慢病毒载体介导的转基因小鼠生产: 一种简单高效的创始人直接研究方法

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以促进转基因基因的整合和生产的创始人转基因小鼠的高效能, 通过简单的注射慢病毒载体载体在 perivitelline 空间的受精卵母细胞。

摘要

近40年来, 显微 DNA 注射液代表了转基因随机积分法生成转基因小鼠的标准方法。这种常规程序在世界范围内得到了广泛的应用, 其主要局限性在于转基因整合效果较差, 导致了创始人动物的低产量。在注射受精卵母细胞植入后出生的动物中, 只有很少一部分能整合转基因。相比之下, 慢病毒载体载体是整合基因转移的有力工具, 它们用于传感器受精的卵母细胞能够高效地生产出具有70% 以上平均产量的创始人转基因小鼠。此外, 任何小鼠菌株都可用于生产转基因动物, 显性的转基因表达极高, 高于 80%, 慢病毒载体介导转基因与 DNA 显微注射相比。慢病毒载体向量可以是货物的 DNA 片段的大小限制在 10 kb, 代表了该方法的主要局限性。在受精卵母细胞的透明透明下, 使用简单而容易执行的注射程序, 可以在单次显微注射中生产超过50种创建者动物。这种方法是高度适应的, 直接在创始人动物, 快速增益和丧失功能研究或筛选基因组 DNA 区域的能力, 以控制和调节基因表达在体内。

引言

戈登等在1980年的开创性工作表明, 在 pseudopregnant 小鼠植入后, 将质粒 DNA 注入受精卵母细胞的雄性pronuclei , 可以产生转基因动物的生产, 整合了质粒 DNA¹。转基因哺乳动物的形成对全球生命科学产生了巨大的影响, 为基础科学和转化生物医学科学开辟了新的研究领域。在过去的四年里, DNA 微注射已经成为一种常规的做法。虽然已经生产了大量的转基因小鼠, 但标准方法对所有的老鼠菌株都没有充分的用处, 需要耗费时间 backcrosses^2,3。它对其他物种的应用仍然具有挑战性⁴ , 转基因综合产量仅限于出生动物的少数比例⁵。此外, 转基因整合的功效是解释显微 DNA 注射液整体产量差的限制因素。在这方面, 集成的病毒载体是最有效的工具, 以货物和集成转基因, 从而可以提供新的手段, 以显著提高整合产量, 唯一的限制是, 转基因大小不能超过 10 kb⁶.

慢病毒载体载体伪类型与囊性口炎病毒 (VSV) 包络蛋白是以泛热带和高度整合的基因转移工具, 可用于传感器受精卵母细胞⁷。卵母细胞周围的透明透明是一种天然的病毒屏障, 需要通过它来允许慢病毒载体载体的转导。转基因动物是由传感受精卵母细胞在微钻孔或清除透明透明^8,9产生的。然而, 在 perivitelline 空间的透明透明下注射似乎是最简单的方法, 传感器的受精卵, 最初描述的露易丝和同事⁷。

perivitelline 注射慢病毒载体载体, 可使转基因动物的产量高出70% 以上的出生动物。这种产量超过10倍以上的最佳产量, 可以达到使用标准pronuclei DNA 注射^7,10,11。在这种情况下, 单一的注射疗程将产生至少50个转基因创始人 (F0)。因此, 大量的创始人是兼容分型的转基因效果直接执行对 F0 小鼠不需要产生转基因鼠标线。这种优势允许快速筛选的转基因效果, 并特别适应于执行在体内增益和丧失功能研究在几周之内。此外, 调控 DNA 元素也可以快速筛选, 以绘制促进剂和 DNA 图案绑定的转录因子^11,12。随着显微注射, 转基因通常集成为多个副本在一个独特的轨迹。使用慢病毒载体向量, 集成在多个位点中作为每个轨迹^10、13的单个拷贝出现。因此, 综合基因座的多样性很可能与转基因创始人所观察到的极高表达显性有关, 这使得新生成的模型更加健壮。

重要的是, 当使用显微注射 DNA 时, pronuclei过程中的可视化是绝对必要的。这一技术限制防止了受精卵母细胞的使用来自于大量的小鼠菌株。因此, 在特定菌株中生产一种pronuclei是不可见的转基因模型, 需要在允许的应变下生产动物, 随后至少有10个连续 backcrosses 在所需的小鼠中转移转基因。应变。通过慢病毒载体矢量注射, perivitelline 空间始终可见, 注射不需要高度特异的技能。以¹⁴的病毒载体注射液为例, 对不适合pronuclei注射液的转基因小鼠进行了点头/免疫治疗。

在这里, 提出了一个全面的协议, 以允许简单生产的转基因小鼠使用慢病毒载体载体注射在 perivitelline 空间的一个细胞阶段胚胎。本文详细介绍了用无处不在或细胞特异促进剂控制的转基因表达。

pTrip ΔU3 慢病毒载体骨干在本研究中使用¹⁵。这个向量允许产生复制缺陷的慢病毒载体向量, 其中 U3 序列被部分删除以移除 U3 启动子活动并生成自失活向量 (SIN)¹⁶。慢病毒载体载体是通过对 HEK-293T 细胞的瞬态转染与 p8.91 封装质粒 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, pHCMV g 编码的水泡性口炎病毒 (VSV) 糖蛋白-g¹⁷, pTRIP ΔU3重组载体。详细的生产过程作为补充方法提供。

在生物安全二级条件下 (BSL-2) 进行高效价慢病毒载体载体的生产。对于大多数转基因来说, 这是正确的, 除了必须在 BSL-3 中产生的癌基因。因此, 大多数情况下, 生产 BSL-2 条件是足够的。此外, 大多数国家管理机构处理转基因生物 (转基因) 的使用和生产通常是脱节的。有限数量的复制无能的罪慢病毒载体载体 (低于2µg 的 p24 衣壳蛋白) 可在 BSL-1 条件下使用, 如法国转基因机构与欧洲联盟的建议所述。

研究方案

包括动物工作在内的所有程序都获得了道德上的批准, 并得到法国研究和教育部的批准, APAFIS#5094-20 16032916219274 v6 和05311.02 号。ICM 动物设施 PHENOPARC 已被法国农业部认可的认证编号 B75 13 19。总体协议要求在图 1中总结的精确时间范围内执行每个过程。

1. 动物购买和基本化合物的制备

1. 动物购买
   1. 命令25输精管切除术男性 B6CBAF1/JRj 8 周的年龄 (F1 世代从原始的十字架在♀C57Bl 之间或 6 JRj 和♂CBA 或 JRj)。
      注意: 在到达时隔离雄性。输精管切除术雄性可以被重新使用至少一年。
      每3周换一次笼子。
   2. 订购 50 B6CBAF1/JRj 10 周的女性, 并保持至少50只动物的游泳池。
   3. 订购 10-15 C57BL/6JRj 8 周龄的肥沃雄性动物。
   4. 订购 30 C57BL/6JRj 4 周龄的女性。
2. 麻醉和安乐死
   1. 麻醉是使用大量的300μL 氯胺酮/甲苯噻嗪混合, 注射腹腔 (氯胺酮的剂量 150μg/克体重, 甲苯噻嗪的剂量 0.15μg/g 体重)。动物被放在加热垫下调节体温。在开始手术前捏紧动物的尾巴来检查反射。
   2. 安乐死是由颈椎脱位进行的。斩首被列为一种辅助方法, 以确认动物死亡。胚胎的安乐死是通过斩首进行的。
      注意: 到达后, 允许动物至少1周习惯到设施 (没有处理或交配)。重要的是, 任何老鼠菌株, 包括转基因线, 都可以作为肥沃的雄性和肥沃的雌性来进行超数排卵。应变的选择应根据科学问题的要求进行。
3. 激素制剂
   1. 将910µL 的 PSMG (孕母马血清促性腺激素) 缓冲剂加入1冻干 PMSG 瓶中, 使100µL 整除数, 并贮存在-20 摄氏度。
      注: 每个整除包含55个用户界面, 用于11只鼠标。第一次使用后, 切勿将 PMSG 整除数超过2星期。
   2. 添加2730µL 的 hCG (人绒毛膜促性腺激素) 缓冲成1冻干 hCG 瓶。使100µL 整除数, 并存储在-20 摄氏度。
      注: 每个整除包含55个用户界面, 用于11只鼠标。
4. 透明质酸酶制剂
   1. 用3毫升的 M2 培养基重建1瓶透明质酸酶, 获得10毫克/毫升的库存溶液, 并使50µL 整除数。然后存储在-20 摄氏度。
5. 手术工具准备
   1. 使用高压釜消毒所有手术工具。

2. 女性捐助者的超数排卵

1. 在动物设施使用12小时昼夜周期, 注射 PMSG 在下午2点在3天。在 - 1 天上午 12 点注射 hcg , 并在 hcg 注射后与肥沃的雄配。
2. 在3天, 添加1毫升的无菌 0.9% NaCl 溶液成1整除100µL 的 PMSG (55 UI)。注射 10 C57BL/6JRj 女性与100µL 腹腔使用注射器没有任何死容量。
   注意: 每只鼠标将收到5个 PMSG UI。
3. 在1天, 添加1毫升的无菌 0.9% NaCl 溶液成1整除的100µL 的 hCG (55 UI)。注射接受 PMSG 注射液的小鼠, 100 µL 稀释 hCG 溶液 (5UI) 腹腔。使用注射器没有任何死容量。缓慢执行注射, 并在取出针头前等待, 使液体不会泄漏。
   注意: 每只鼠标都会收到5个 hCG 的 UI。注射 hCG 应在 PMSG 后46小时进行。
4. 在 hCG 注射后, 将每个 C57BL/6JRj 雌性直接放置在雄螺柱的笼中。
5. 检查0天早上的阴道插头, 并使用阳性雌性来收集受精卵。

3. 准备 B6CBAF1/jRj Pseudopregnant 女性

1. 交配一输精管切除术男性前一天蛋收集 (天-1) 与 2 B6CBAF1/JRj 女性在下午5点。
   注意 : 与来自不同笼子的雌配是非常重要的 , 以避免女性周期的同步。这将提高获得阴道插头的收益率。此外, 不要在过去2天内改变的男性笼中添加女性。当笼子脏的时候, 雄性的生殖行为效果会增加。

4. 受精卵的收集

1. 制备
   1. 添加1450µL M2 到透明质酸酶溶液中, 制备透明质酸酶的工作溶液。
   2. 放置一滴100µL 的透明质酸酶工作溶液每位女性用于生产受精卵在100毫米培养皿和保持室温。
   3. 将500µL 的 M16 加入4井板中。使用2井每种类型的慢病毒载体向量将被注射: 一个井将包含注射鸡蛋和其他非注射的。安置4井板材在孵化器在37°c 与 5% CO₂大气。
2. 准备吸管来收集和处理胚胎。
   1. 通过在火焰中旋转硬玻璃毛细管管的中心, 软化玻璃压积毛细血管 (75 mm/60 µL)。
   2. 尽可能快地从热中取出毛细血管, 拉上一根直径约300µm 的管子. 拉上冷却油管, 以获得一个整洁的休息。
3. 收集输卵管。
   1. 弄死 C57BL/6JRj 女性由颈椎脱位在0天上午9点。死亡是由斩首证实的。
      注: 这种安乐死方法经 IACUC 批准, 并遵循欧洲的建议。
   2. 用剪刀进行大水平切口打开腹腔。输卵管位于子宫和卵巢之间。
   3. 用弯曲钳去除带突出血管的 mesometrium 和膜。
   4. 用弯曲钳将输卵管与卵巢分开。
   5. 使用弯钳作为指导, 以削减输卵管从卵巢使用弯曲剪刀。
   6. 用弯剪刀拉输卵管, 从子宫切开。
      注意: 不要碰含有受精卵的肿胀的壶腹。使用无菌仪器执行整个过程。
   7. 将所有收集的输卵管在 M2 培养基 (35 毫米培养皿) 室温下放置
   8. 放置2输卵管在同一100µL 下降的透明质酸酶工作溶液 (0.3 毫克/毫升)。
4. 从受精卵中去除卵丘细胞。
   1. 在显微镜下, 使用2胰岛素注射器: 第一个持有输卵管和第二个把壶腹和分散受精卵进入透明质酸酶的工作溶液。
   2. 采取准备好的玻璃吸管收集鸡蛋和连接到油管和一个0.22 微米的过滤器安装在喉舌, 以吸入所有的鸡蛋。收集所有的鸡蛋, 并通过连续的通道洗净到6不同滴100µL 的 M2 培养基。
   3. 安置被洗涤的受精的蛋入湿化37°c 孵化器以 5% CO₂的大气 M16 媒介。

5. 注塑吸管

1. 采用薄壁玻璃毛细管 (10-15 厘米长), 外径为1毫米, 并将此毛细管钳入水平微拉拔器。
   注: 在大多数水平吸管, 3 参数可以调整: 热功率, 拉强度和时间延迟之间的加热和拉动。调整这些参数以获得类似于图 2A中所示的注入滴管。对于例行进行 DNA 显微注射的用户, 请使用标准设置并调整加热和拉拔之间的延迟, 以改变吸管尖端的全球形状。

6. 使持有吸管

1. 使用注射吸管准备持有吸管。
2. 将注射吸管连接到 microforge。用 microforge 切割吸管, 以获得80到100µm 直径的尖锐对称尖端。然后用热在 microforge 上抛光尖端, 以获得一个对称的圆形形状, 没有尖锐的对冲。

7. 含有慢病毒载体载体的注射用吸管的制备

1. 离心机的慢病毒载体向量悬浮在 160 x g 2 分钟的颗粒碎片经常出现在冷冻慢病毒载体库存。
2. 恢复上清, 并将其转移到一个新的0.5 毫升管在第二类安全柜。
3. 将1µL 的上清液转移到用微型装载机在步骤5中所述的注射吸管上。
4. 在右侧机器人的仪表座上设置注射吸管。将保持吸管连接到左侧机器人。
   注: 慢病毒载体载体的转导效价与方正生产的功效直接相关。为高功效 (> 70%), 使用病毒载体的效价在 100 p24 衣壳蛋白/µL 的范围内。当效价表示为转导单元 (tu) 时, 其效价应高于 10⁹涂/毫升。慢病毒载体载体的股票必须通过瞬态转染293T 细胞与 p8.91 encapsidation 质粒, pHCMV g, 编码的水泡性口炎病毒 (VSV) 糖蛋白-G 如补充方法¹⁸所述。

8. 微注射

1. 分配8µL 的 M2 介质在凹陷的中心滑动和覆盖轻质石蜡油 (胚胎测试), 以避免蒸发。
2. 放置20鸡蛋到下降尽可能最少分散。
   注意: 在沉积胚胎时不要制造气泡。
3. 请确保注射吸管的尖端是打开的。如果没有, 用持有吸管轻敲注射吸管。
4. 为二十年代的注射时间设置 microinjector。
   注意: 病毒悬浮液的粘度允许清晰地显示 perivitelline 空间中病毒载体的弥散。注射压力应调整, 以填补整个空间在二十年代注入, 这代表了10至 100 pL 的体积。注射压力不应超过 600 hPa。
5. 吸入一个受精卵, 其中包含2个临核和2个极性身体与持有吸管下的显微镜。
6. 在 perivitelline 空间中, 使用8.4 中描述的设置为 microinjector 注入卵子。
   注意: 不要用注射吸管接触等离子膜。
7. 注射所有受精卵可提供20个鸡蛋, 并立即将注射鸡蛋放入预加热的 M16 培养基中放入加湿的37°c 孵化器中, 其大气层为 5% CO₂。
   注: 在胚胎移植前注射卵子至少要孵化30分钟。

9. 将胚胎转移到 B6CBAF1/JRj Pseudopregnant 雌性中

1. 检查交配插头16小时后交配 B6CBAF1/JRj 女性与 B6CBAF1/JRj 输精管结扎术男性。在开始收集卵子之前就这样做。
2. 为注射胚胎准备植入吸管。
   1. 对胚胎进行植入吸管, 如收集和处理胚胎的描述 (步骤 4.2)。选择吸管, 内径约为150µm, 长度约为4-5 厘米。
      注: 提示应为火焰抛光, 以减少对鸡蛋或输卵管可能造成的损害。
      1. 填充轻石蜡油 (胚胎测试) 就在吸管肩上方。
      2. 吸入一个小气泡, 然后 M2 介质, 最后是第二个气泡。
      3. 将胚胎一个人放在一起, 以最小化在输卵管和胚胎中注射的培养基总量。
      4. 完成通过装载一小滴轻的石蜡油 (胚胎测试) 大约一个胚胎宽度。
         注意: 在处理吸管时要温和。
3. 胚胎移植。
   1. 消毒所有仪器。
   2. 麻醉女性使用腹腔注射 300 ul 的无菌氯化钠0.9% 溶液含有150微克每克氯胺酮的体重和0.15 微克每 g 体重的甲苯噻嗪。
   3. 在开始手术前, 用镊子捏紧动物的尾部并注射 subcutaneouly 0.1mg/千克止痛剂 (丁丙诺啡), 验证麻醉深度。
   4. 在最后一根肋骨的水平上沿脊髓两侧刮2厘米。
   5. 把雌性老鼠放在暖气垫上, 放在无菌的田地里。在鼠标的中间剪下2厘米 x 2 厘米的窗口。
   6. 在皮肤上涂上防腐剂溶液 (10% 聚维酮碘化物), 用剪刀做一个1厘米的横切口, 然后横向滑动皮肤, 直到卵巢 (橙色) 通过体壁可见。
   7. 在双目手术显微镜下, 用细剪刀将5毫米切口插入卵巢上方的身体壁上。
   8. 拿起非创伤性牛头犬钳的脂肪垫, 拉出卵巢, 输卵管和子宫顶部。
   9. 可视化壶腹部, 并作出一个横切与 vannas 剪刀在输卵管段, 连接卵巢和壶腹。
   10. 引入转移胚胎吸管, 将卵送进壶腹, 在注入吸管的第一个气泡处停止。
   11. 对第二个输卵管重复这个过程。
   12. 用伤口夹紧皮肤。
   13. 安置动物在恢复房间 (39 °c, 30-60 分钟) 直到完全地醒。
   14. 重复镇痛注射后12小时和48小时的情况下, 疼痛或窘迫的迹象。
   15. 手术后7-10 天内取出伤口夹。
   16. 植入后每3天按体重曲线检查植入雌性的妊娠。在植入后10至12天可以观察到明显的体重增加, 这将预示怀孕。
       注意: 所有将在这里发展的胚胎都将代表转基因创始人。这些创始人的表型可以在任何发育阶段或出生后根据与这些转基因动物的产生相关的科学问题进行分析。

10. 基因型转基因创始人

1. 制备含有10毫米三盐酸的基因型缓冲液, pH 值 8;5毫米 EDTA, pH 8.0 与 0.2% SDS (瓦特/v), 50 毫米氯化钠。通过0.22 µm 过滤器对基因分型缓冲器进行消毒, 并在室温下贮存几个月。
2. 将胚外膜 (用于胚胎) 或小片尾 (用于出生的动物) 放入500µL 的过滤基因型缓冲中, 并添加15µL 的蛋白酶 K (20 毫克/毫升)。孵化过夜在55摄氏度。
3. 将裂解液以 1.5万 x g 为5分钟离心, 然后用1µL 上清液进行 PCR 反应。裂解液可贮存在4摄氏度, 数月。
4. 在含有 1x pcr 缓冲器、1.5 毫米氯化镁₂、200µM dNTPs、每种 pcr 引物0.2 µM、1个 Taq DNA 聚合酶和1µL 的每一个消化样品的20µL 反应量中, 对转基因片段进行 PCR 扩增。作为一个负控制, 使用1µL 的 H₂O。作为一种积极的控制, 使用含有转基因的慢病毒载体载体质粒的 DNA。
5. 用于检测 eGFP 描述的使用:
   eGFP 向前 Primer:5 ' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3 '
   eGFP 反向底漆: 5 ' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3 '
6. 在 thermocycler 中执行 PCR 放大: 4 分钟在94°c 之后35个周期1分钟在94°c, 1 分钟在60°c, 并且2分钟在72°c。
7. 在2% 琼脂糖凝胶上加载 pcr 产品, 以可视化 300 bp eGFP PCR 产品, 如图 2B所示。
   注: 所有显示 300 bp PCR 波段的个体都整合了 eGFP 转基因, 可以被认为是转基因。
8. 分析转基因动物的转基因表达。例如, 执行组织学和染色, 如图 3和图 4所示, 并在补充方法中加以说明。
   注: 根据全球科学问题, 转基因表达分析和表型分析均应采用相关方法进行。

11. 转基因拷贝数的量化

1. 为定量 PCR 制备 DNA 样品。
   1. 根据制造商的指示, 从步骤10.3 中获得的蛋白酶 K 裂解物中提取基因组 DNA (gDNA)。
   2. 用分光光度法定量 gDNA 260 nm。
   3. 稀释每个 gDNA 样品到10µL 最后浓度。
   4. 每个样品, 准备5系列稀释 (1:5) 在 H₂O 获得6管在以下浓度:10 ng/µL, 2 吴/µL, 0.4 ng/µL, 0.08 吴/µL, 0.016 ng/µL 和 0.0032 ng/µL
2. 制备定量 PCR (qPCR) 反应组合。
   1. 为 qPCR 准备底漆组合物。为每个底漆夫妇使用 qPCR, 添加10µL 的前底漆 (100 µM 底漆库存解决方案), 10 µL 的反向底漆 (100 µM) 和80µL 的 H₂O。
      注: 放大 eGFP, 使用前 TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA 和反向 TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG 底漆。Cdx2基因被用作 qPCR 的标准件 (每个基因组2个拷贝)。Cdx2标准件使用前 GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG 和反向 GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT 底漆
   2. 准备 2 qPCR 混合, 一个与 eGFP 底漆混合和一个与 Cdx2 底漆混合。准备足够的 qPCR 混合, 以放大每 gDNA 重复的6稀释。一个 qPCR 反应包含3.8 µL₂O, 5 µL 荧光绿色2x 反应混合物和0.2 µL 底漆混合物。
      注: 对于每种转基因动物进行测试, 将进行 24 qPCR 反应。该反应组合为384井 qPCR 机提供。
   3. 为每个动物测试, 分布:12 个井与9µL eGFP qPCR 混合和12个井与9µL Cdx2 qPCR 混合。添加1µL 的每 gDNA 稀释到2井包含 eGFP qPCR 混合和2井包含 eGFP qPCR 混合。
   4. 为每个 qPCR 混合体留下2口井, 其中 gDNA 被 H₂O 取代为负控制。
3. 放置384井板在 qPCR 机器和应用以下运行的协议:10 分钟在95°c 然后50个周期十年代在95°c 和1分钟在60°c。
4. 分析数据。对于每个 gDNA 进行测试, 将 Ct 值绘制为总 gDNA 量 (6 磅重复) 日志的函数。用最小二乘法对曲线进行线性回归拟合, 并推断出与 y 轴截距对应的 Ct 值。使用 eGFP 和规范化 Cdx2 的外推 Ct 值, 可以使用标准 2^ΔdCt方法¹¹来计算相对于 Cdx2 (2 个副本) 的 eGFP 副本数。

结果

转基因动物是使用这里提出的协议生成的。具有代表性的结果表明, 无处不在和细胞类型的特定转基因表达。

转基因的本构表达

无处不在的发起人是基本的研究工具, 以持续和有效的方式表达转基因。这种促进剂被用于从体外细胞转染到小动物体内转基因...

讨论

在这里描述的受精卵母细胞中, 慢病毒载体载体的 perivitelline 注射导致了转基因胚胎的产生, 而相对于采集到的胚胎总数, 转基因胚胎的产量超过了70%。这一结果与以前的报告一致, 体现了程序^{2、7、10、11、12}的特殊性。在比较表 1中显示的所有数据时, 可以突出显?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG 50UI	Sigma	G4527
hCG 5000UI	Sigma	CG5-1VL
NaCl	Sigma	7982
100 mm petri dish	Dutsher	353003
4 wells Nunc dish	Dutsher	56469	IVF dish
M2 medium	Sigma	M7167
M16 medium	Sigma	M7292
0,22 µm Syringe filter	Dutsher	146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg	Sigma	H4272	mouse embryo tested
Insulin serynge	VWR	613-3867	Terumo Myjector
Curved forceps	Moria	2183
Curved scissors	Moria	MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries	Harvard apparatus	GC 100-10
Horizontal micropipette puller	Narishige	PN-30
Microforge	Narishige	MF-900
Inverted microscope	Nikon	Transferman NK2 5188	Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator	Eppendorf	Celltram air
Controler of holding pipet	Eppendorf	Femtojet
Mineral oil	Sigma	M8410	mouse embryo tested
Microinjector	Eppendorf	Femtojet	Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps	Moria	MC 40
vannas micro scissors	Moria	9600
Isoflurane	centravet	ISO005	ISO-VET 100% 250ml
ocrygel	centravet	OCR002
Povidone iodure	centravet	VET001	vetedine 120ml
Buprenorphine	centravet	BUP002	Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl	Sigma	T5941	Trizma hydrochloride
EDTA	Sigma	E9884
SDS	Sigma	436143
NaCl	Sigma	S7653	powder
proteinase K	Sigma	P2308
oneTaq kit	NEB	M0480L
Primers	Eurogentec
Strip of 8 PCR tube	4titude	4ti-0781
96 well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786	Veriti
Genomic DNA mini kit	invitrogen	K1820-02
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000C
qPCR Master mix	Roche	4887352001	SYBR Green
Multiwell plate 384	Roche	5217555001
qPCR instrument 384 well	Roche	5015243001	LightCycler 480