاً طويلاً باككروسيس2،3. تطبيقه على الأنواع الأخرى ويظل التحدي4 والعائد التكامل التحوير عموما تقتصر على نسبة قليلة من الحيوانات ولدت5. وباﻹضافة إلى ذلك، فعالية التكامل التحوير يمثل عاملاً يحد من يشرح العائد الإجمالي الفقراء pronuclear حقن الحمض النووي. وفي هذا الصدد، النواقل الفيروسية التكاملية هي الأدوات الأكثر فعالية لنقل البضائع وإدماج المتسلسلات وبالتالي يمكن أن توفر وسائل جديدة زيادة غلتها التكامل والقيد الوحيد هو أن الحجم التحوير الذي لا يمكن أن يتجاوز 10 كيلو بايت6 .

لينتيفيرال ناقلات الزائفة المكتوبة مع البروتين يأت من فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) هي أدوات نقل الجينات بانتروبيك وتكاملية عالية ويمكن استخدامها ترانسدوسي بويضات مخصبة7. Zona pellucida المحيطة بويضات حاجزاً فيروس طبيعي ويحتاج لتمريرها إلى السماح بتوصيل مع ناقلات لينتيفيرال. الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها بواسطة بويضات مخصبة ترانسدوسينج بعد الحفر الصغيرة أو إزالتها من8، zona pellucida9. ومع ذلك، يبدو الحقن تحت zona pellucida في الفضاء بيريفيتيليني أن أبسط طريقة للبيض المخصب كما هو موضح في البداية ب لويس والزملاء7ترانسدوسي.

حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات يسمح الغلات العالية في إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي أعلى من 70% حيوانات ولدت. هذا العائد ما يزيد على 10 إضعاف أعلى من عائد أفضل ما يمكن تحقيقه باستخدام معيار pronuclei الحمض النووي حقن7،10،11. وفي هذا السياق، سينشئ جلسة واحدة من حقن مؤسسي المحورة وراثيا على الأقل 50 (F0). ، ولذلك العدد الكبير من مؤسسي متوافق مع phenotyping أثر التحوير مباشرة أجريت على الفئران F0 دون الحاجة إلى إنشاء خطوط الماوس المحورة وراثيا. هذه الميزة تسمح للفحص السريع لتأثير التحوير وتكييف خصيصا لأداء في فيفو المكسب والخسارة للدراسات وظيفة في غضون أسابيع. وباﻹضافة إلى ذلك، العناصر التنظيمية الحمض النووي يمكن أيضا سرعة فحص لخريطة معززات وزخارف الحمض النووي ملزمة بالنسخ العوامل11،12. مع حقن برونوكليار، دمج المتسلسلات عادة نسخ متعددة كما في موضع فريد من نوعه. مع نواقل لينتيفيرال، يحدث التكامل في مواضع متعددة كنسخة واحدة كل10،موضع13. ولذلك، تعدد المكاني المتكامل الأكثر احتمالاً المرتبطة penetrance التعبير عالية جداً في مؤسسي المحورة وراثيا، مما يجعل هذا النموذج التي تم إنشاؤها جديدة أكثر قوة.

الأهم من ذلك، عند استخدام حقن برونوكليار للحمض النووي، التصور من برونوكلي أثناء الإجراء مطلوب على الإطلاق. يمنع هذا التقييد التقنية استخدام بويضات مخصبة مصدرها مجموعة كبيرة ومتنوعة من سلالات الماوس. ولذلك، إنتاج نموذج المعدلة وراثيا في محدد السلالة التي برونوكلي غير مرئية يتطلب إنتاج الحيوانات في سلالة متساهلة تليها على الأقل 10 باككروسيس المتعاقبة لنقل التحوير في الماوس المطلوبة سلالة. مع حقن متجه لينتيفيرال، بيريفيتيليني الفضاء دائماً مرئياً والحقن لا تتطلب مهارات محددة للغاية. على سبيل مثال، تم الحصول على موافقة/مشمولان الفئران المعدلة وراثيا التي لا تكون مناسبة لحقن برونوكلي مع حقن النواقل الفيروسية14.

هنا، يقدم بروتوكول شامل للسماح بإنتاج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الحقن لينتيفيرال المتجهات في الفضاء بيريفيتيليني جنين المرحلة خلية واحدة بسيطة. التعبير التحوير يسيطر مع أما في كل مكان أو المروجين الخلية المحددة يتم وصف بالتفصيل.

واستخدمت في هذه الدراسة15العمود الفقري لينتيفيرال ΔU3 بتريب. يسمح هذا متجه لإنتاج النسخ المتماثل ناقلات لينتيفيرال المعيبة التي تسلسل U3 جزئيا وحذفت لإزالة نشاط المروج U3 وتوليد متجه (سين) الذاتي إيناكتيفاتينج16. الأسهم ناقلات لينتيفيرال تم إنتاجها بواسطة عابر تعداء الخلايا HEK-293T مع p8.91 تغليف بلازميد (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6، فكمف-ز ترميز بروتين سكري-ز (منظمة) فيروس التهاب الفم الحويصلي17، و ΔU3 بتريب ناقل المؤتلف. ويرد الإجراء إنتاج مفصلة كأساليب تكميلية.

إنتاج مخزون متجه لينتيفيرال عيار عالية تتم تحت ظروف السلامة الأحيائية المستوى الثاني (BSL-2). وهذا صحيح بالنسبة لمعظم المتسلسلات باستثناء المسرطنة التي يمكن إنتاجها في BSL-3. ولذلك، يكفي بالإنتاج في ظروف BSL-2 لمعظم الحالات. وبالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون قطع الاستخدام والإنتاج لمعظم الوكالات التنظيمية الوطنية التي تتعامل مع الكائنات المحورة وراثيا (جينياً). ويمكن استخدام كميات محدودة من النسخ المتماثل غير كفء الخطيئة ناقلات لينتيفيرال (أقل من 2 ميكروغرام من البروتين قفيصه p24) تحت ظروف BSL-1 كما هو موضح بالوكالة "الفرنسية المعدلة وراثيا" بالاتفاق مع توصيات الاتحاد الأوروبي.

Protocol

كافة الإجراءات التي تشمل أعمال الحيوانات حصلوا على الموافقة الأخلاقية وقد أذنت بالوزارة الفرنسية للبحوث والتعليم تحت رقم أبافيس #5094-20 v6 16032916219274 و 05311.02. مرفق الحيوان ICM فينوبارك قد اعتمدتها وزارة الزراعة الفرنسية تحت رقم الاعتماد B75 13 19. البروتوكول الشامل يتطلب تنفيذ كل إجراء في إطار زمني محدد تم تلخيصها في الشكل 1.

1-الحيوان الشراء وإعداد المركبات الأساسية

  1. شراء الحيوانات
    1. ترتيب الذكور استؤصل الاسهر لديهم 25 B6CBAF1/جرج هي 8 أسابيع عمر (الجيل F1 من الأصل تقاطع بين ♀C57Bl/6JRj و ♂CBA/جرج).
      ملاحظة: عزل الذكور عند وصولهم. ويمكن إعادة استخدام الذكور استؤصل الاسهر لديهم لمدة سنة واحدة على الأقل.
      تغيير في الأقفاص كل ثلاثة أسابيع.
    2. ترتيب الإناث B6CBAF1/جرج 50 10 أسابيع عمر والحفاظ على مجموعة حيوانات على الأقل 50.
    3. تأمر C57BL/6JRj الذكور الخصبة التي 8 أسابيع سن 10-15.
    4. ترتيب 30 C57BL/6JRj الإناث هي 4 أسابيع عمر.
  2. التخدير والقتل الرحيم
    1. التخدير تتم باستخدام كمية من مزيج الكيتامين/إكسيلازيني 300μL، وحقن إينترابيريتونيلي (الكيتامين في جرعة 150μg/غرام من وزن الجسم، إكسيلازيني بجرعة 0.15μg/غ وزن جسم). وتوضع الحيوانات تحت تدفئة وسادة لضبط درجة حرارة الجسم. التحقق من ردود الفعل معسر ذيل الحيوان قبل بدء هذا الإجراء.
    2. وكان يؤديها القتل الرحيم التفكك عنق الرحم. قطع الرأس وقد أدرج كوسيلة ثانوية لتأكيد وفاة الحيوان. كان تنفيذ القتل الرحيم للأجنة بقطع الرأس.
      ملاحظة: عند وصولهم، تتيح للحيوانات كحد أدنى أسبوع 1 روض للمرفق (لا معالجة أو التزاوج). الأهم من ذلك، يمكن أن تستخدم أي سلالات الماوس بما في ذلك خطوط محوره وراثيا كخصوبة الذكور والإناث الخصبة سوبيروفوليشن. ينبغي اختيار سلالة وفقا لمتطلبات السؤال العلمي.
  3. إعداد هرمون
    1. إضافة ميليلتر 910 من المخزن المؤقت بسمج (تروج مصل الفرس الحامل) إلى 1 فيال بمسج المجففة بالتبريد وجعل 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل قاسمة يحتوي على واجهة المستخدم 55 للفئران 11. ابدأ إبقاء بمسج مختبرين لأكثر من أسبوعين بعد أول استخدام.
    2. إضافة المجففة بالتبريد 2730 ميليلتر من قوات حرس السواحل الهايتية (الإنسان المشيمية تروج) المخزن المؤقت 1 فيال قوات حرس السواحل الهايتية. جعل 100 ميليلتر مختبرين، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل قاسمة يحتوي على واجهة المستخدم 55 للفئران 11.
  4. إعداد البروتين السكري المثبط
    1. إعادة تشكيل 1 قنينة من البروتين السكري المثبط مع 3 مل من M2 المتوسطة للحصول 10 ملغ/مل الحل الأسهم وجعل 50 ميليلتر مختبرين. ثم تخزينها في-20 درجة مئوية.
  5. إعداد أدوات الجراحة
    1. تعقيم كل أدوات الجراحة باستخدام اﻷوتوكﻻف.

2-سوبيروفوليشن للمانحين الإناث

  1. في منشأة حيوان باستخدام ح 12 يوم-دورات ليلة، حقن بمسج الساعة 02:00 م-3 في اليوم. حقن قوات حرس السواحل الهايتية في الساعة 12 يوم-1 ورفيقه بخصوبة الذكور فقط بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن.
  2. في يوم-3، أضف 1 مل محلول كلوريد الصوديوم 0.9% العقيمة إلى قاسمة 1 من 100 ميليلتر من بمسج (55 UI). حقن 10 C57BL/6JRj الإناث مع 100 ميليلتر إينترابيريتونيلي باستخدام المحاقن دون أي حجم القتلى.
    ملاحظة: سوف تتلقى كل الماوس واجهة المستخدم 5 من بمسج.
  3. في يوم-1، أضف 1 مل محلول كلوريد الصوديوم 0.9% العقيمة إلى قاسمة 1 من 100 ميليلتر من قوات حرس السواحل الهايتية (55 UI). حقن الفئران التي تلقت حقن بمسج مع 100 ميليلتر من حل قوات حرس السواحل الهايتية المخفف (5UI) إينترابيريتونيلي. استخدام المحاقن دون أي حجم القتلى. إجراء الحقن ببطء والانتظار قبل إزالة الإبرة حيث أن عدم تسرب السائل.
    ملاحظة: سوف تتلقى كل الماوس واجهة المستخدم 5 من قوات حرس السواحل الهايتية. وينبغي إجراء حقن من قوات حرس السواحل الهايتية ح 46 بعد بمسج.
  4. ضع كل أنثى C57BL/6JRj في القفص مسمار من الذكور مباشرة بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن.
  5. فحص المهبل المقابس صباح اليوم 0 واستخدام الإناث الإيجابية لجمع البويضات المخصبة.

3-إعداد "الإناث" جرج B6CBAF1/بسيودوبريجنانت

  1. ورفيقه أحد الذكور استؤصل الاسهر لديهم اليوم قبل جمع البيض (اليوم-1) مع 2 B6CBAF1/جرج الإناث في 05:00 م.
    ملاحظة: من المهم جداً إلى رفيقه مع الإناث التي تنشأ من أقفاص مختلفة لتجنب تزامن دورات الإناث. وهذا سيزيد العائد من الحصول على المقابس المهبلية. وبالإضافة إلى ذلك، لا تضيف أنثى إلى قفص ذكور التي تغيرت في غضون الأيام الماضية 2. هو زيادة فعالية السلوك الإنجابي في الذكور عند القفص القذرة.

4. جمع البويضات المخصبة

  1. إعداد
    1. إضافة ميليلتر 1450 م 2 إلى حل مخزون البروتين السكري المثبط لإعداد الحل العامل البروتين السكري المثبط.
    2. ضع قطره واحدة من 100 ميليلتر من البروتين السكري المثبط العامل حل كل أنثى المستخدمة لإنتاج البيض المخصب في 100 مم طبق بيتري وتبقى في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة 500 ميليلتر من M16 في لوحات 4 آبار. استخدام الآبار 2 كل نوع من ناقلات لينتيفيرال التي سيتم حقنها: واحدة كذلك ستحتوي البيض المحقون والآخر منها غير مدخلة. ضع 4 لوحات جيدا في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع جو2 CO 5%.
  2. إعداد الماصات لجمع ومعالجة الأجنة.
    1. تنعيم الزجاج الهيماتوكريت الشعيرات الدموية (75 ملم/60 ميليلتر) عن طريق تناوب مركز الأنابيب الشعرية الثابت الزجاج في اللهب.
    2. إزالة الشعيرات الدموية من الحرارة في أسرع وقت ممكن، وسحب للحصول على أنبوب مع قطرها داخلي لحوالي 300 ميكرون. السحب على أنابيب تبريد للحصول على استراحة نظيفة.
  3. جمع أوفيدوكتس.
    1. Euthanize C57BL/6JRj الإناث بخلع عنق الرحم في 09:00 ص في اليوم 0. ويتأكد الإعدام بقطع الرأس.
      ملاحظة: هذا الأسلوب القتل الرحيم وافق IACUC وفيما يلي التوصيات الأوروبية.
    2. إجراء شق أفقي كبير لفتح التجويف البطني مع المقص. وتقع قناة بين الرحم والمبيض.
    3. إزالة ميسوميتريوم والغشاء الذي يحمل الأوعية الدموية بارزة مع منحنى ملقط.
    4. منفصلاً في قناة المبيض مع الملقط منحنية.
    5. استخدام الملقط منحنية كدليل لقطع قناة من المبيض باستخدام مقص منحنى.
    6. سحب قناة وقطع من الرحم مع مقص منحنى.
      تنبيه: لا تلمس ampulla منتفخة يحتوي على البيض المخصب. تنفيذ الإجراء بأكمله باستخدام أدوات معقمة.
    7. ضع أوفيدوكتس التي جمعت كل في المتوسط M2 (طبق الثقافة 35 ملم) في درجة حرارة الغرفة
    8. ضع أوفيدوكتس 2 في نفس قطره 100 ميليلتر من البروتين السكري المثبط العامل الحل (0.3 مغ/مل).
  4. إزالة خلايا الركام من البويضات المخصبة.
    1. تحت ستيريوميكروسكوبي، استخدام محاقن الأنسولين 2: أول واحد للاحتفاظ قناة وثانية واحدة تمزيق في ampulla وتفريق يخصب البيض في المحلول العامل البروتين السكري المثبط.
    2. تأخذ بيبيت الزجاج معدّة لجمع البيض وتوصيله إلى الأنبوب وعامل تصفية 0.22 ميكرومتر التي شنت على لسان نضح كل البيض. جمع كل البيض وغسلها بمرور المتعاقبة في 6 قطرات مختلفة من 100 ميليلتر من المتوسطة M2.
    3. تغسل مكان البويضات المخصبة إلى حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع جو من 5% CO2 في المتوسط M16.

5-صنع الحقن الماصات

  1. استخدام أنابيب شعرية زجاجية رقيقة الجدران (10-15 سم) مع خارج قطر من 1 مم والمشبك هذا شعري إلى ساحبة ميكروبيبيتي الأفقي.
    ملاحظة: في معظم الأفقي ماصة جر، 3 معلمات يمكن تعديلها: الطاقة الحرارية، سحب قوة ووقت التأخير بين التدفئة وسحب. ضبط هذه المعلمات للحصول على بيبيتس عن طريق الحقن مشابهة لتلك المعروضة في الشكل 2 ألف. للمستخدمين الذين يؤدون بشكل روتيني microinjection الحمض النووي، استخدم الإعدادات القياسية وضبط التأخير بين التدفئة وسحب لتغيير شكل عالمي من طرف ماصة.

6-جعل عقد الماصات

  1. استخدم ماصة حقن لإعداد ماصة القابضة.
  2. إرفاق ماصة حقن ميكروفورجي. قطع الماصة مع ميكروفورجي للحصول على تلميح متناظرة حادة من 80 إلى 100 ميكرومتر القطر. ثم البولندية التلميح مع الحرارة في ميكروفورجي للحصول على شكل دائري متناظرة دون تحوط حادة.

7-إعداد ماصة الحقن التي تحتوي على ناقل لينتيفيرال

  1. الطرد المركزي تعليق متجه لينتيفيرال في ز 160 x لمدة 2 دقيقة بيليه الحطام موجودة غالباً في الأرصدة المجمدة لينتيفيرال.
  2. استعادة المادة طافية وتحويلها إلى أنبوب 0.5 مل جديدة في فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.
  3. نقل 1 ميليلتر من المادة طافية إلى ماصة حقن إعداد كما هو موضح في الخطوة 5 استخدام محمل الصغرى.
  4. تعيين ماصة حقن على حامل الصك ميكرومانيبولاتور الصحيح. قم بتوصيل بيبيت عقد ميكرومانيبولاتور اليسرى.
    ملاحظة: عيار توصيل ناقل لينتيفيرال سوف تكون مرتبطة ارتباطاً مباشرا بفعالية إنتاج مؤسس. لكفاءة عالية (> 70%)، استخدام النواقل الفيروسية مع عيار في نطاق 100 نانوغرام من p24 البروتين قفيصه/ميليلتر. عندما يتم التعبير عنها عيار كوحدات توصيل (تو)، ينبغي أن تكون عيار أعلى 109 تي يو/مليلتر. يجب أن تنتج مخزونات متجه لينتيفيرال طريق عابر تعداء الخلايا 293T مع بلازميد انكابسيديشن p8.91، فكمف-ز، ترميز (منظمة) فيروس التهاب الفم الحويصلي بروتين سكري-ز كما هو موضح في أساليب تكميلية18.

8-مايكرو--حقن

  1. الاستغناء عن 8 ميليلتر من المتوسطة M2 في وسط الشريحة الاكتئاب والغطاء مع زيت البارافين الخفيفة (اختبار الأجنة) لتجنب التبخر.
  2. 20 مكان البيض إلى الانخفاض كما فرقت أقل قدر ممكن.
    تنبيه: لا تجعل فقاعات عند إيداع الأجنة.
  3. تأكد من أن طرف ماصة حقن مفتوح. إذا لم يكن الأمر كذلك، انقر ماصة حقن مع ماصة عقد.
  4. تعيين ميكروينجيكتور النسبة لوقت حقن 20 ثانية.
    ملاحظة: يسمح لزوجة تعليق الفيروسية تصور واضح تشتت النواقل الفيروسية في الفضاء بيريفيتيليني. ينبغي تعديل ضغط الحقن لملء المساحة الكاملة داخل 20 ثانية حقن، الذي يمثل وحدة تخزين من 10 إلى 100 pl. وينبغي إلا يتجاوز الضغط حقن 600 hPa.
  5. نضح البويضة المخصبة واحدة تحتوي على نويات برو 2 والهيئات القطبي 2 مع ماصة عقد تحت ستيريوميكروسكوبي.
  6. حقن البيضة مع ميكروينجيكتور استخدام الإعدادات الموضحة في 8.4، في الفضاء بيريفيتيليني.
    تنبيه: لا تلمس غشاء البلازما مع بيبيت الحقن.
  7. حقن البويضات المخصبة كلها متاحة على دفعات من 20 البيض ووضع البيض المحقون فورا في حامية قبل M16 المتوسطة في حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع جو من أول أكسيد الكربون 5%2.
    ملاحظة: احتضان البيض حقن لمدة 30 دقيقة بعد الحقن قبل نقل الجنين.

9-نقل الأجنة إلى الإناث جرج B6CBAF1/بسيودوبريجنانت

  1. تحقق الجماع التوصيل ح 16 بعد التزاوج B6CBAF1/جرج الإناث مع الذكور B6CBAF1/جرج استئصال الاسهر. القيام بذلك فقط قبل البدء في جمع البيض.
  2. إعداد الماصات زرع الجنين حقن.
    1. جعل الماصات غرس للأجنة كما هو موضح لجمع ومعالجة الأجنة (الخطوة 4، 2). حدد الماصات مع قطر داخلي لحوالي 150 ميكرومتر مع جزء ضيق حوالي 4-5 سم في الطول.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون التلميح لهب مصقول، بغية الحد من الأضرار المحتملة للبيض أو في قناة.
      1. ملء مع زيت البارافين الخفيفة (اختبار الأجنة) فقط فوق الكتف ماصة.
      2. نضح فقاعة هواء صغيرة، ثم المتوسطة M2، وأخيراً فقاعة هواء ثانية.
      3. وضع الأجنة واحداً وراء الآخر لتقليل الحجم الكلي للمتوسطة التي سيتم ضخها في قناة جنبا إلى جنب مع الأجنة.
      4. الانتهاء من تحميل قطره قليل جداً من زيت البارافين الخفيفة (اختبار الأجنة) لعرض الجنين عن أحد.
        تنبيه: أن يكون لطيف أثناء معالجة الماصة.
  3. نقل الأجنة.
    1. تعقيم جميع الصكوك.
    2. تخدير الأنثى باستخدام حقن داخل 300 ميكروليتر معقمة كلوريد الصوديوم 0.9% الحل الذي يحتوي على 150 ميكروغرام كل غم وزن الجسم من الكيتامين و 0.15 ميكروغرام كل غم وزن الجسم من إكسيلازيني.
    3. تحقق من عمق التخدير معسر ذيل الحيوان بالملقط وحقن سوبكوتانيولي 0.1 مغ/كغ من مسكن (البوبرينورفين) قبل بدء هذا الإجراء.
    4. حلق 2 سم على كلا الجانبين من الخلف على طول الحبل الشوكي على مستوى الضلع الأخير.
    5. ضع الماوس الإناث على وسادة تدفئة، وفي حقل عقيمة. قطع نافذة 2 سم × 2 سم في منتصف الجزء الخلفي الماوس.
    6. شريحة الجلد جانبياً حتى المبيض (اللون البرتقالي) مرئياً من خلال جدار الجسم وجعل شق عرضية 1 سم بالمقص، ثم تطبيق حلاً مطهر (10% البوفيدون يوديد) على الجلد.
    7. جعل شق 5 ملم في جدار الجسم فقط فوق المبيض مع المقص غرامة تحت مجهر جراحي.
    8. تلتقط لوحة الدهون مع المشبك لدغ أتروماتيك وسحب المبيض وقناة في الجزء العلوي من الرحم.
    9. تصور في ampulla وجعل من هيميسيكشن مع مقص فانس في الجزء المتعلق بقناة تربط المبيض إلى أمبالا.
    10. إدخال الماصة الجنين نقل وتوصيل البيض إلى أمبالا، وتوقف عند أول فقاعة هواء في ماصة غرس.
    11. تكرار الإجراء على قناة ثانية.
    12. قرب الجلد مع مقاطع الجرح.
    13. مكان الحيوان في الاسترداد الدائرة (39 درجة مئوية، 30-60 دقيقة) حتى مستيقظا تماما.
    14. كرر حقن مسكن بعد ح 12 و 48 ساعة في حالة علامات الألم أو المعاناة.
    15. إزالة مقاطع الجرح 7-10 أيام بعد الجراحة.
    16. الاختيار مزروع الإناث للحمل باتباع ما منحنى وزن كل 3 أيام بعد زرع. كبيرة في الوزن يمكن ملاحظتها بعد زرع أيام من 10 إلى 12 وسوف يكون مؤشرا للحمل.
      ملاحظة: تمثل جميع الأجنة التي ستضع هنا الإرادة المفترضة مؤسسي المحورة وراثيا. يمكن تحليل النمط الظاهري لمؤسسي هذه في أي من مراحل النمو، أو بعد الولادة وفقا للمسألة العلمية المرتبطة بتوليد هذه الحيوانات المحورة وراثيا.

10-التنميط مؤسسي المحورة وراثيا

  1. الاستعداد الوراثي المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 8؛ 5 مم يدتا، pH 8.0 مع الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% (w/v)، 50 مم كلوريد الصوديوم. تعقيم المخزن المؤقت الوراثي من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  2. وضع الأغشية اكسترامبريونيك (للأجنة) أو قطعة صغيرة من الذيل (للحيوانات المولود) إلى 500 ميليلتر لتصفية المخزن المؤقت للتنميط وإضافة 15 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل). تبني بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي ليساتي في س 15,000 ز لمدة 5 دقائق ومن ثم استخدام 1 ميليلتر من المادة طافية لتفاعل PCR. ويمكن تخزين ليستي عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. أداء [بكر] تضخيم جزء من التحوير حجم رد فعل ميليلتر 20 يحتوي على المخزن المؤقت x PCR 1، 1.5 مم مجكل2، 200 ميكرومتر دنتبس، 0.2 ميكرون لكل كبسولة تفجير بكر، 1 UI بوليميراز الدنا بوليميراز و 1 ميليلتر من كل عينة هضمها. كعنصر تحكم سلبية، استخدم 1 ميليلتر من H2o. كعنصر إيجابي، استخدام الحمض النووي من بلازميد متجه لينتيفيرال المتضمن في التحوير.
  5. للكشف عن اجفب ووصف الاستخدام:
    اجفب "إلى الأمام" التمهيدي: 5 '3' جاككاكاتجاجكاجكاكجاكتكت
    اجفب "عكس التمهيدي": تكتجكتجتاجتجتكجكجاجكت 3 '5'
  6. أداء [بكر] تضخيم في ثيرموسيكلير: 4 دقيقة في 94 درجة مئوية تليها دورات 35 من 1 دقيقة في 94 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية، و 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  7. تحميل المنتج بكر على 2% [اغروس] هلام من أجل تصور 300 شركة بريتيش بتروليوم اجفب بكر منتج كما هو موضح في الشكل 2.
    ملاحظة: جميع الأفراد عرض فرقة بكر bp 300 أدمجت التحوير اجفب ويمكن اعتبار الوراثي.
  8. تحليل التعبير التحوير في الحيوانات المحورة وراثيا. على سبيل المثال، تنفيذ غذائها و immunostaining كما هو موضح في الشكل 3 و 4 الشكل والموصوفة في أساليب تكميلية.
    ملاحظة: كل تحليل التعبير التحوير وتحليل النمط الظاهري ينبغي أن يؤديها باستخدام أساليب ذات الصلة وفقا للمسألة العلمية العالمية.

11-التحديد الكمي لعدد النسخ التحوير

  1. إعداد عينات من الحمض النووي ل PCR الكمي.
    1. استخراج الحمض النووي (جدنا) من "ك بروتيناز" ليساتي التي تم الحصول عليها في الخطوة 10.3 باستخدام مجموعة أدوات تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    2. قياس جدنا التي كانت في 260 نيوتن متر.
    3. تمييع كل عينة جدنا إلى تركيز نهائي 10 نانوغرام/ميليلتر.
    4. لكل عينة، وإعداد 5 تخفيف المسلسل (1:5) في ح2س للحصول على أنابيب 6 في التركيزات التالية: 10 نانوغرام/ميليلتر، 2 نانوغرام/ميليلتر، 0.4 نانوغرام/ميليلتر، 0.08 نانوغرام/ميليلتر، 0.016 نانوغرام/ميليلتر و 0.0032 نانوغرام/ميليلتر
  2. إعداد مزيج تفاعل PCR (qPCR) الكمية.
    1. إعداد ميكس التمهيدي ل qPCR. لكل زوجين التمهيدي لاستخدام qPCR، إضافة 10 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (حل الأسهم التمهيدي من 100 ميكرومتر)، 10 ميليلتر لعكس التمهيدي (100 ميكرومتر) وميليلتر 80 H2o.
      ملاحظة: لتضخيم اجفب، استخدم كبسولة تفجير تككاجاجكجكاككاتكتكتكا إلى الأمام وعكس تجاتجككجتكتكتجكتجتكج. جين Cdx2 كالأمور إلى حالة طبيعية ل qPCR (2 نسخة من كل الجينوم). للأمور إلى حالة طبيعية Cdx2 استخدام كبسولة تفجير جككاججاكتاتكااكتاكاج إلى الأمام وعكس جاكتكجتكاجتككاجكتاتكت
    2. إعداد 2 qPCR يمزج، أحدهما مع ميكس التمهيدي اجفب والآخر مع Cdx2 التمهيدي مزيج. إعداد مزيج qPCR كافية لتضخيم تخفيف 6 في التكرارات لكل جدنا. رد فعل qPCR واحد يحتوي على ميليلتر 3.8 ح2س، 5 ميليلتر من 2 أخضر فلوري س رد فعل مزيج و 0.2 ميليلتر من ميكس التمهيدي.
      ملاحظة: لكل الحيوانات المحورة وراثيا لاختبار، سيتم تنفيذ 24 qPCR ردود الفعل. مزيج رد فعل منصوص عليه آلة 384 qPCR جيدا.
    3. لكل الحيوانات لاختبار، توزيع: 12 بئرا مع ميليلتر 9 اجفب قبكر المزيج والآبار 12 مع 9 ميليلتر من مزيج قبكر Cdx2. إضافة 1 ميليلتر من كل تمييع جدنا 2 الآبار التي تحتوي على مزيج قبكر اجفب والآبار 2 التي تحتوي على مزيج قبكر اجفب.
    4. مزيج الآبار إجازة 2 لكل قبكر في جدنا الذي كان يحل ح2س كمراقبة سلبية.
  3. ضع لوحة جيدا 384 في الجهاز قبكر وتطبيق البروتوكول قيد التشغيل التالية: 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية ثم 50 دورات من 10 s في 95 درجة مئوية و 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
  4. تحليل البيانات. بالنسبة لكل جدنا لاختبار، رسم القيم المقطعية كدالة لسجل جدنا إجمالي المبلغ (6 نقاط في تكرارات). تناسب المنحنى باستخدام الانحدار الخطي باستخدام الأسلوب الأقل مربعة واستقراء Ct القيمة المقابلة للتقاطع مع محور y. استخدام قيم المستنتجة Ct اجفب و Cdx2 طبيعية لحساب عدد نسخ اجفب بالنسبة Cdx2 (2 نسخ) باستخدام أسلوب قياسي 2ΔdCt 11.

النتائج

الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول المعروضة هنا. الممثل النتائج على حد سواء في كل مكان ويتم توضيح نوع الخلية المحددة التحوير التعبير.

التعبير التأسيسي المتسلسلات

دعاة في كل م...

Discussion

حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات في بويضات مخصبة الموصوفة هنا أدت إلى إنتاج أجنة معدلة وراثيا التي أسفرت عن أكثر من 70% أجنة المعدلة وراثيا بالقياس إلى مجموع عدد الأجنة التي تم جمعها. هذه النتيجة تتسق مع التقارير السابقة وتجسد خصوصية الإجراء2،،من7

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر دومون مجلي وميلوني رولاندو لقراءة نقدية من المخطوطة وإيفيكتور و "فينوبارك ICM النوى" للمساعدة التقنية في إنتاج ناقلات لينتيفيرال والحيوان السكن على التوالي. هذا العمل كان يدعمه دي ترانسلاتيونليس المعهد الجامعي هوسبيتالو "دي علوم الأعصاب" باريس، رامي-A-ICM، يشرف دعفينير ANR-10-إيايهو-06. العلاقات العامة وتلقى التمويل للفرنسية Langue de الرابطة من أجل دراسات دو Diabète et des علل Métaboliques (الفيديام) ومن JDRF مشترك/منح INSERM.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
100 mm petri dishDutsher353003
4 wells Nunc dishDutsher56469IVF dish
M2 mediumSigmaM7167
M16 mediumSigmaM7292
0,22 µm Syringe filterDutsher146611
Hyaluronidase Enzyme 30mgSigmaH4272mouse embryo tested
Insulin seryngeVWR613-3867Terumo Myjector
Curved forcepsMoria2183
Curved scissorsMoriaMC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigmaA5177-5EA
Borosilicate glass capillariesHarvard apparatusGC 100-10
Horizontal micropipette pullerNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Inverted microscopeNikonTransferman NK2 5188Hoffman modulation contrast illumination is required
MicromanipulatorEppendorfCelltram air
Controler of holding pipetEppendorfFemtojet
Mineral oilSigmaM8410mouse embryo tested
MicroinjectorEppendorfFemtojetCan be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forcepsMoriaMC 40
vannas micro scissorsMoria9600
IsofluranecentravetISO005ISO-VET 100% 250ml
ocrygelcentravetOCR002
Povidone iodurecentravetVET001vetedine 120ml
BuprenorphinecentravetBUP002Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HClSigmaT5941Trizma hydrochloride
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653powder
proteinase KSigmaP2308 
oneTaq kitNEBM0480L
PrimersEurogentec
Strip of 8 PCR tube4titude4ti-0781
96 well thermal cyclerApplied Biosystems4375786Veriti
Genomic DNA mini kitinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master mixRoche4887352001SYBR Green 
Multiwell plate 384Roche5217555001
qPCR instrument 384 wellRoche5015243001LightCycler 480

References

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved