Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para promover la integración del transgén y la producción de ratones transgénicos fundador con alta eficacia por una simple inyección de lentivirales vector en el espacio perivitelino de un ovocito fertilizado.

Resumen

Durante casi 40 años, inyección pronuclear de ADN representa el método estándar para generar ratones transgénicos con la integración aleatoria de transgenes. Un procedimiento de rutina se utiliza extensamente en todo el mundo y su principal limitación reside en la pobre eficacia de la integración del transgén, resultando en un bajo rendimiento de los animales del fundador. Sólo pequeño porcentaje de animales nacidos después de la implantación de óvulos fertilizados inyectados ha integrado el transgén. Por el contrario, vectores lentivirales son poderosas herramientas para la transferencia de genes integradora y su uso para transducir ovocitos fertilizados permite producción altamente eficiente del fundador de ratones transgénicos con un rendimiento promedio superior al 70%. Además, cualquier cepa de ratón se puede utilizar para producir animales transgénicos y la penetrancia de la expresión del transgén es extremadamente alto, por encima del 80% con transgénesis mediada lentivirales comparado con microinyección de DNA. El tamaño del fragmento de ADN que puede ser carga por el vector lentivirales se limita a 10 kb y representa la principal limitación de este método. Usando un simple y fácil de realizar el procedimiento de inyección debajo de la zona pelúcida de ovocitos fertilizados, pueden producir más de 50 animales del fundador en una sola sesión de microinyección. Dicho método está altamente adaptado para llevar a cabo, directamente en los animales de fundador, rápida ganancia y pérdida de estudios de la función o a regiones de ADN genómicas de pantalla por su capacidad para controlar y regular la expresión génica en vivo.

Introducción

El trabajo pionero de Gordon et al. en 1980 demostró que después de la implantación en ratones seudopreñadas, la inyección de DNA de plásmido en la masculina pronúcleos de ovocitos fertilizados puede rendir la producción de animales transgénicos que integran el plásmido de ADN¹. La demostración que mamíferos transgénicos pueden ser generados tuvo un enorme impacto en Ciencias de la vida mundiales, abriendo el camino a nuevos campos de investigación tanto en ciencias básicas y ciencias biomédicas traslacionales. En las últimas cuatro décadas, microinyección de ADN se ha convertido en una práctica habitual. Aunque se han producido un número enorme de ratones transgénicos, el método estándar no es plenamente utilizable para todas las cepas de ratón y requiere mucho tiempo retrocruzamientos^2,3. Su aplicación a otras especies sigue siendo un reto⁴ y el rendimiento general de integración del transgén se limita a unos porcentaje de animales nacidos⁵. Además, la eficacia de la integración del transgen representa el factor limitante que explica el pobre rendimiento general de la inyección de ADN pronuclear. En este sentido, integrantes vectores virales son las más eficientes herramientas para carga e integran los transgenes y así podrían proporcionar nuevos medios para incrementar significativamente el rendimiento de la integración, la única limitación es que el tamaño del transgén que no puede superar los 10 kb⁶ .

Vectores lentivirales pseudo-mecanografiados con la proteína de la envoltura de los Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) son herramientas de transferencia de gen pantropic y altamente integrador y pueden utilizarse para transducir ovocitos fertilizados⁷. La zona pelúcida que rodea los ovocitos es una barrera natural virus y necesita ser pasado para permitir la transducción de los vectores lentivirales. Animales transgénicos han sido generados por transductoras ovocitos fertilizados después de micro perforación o extracción de la zona pelúcida^8,9. Sin embargo, la inyección debajo de la zona pelúcida en el espacio perivitelino parece ser el método más simple para transducir los huevos fecundados como descrito inicialmente por Lois y colegas⁷.

La inyección de perivitelino de vectores lentivirales permite altos rendimientos en la producción de animales transgénicos que están sobre el 70% de los animales nacidos. Tal producción es más de 10 veces superior a la mejor producción que puede lograrse utilizando estándar pronúcleos ADN inyección^7,10,11. En este contexto, una sola sesión de inyecciones generará a por lo menos 50 fundadores transgénicos (F0). Por lo tanto, el gran número de fundadores es compatible con fenotipo del transgen efecto directamente realizado sobre ratones F0 sin la necesidad de generar líneas de ratón transgénico. Esta ventaja permite la rápida detección de los efectos del transgen y está adaptada para realizar en vivo la ganancia y la pérdida de estudios de la función dentro de las semanas. Además, elementos reguladores del ADN pueden también rápidamente proyectará para asignar potenciadores y motivos de ADN por transcripción factores^11,12. Con inyección pronuclear, los transgenes generalmente integrar copias múltiples en un único locus. Con vectores lentivirales, integración ocurre en loci múltiples como una sola copia por locus^10,13. Por lo tanto, la multiplicidad de loci integrados es probablemente asociado a la penetrancia muy alta expresión observada en los transgénicos fundadores, que hace el nuevo modelo generando más robusto.

Lo importante, al utilizar inyección pronuclear de DNA, visualización de los pronúcleos durante el procedimiento es absolutamente necesario. Esta limitación técnica evita el uso de ovocitos fertilizados procedentes de una gran variedad de cepas de ratón. Por lo tanto, la producción de un modelo transgénico en un específico de la cepa para que pronúcleos son invisibles requiere la producción de animales en una cepa permisiva seguido por al menos 10 sucesivas retrocruzas para transferir el transgen en el ratón deseado cepa. Con las inyecciones de vectores lentivirales, espacio perivitelino siempre está visible y la inyección no requiere de habilidades muy específicas. Por ejemplo, se han obtenido ratones transgénicos NOD/SCID que no son apropiados para la inyección de pronúcleos con los vectores virales inyecciones¹⁴.

Aquí, se presenta un protocolo integral para permitir la simple producción de ratones transgénicos usando inyecciones lentivirales vector en el espacio perivitelino de un embrión de la etapa de una célula. Expresión del transgén controlada ya sea con ubicua o promotores específicos de la célula se describe en detalle.

El backbone lentivirales pTrip ΔU3 fue utilizado en este estudio¹⁵. Este vector permite la producción de vectores lentivirales defectuoso de replicación en la que la secuencia de U3 se ha eliminado parcialmente para eliminar la actividad de promotor de U3 y generar una uno mismo-inactivador de vector (pecado)¹⁶. Las poblaciones de vectores lentivirales fueron producidas por transitorios de la transfección de células HEK-293T con el p8.91 encapsulación plásmido (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, pHCMV-G codificación de la estomatitis vesicular (VSV) virus de la glicoproteína G¹⁷y el ΔU3 pTRIP vector recombinante. El procedimiento de producción detallada se proporciona como métodos suplementarios.

Producción de las poblaciones de vectores lentivirales de alto título se realiza en condiciones de nivel II de bioseguridad (BSL-2). Esto es cierto para la mayoría de los transgenes excepto oncogenes que tienen que ser producido en el BSL-3. Por lo tanto, la producción en condiciones BSL-2 para la mayoría de los casos es suficiente. Además, el uso y la producción generalmente se desconectan para la mayoría las agencias reguladoras nacionales con organismos modificados genéticamente (OMG). Cantidades limitadas de vectores lentivirales incompetentes de pecado la replicación (por debajo de 2 μg de la proteína de cápside p24) pueden utilizarse en condiciones BSL-1 según lo descrito por la agencia francesa OGM de acuerdo con las recomendaciones de la Unión Europea.

Protocolo

Todos los procedimientos que incluyen trabajo animal han obtenido aprobación ética y han sido autorizados por el Ministerio francés de investigación y educación bajo el número APAFIS #5094-20 v6 16032916219274 y 05311.02. El Animalario ICM PHENOPARC ha sido acreditado por el Ministerio francés de agricultura bajo el número de acreditación B75 13 19. El protocolo general requiere realizar cada procedimiento dentro de un marco de tiempo exacto que se resume en la figura 1.

1. animal compra y preparación de compuestos básicos

1. Compra de animales
   1. Ordenar 25 machos vasectomizados B6CBAF1/JRj que son 8 semanas de edad (generación F1 original cruza entre ♀C57Bl/6JRj y ♂CBA/JRj).
      Nota: Aislar a los hombres a su llegada. Machos vasectomizados pueden ser reutilizados por al menos un año.
      Cambiar las jaulas cada 3 semanas.
   2. Orden 50 hembras de B6CBAF1/JRj que son 10 semanas de edad y mantienen una piscina de por lo menos 50 animales.
   3. Orden de 10-15 C57BL/6JRj machos fértiles que son 8 semanas de edad.
   4. Orden 30 hembras C57BL/6JRj que son 4 semanas de edad.
2. Anestesia y eutanasia
   1. La anestesia se realiza con un volumen de la mezcla de ketamina/xilacina 300μL, inyectada por vía intraperitoneal (ketamina a una dosis de 150μg/g de peso corporal, xilacina a dosis de 0.15μg / g de peso corporal). Animales se colocan bajo calefacción pad para ajustar la temperatura del cuerpo. Revise los reflejos pellizcando la cola del animal antes de iniciar el procedimiento.
   2. Eutanasia se realizó mediante dislocación cervical. Degollación fue incluido como un método secundario para confirmar la muerte del animal. Eutanasia de embriones fue realizado por decapitación.
      Nota: A su llegada, permiten animales un mínimo de 1 semana para habituarse a la instalación (sin manipulación o apareamiento). Lo importante, cualquier cepas de ratón incluyendo líneas transgénicas pueden ser utilizadas como machos fértiles y hembras fértiles para superovulación. La elección de la cepa debe hacerse según los requisitos de la pregunta científica.
3. Preparación de la hormona
   1. Agregar 910 μl de tampón de la PSMG (gonadotropina de suero de yegua embarazada) en 1 frasco liofilizado de PMSG, tomar alícuotas μl 100 y almacenar a-20 ° C.
      Nota: Cada alícuota contiene 55 UI para 11 ratones. Nunca mantenga PMSG alícuotas durante más de dos semanas después del primer uso.
   2. Añadir 2730 μl de tampón de hCG (gonadotropina coriónica) en 1 liofilizada frasco de hCG. Hacer alícuotas μl 100 y almacenar a-20 ° C.
      Nota: Cada alícuota contiene 55 UI para 11 ratones.
4. Preparación de hialuronidasa
   1. Reconstituir 1 vial de hialuronidasa con 3 mL de medio de M2 para obtener un 10 mg/mL solución stock y hacer alícuotas de μl 50. Luego almacenar a-20 ° C.
5. Preparación de herramientas de cirugía
   1. Esterilizar todas las herramientas de cirugía utilizando el autoclave.

2. superovulación de donantes

1. En un centro de animales utilizando 12 h día - ciclos de la noche, inyectar PMSG en 14:00 en el día -3. Inyectar el hCG a las 12 h día -1 y mate con machos fértiles justo después de la inyección de hCG.
2. Día -3, añadir 1 mL de solución estéril de NaCl 0,9% en 1 alícuota de 100 μl de PMSG (55 UI). Inyectar 10 hembras C57BL/6JRj con 100 μl por vía intraperitoneal utilizando una jeringa sin ningún volumen muerto.
   Nota: Cada ratón recibirá 5 UI de PMSG.
3. Día -1, agregar 1 mL de solución de NaCl al 0,9% estéril a 1 alícuota de 100 μl de hCG (55 UI). Inyectar a los ratones que recibieron la inyección de PMSG con 100 μl de solución diluida de hCG (5UI) por vía intraperitoneal. Utilice una jeringa sin ningún volumen muerto. Realizar la inyección lentamente y espere antes de retirar la aguja para que no escape el líquido.
   Nota: Cada ratón recibirá 5 UI de hCG. La inyección de hCG se debe realizar 46 h después de PMSG.
4. Coloque cada hembra C57BL/6JRj en la jaula del macho semental directamente después de la inyección de hCG.
5. Ver tapones vaginales en la mañana del día 0 y las hembras positivas para recoger huevos fertilizados.

3. prepare las hembras seudopreñadas B6CBAF1/jRj

1. Mate un hombre vasectomía el día antes de huevo (día -1) con 2 hembras de B6CBAF1/JRj en 17:00.
   Nota: Es muy importante aparearse con las hembras que son originarios de diferentes jaulas para evitar la sincronización de los ciclos femeninos. Esto aumentará el rendimiento de obtención de tapones vaginales. Además, no agregue una hembra a una jaula macho que ha cambiado en los últimos 2 días. Eficacia de comportamiento reproductivo en el hombre aumenta cuando la jaula está sucia.

4. fertilizado huevos colección

1. Preparación
   1. Añadir μl de 1450 m2 a solución para preparar la solución de trabajo de hialuronidasa hialuronidasa.
   2. Coloque una gota de 100 μl de solución de trabajo de hialuronidasa por hembra utiliza para producir huevos fertilizados en una placa de Petri de 100 mm y mantener a temperatura ambiente.
   3. Añadir 500 μl de M16 en placas de 4 pozos. Utilizar 2 pozos por tipo de vectores lentivirales que será inyectada: uno bien contendrá los huevos inyectados y el otro los que no. Colocar las 4 placas bien en la incubadora a 37 ° C con una atmósfera de 5% CO₂ .
2. Preparar Pipetas para recolección y manejo de embriones.
   1. Suavizar los capilares de hematocrito de vidrio (75 mm/60 μL) girando el centro del tubo capilar de vidrio duro en la llama.
   2. Retirar los tubos capilares del fuego tan pronto como sea posible y tire de él para obtener un tubo con un diámetro interno de aproximadamente 300 μm. Tire del tubo enfriado para obtener una rotura limpia de.
3. Recoger los oviductos.
   1. Eutanasia a las hembras C57BL/6JRj por dislocación cervical en 9:00 en el día 0. Se confirma la muerte por decapitación.
      Nota: Este método de eutanasia fue aprobado por el IACUC y sigue las recomendaciones europeas.
   2. Realizar una incisión horizontal grande para abrir la cavidad abdominal con las tijeras. El oviducto se encuentra entre el útero y el ovario.
   3. Retire el mesometrium y la membrana que lleva vasos sanguíneos prominentes con fórceps curvado.
   4. Separar el oviducto del ovario con fórceps curvado.
   5. Utilice fórceps curvado como una guía para cortar el oviducto del ovario con tijeras curvas.
   6. Tire el oviducto y corte del útero con unas tijeras curvas.
      PRECAUCIÓN: No toque la ampolla inflamada que contiene los huevos fertilizados. Realizar todo el procedimiento con instrumentos estériles.
   7. Lugar de oviductos todos recogidos en M2 medio (placa de cultivo de 35 mm) a temperatura ambiente
   8. Coloque 2 oviductos en la misma gota de 100 μl de solución de trabajo de hialuronidasa (0,3 mg/mL).
4. Eliminar las células de cúmulos de huevos fertilizados.
   1. Bajo un estereomicroscopio, utilice 2 jeringas de insulina: la primera de ellas para sostener el oviducto y la segunda para romper la ampolla y dispersar huevos fertilizan en la solución de trabajo de hialuronidasa.
   2. Tomar la pipeta de cristal preparado para recoger huevos y conectar el tubo y un filtro de 0,22 μm, montado en la boquilla para aspirar todos los huevos. Recoger todos los huevos y lávelos por sucesivos paso en 6 diferentes gotas de 100 μl de medio de M2.
   3. Lugar lavarse los huevos fertilizados en incubadora humidificada 37 ° C con una atmósfera de 5% CO₂ en medio de la M16.

5. hacer inyección de pipetas

1. Uso de tubo capilar de vidrio de paredes delgadas (10-15 cm de largo) con un diámetro exterior de 1 mm y sujete este capilar en tirador de la micropipeta horizontal.
   Nota: En el tirador más horizontal de la pipeta, 3 ajustar parámetros: energía del calor, tirando de fuerza y tiempo de retraso entre calefacción y tirando. Ajuste estos parámetros para obtener la pipeta de inyección que se asemeja a la que se presenta en la figura 2A. Para los usuarios que realizan rutinariamente la microinyección de ADN, usar la configuración estándar y ajuste el retardo de calentamiento y tracción para cambiar la forma mundial de punta de la pipeta.

6. hacer explotación pipetas

1. Use una pipeta de inyección para preparar la pipeta holding.
2. Coloque una pipeta de inyección en un microforge. Cortar la pipeta con el microforge para obtener una punta muy afilada simétrica de 80 a 100 μm de diámetro. Luego pulir la punta con calor en el microforge para obtener una forma redonda simétrica sin setos sharp.

7. preparación de la pipeta de inyección que contiene los vectores lentivirales

1. Centrifugue la suspensión de vectores lentivirales a 160 x g durante 2 minutos para que sedimenten residuos a menudo presentan en acciones lentivirales congeladas.
2. Recuperar el sobrenadante y transferir a un nuevo tubo de 0,5 mL en una clase de seguridad II gabinete.
3. Transferir 1 μl del sobrenadante a una pipeta de inyección preparada como se describe en el paso 5 utilizando un cargador de Micro.
4. Coloque la pipeta de inyección sobre el soporte del instrumento de la razón instrumental quirúrgico. Conectar la pipeta holding a la izquierda micromanipulador.
   Nota: El título del transduction del vector lentivirales va ser directamente relacionado con la eficacia de la producción del fundador. De alta eficacia (> 70%), uso de vectores virales con un título en el rango de 100 ng de p24 capsid proteína/μl. Cuando el título se expresa como unidades de transducción (TU), el título debe estar por encima de 10⁹ TU/mL. Las poblaciones de vectores lentivirales deben ser producidas por transitorios de la transfección de células 293T con el plásmido de encapsidation p8.91, pHCMV-G, codificación de la estomatitis vesicular (VSV) virus de la glicoproteína-G como se describe en métodos suplementarios¹⁸.

8. micro-Injection

1. Dispensar 8 μl de medio de M2 en el centro de una diapositiva de la depresión y la cubierta con aceite de parafina luz (embrión probado) para evitar la evaporación.
2. Lugar 20 huevos en la caída como dispersos lo menos posible.
   PRECAUCIÓN: No haga burbujas al depositar los embriones.
3. Asegúrese de que la punta de la pipeta de inyección está abierta. Si no es así, golpee la pipeta de inyección con la pipeta de sujeción.
4. Establecer la microinyectora para un tiempo de inyección de 20 s.
   Nota: La viscosidad de la suspensión viral permite la clara visualización de la dispersión de los vectores virales en el espacio perivitelino. La presión de inyección debe ajustarse para llenar todo el espacio dentro de 20 s de inyección, lo que representa un volumen de 10 a 100 pL. Presión de inyección no debe exceder 600 hPa.
5. Aspirar un huevo fertilizado que contiene núcleos profesionales 2 y 2 cuerpos polares con la pipeta holding bajo el estereomicroscopio.
6. Inyectar el huevo con el microinyector mediante ajustes descritos en 8.4, en el espacio perivitelino.
   PRECAUCIÓN: No toque la membrana plasmática con la pipeta de inyección.
7. Inyectar todo fertilizados huevos disponibles en lotes de 20 huevos y coloque los huevos inyectados inmediatamente en medio M16 precalentar la incubadora humidificada 37 ° C con una atmósfera de 5% CO₂.
   Nota: Incubar los huevos inyectados por un mínimo de 30 minutos después de la inyección antes de las transferencias de embriones.

9. transferencia de embriones en hembras seudopreñadas B6CBAF1/JRj

1. Revise la cópula clavija 16 h después de aparearse las hembras B6CBAF1/JRj con machos de vasectomía B6CBAF1/JRj. Hacer esto justo antes de comenzar la colección de huevos.
2. Preparar pipetas de implantación por embrión inyectado.
   1. Hacer pipetas de implantación de embriones como se describe para la recogida y manipulación de embriones (paso 4.2). Seleccione pipetas con un diámetro interno de unos 150 μm con una parte estrecha alrededor de 4-5 cm de longitud.
      Nota: La punta debe estar pulida, con el fin de reducir posibles daños a los huevos o el oviducto la llama.
      1. Llene con aceite de parafina luz (embrión probado) justo por encima del hombro de la pipeta.
      2. Aspire una burbuja de aire pequeño, entonces medio de M2 y finalmente una segunda burbuja de aire.
      3. Elaboración de embriones uno detrás de otros para minimizar el volumen total del medio que se inyectará en el oviducto y los embriones.
      4. Acabado por la carga de una gota muy pequeña de aceite de parafina luz (embrión probado) de la anchura de un embrión.
         PRECAUCIÓN: Ser suave durante la manipulación de la pipeta.
3. Transferencia de embriones.
   1. Esterilizar todos los instrumentos.
   2. Anestesiar la hembra mediante una inyección intraperitoneal de 300 μL de solución estéril de 0.9% de NaCl que contiene 150 μg por g de peso corporal de la ketamina y 0.15 μg / g de peso corporal de xilacina.
   3. Verificar la profundidad de la anestesia por pellizcar la cola del animal con pinzas e inyecte subcutaneouly 0,1 mg/kg de analgésicos (buprenorfina) antes de iniciar el procedimiento.
   4. Afeitado 2 cm a ambos lados de la espalda a lo largo de la médula espinal a nivel de la última costilla.
   5. Coloque el ratón hembra sobre una almohada y en un campo estéril. Cortar una ventana de 2 x 2 cm en el centro de la parte trasera del ratón.
   6. Aplicar una solución antiséptica (yodo de povidona 10%) sobre la piel y hacer una incisión transversal de 1 cm con las tijeras, luego deslice la piel lateralmente hasta el ovario (color naranja) es visible a través de la pared del cuerpo.
   7. Haga una incisión de 5 mm en la pared del cuerpo por encima del ovario con las tijeras finas bajo el microscopio quirúrgico binocular.
   8. Levante la almohadilla de grasa con una pinza de bulldog atraumática y extraer el ovario, oviducto y la parte superior del útero.
   9. Visualizar la ampolla y realizar una Hemisección con tijeras de vannas en el segmento del oviducto que une el ovario con la ampolla.
   10. Introducir la pipeta de embrión y entregar huevos en la ampolla, en la primera burbuja de aire en la pipeta de implantación.
   11. Repita el procedimiento en el oviducto de segunda.
   12. Cierre la piel con los clips de la herida.
   13. Lugar el animal en la recuperación del compartimiento (39 ° C, 30-60 min) hasta totalmente despierto.
   14. Repetir la inyección analgésica después de 12 h y 48 h en caso de dolor o angustia.
   15. Eliminar clips de herida 7-10 días después de la cirugía.
   16. Compruebe las hembras implantadas para el embarazo siguiendo su curva de peso cada 3 días después de la implantación. Un aumento de peso importante puede observarse de 10 a 12 días después de la implantación y será indicativo de embarazo.
       Nota: Todos los embriones que se desarrollan aquí voluntad representan a supuestos transgénicos fundadores. El fenotipo de estos fundadores puede analizarse en cualquier etapas de desarrollo o después de nacimiento según la pregunta científica vinculada a la generación de estos animales transgénicos.

10. genotipificación transgénicos fundadores

1. Preparar el tampón de genotipificación que contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8,0 con SDS 0,2% (p/v), 50 mM NaCl. Esterilizar el búfer de genotipado mediante filtro 0,22 μm y almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.
2. Poner las membranas extraembrionarias (para embriones) o pedacito de cola (para los animales nacidos) en 500 μl de filtrado buffer de genotipado y añadir 15 μl de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar durante una noche a 55 º C.
3. Centrifugue el lisado a 15.000 x g durante 5 min y luego use 1 μl de sobrenadante para la reacción de PCR. Lisado puede guardarse a 4 ° C durante varios meses.
4. Realizar la amplificación por PCR de un fragmento del transgén en un volumen de reacción de 20 μl que contiene tampón x PCR 1, 1.5 mM MgCl₂, 200 μm de dNTPs, 0.2 μm de cada iniciadores PCR, 1 interfaz de usuario de Taq ADN polimerasa y 1 μl de cada muestra digerida. Como control negativo, use 1 μl de H₂O. Como control positivo, usar ADN de plásmido vector lentivirales que contiene el transgén.
5. Para la detección de eGFP describe el uso:
   eGFP adelante Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
   eGFP Primer revés: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
6. Realizar la amplificación por PCR en un termociclador: 4 min a 94 ° C, seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 min a 60 ° C y 2 min a 72 ° C.
7. Cargar el producto PCR en gel de agarosa al 2% para poder visualizar un 300 bp eGFP producto de PCR como se ilustra en la figura 2B.
   Nota: Todos los individuos que muestran una banda PCR 300 bp han incorporado el transgén de eGFP y pueden considerarse como transgénicos.
8. Analizar la expresión de transgenes en animales transgénicos. Por ejemplo, realizar histológica e inmunotinción como ilustrado en la figura 3 y figura 4 y se describe en métodos suplementarios.
   Nota: Ambos análisis de expresión del transgén y fenotipo deben realizarse con métodos pertinentes según la pregunta científica global.

11. cuantificación del número de copias del transgen

1. Preparar muestras de ADN para la PCR cuantitativa.
   1. Extraer el DNA genómico (gDNA) de la proteinasa K lisado obtenida en el paso 10.3 utilizando un kit comercial según las instrucciones del fabricante.
   2. Cuantificar gDNA por espectrofotometría a 260 nm.
   3. Diluir cada muestra gDNA a una concentración final de 10 ng/μl.
   4. Para cada muestra, preparar 5 diluciones seriadas (1:5) en H₂O para obtener 6 tubos en las siguientes concentraciones: 10 ng/μl, 2 ng/μl, 0,4 ng/μl, 0.08 ng/μl, 0.016 ng/μl y 0.0032 ng/μl
2. Preparar la mezcla de reacción de PCR (qPCR) cuantitativa.
   1. Preparar la mezcla de cartilla para qPCR. Para que cada pareja de cartilla para qPCR, añadir 10 μl del primer avance (100 μm cartilla solución), 10 μl de cebador reverso (100 μm) y 80 μl de H₂O.
      Nota: Para amplificar eGFP, utilizar primers TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA hacia adelante y reversa TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG. Cdx2 gen se utiliza como estabilizador para qPCR (2 copias por genoma). Para Cdx2 normalizador utilizar primers GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG hacia adelante y reversa GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT
   2. Preparar mezclas de qPCR 2, uno con la mezcla de la cartilla de eGFP y uno con mezcla de cartilla Cdx2. Preparar suficiente mezcla de qPCR para amplificar las 6 diluciones por duplicado de cada gDNA. Una reacción de la qPCR contiene 3.8 μl de H₂O, 5 μl de 2 fluorescentes verde x la mezcla de reacción y 0.2 μl de mezcla de cartilla.
      Nota: Para que cada animal transgénico para poner a prueba, se realizará 24 reacciones de qPCR. La mezcla de reacción se proporciona para una máquina de qPCR bien 384.
   3. Para que cada animal probar, distribuir: 12 pozos con 9 μl de mezcla de qPCR de eGFP y 12 pozos con 9 μl de mezcla de qPCR Cdx2. Añadir 1 μl de cada dilución del gDNA a 2 pozos que contiene la mezcla de qPCR de eGFP y 2 pozos que contiene la mezcla de qPCR de eGFP.
   4. Licencia 2 pozos para cada qPCR mezclan que gDNA fue reemplazar por H₂O como control negativo.
3. Coloque la placa de la pozo 384 en la máquina de qPCR y aplicar el siguiente protocolo de funcionamiento: 10 minutos a 95 ° C después de 50 ciclos de 10 s a 95 ° C y 1 min a 60 ° C.
4. Analizar los datos. Para que cada gDNA probar, trazar los valores de Ct en función de los registros del gDNA total importe (6 puntos por duplicado). Ajuste de la curva usando regresión lineal con el método menos cuadrado y extrapolar el valor de Ct correspondiente a la intersección con el eje y. Utilizar los valores de Ct extrapolados de eGFP y Cdx2 normalizado para calcular el número de copia de eGFP respecto Cdx2 (2 copias) usando el método de estándar 2^{ΔdCt 11}.

Resultados

Animales transgénicos fueron generados usando el protocolo presentado aquí. Representante resultados tanto ubicua y expresión de transgenes específicos tipo de célula se ilustran.

Expresión constitutiva de transgenes

Promotores ubicuos son herramientas de investigación básica para expresar transgenes en forma sostenida y eficaz. Estos promotore...

Discusión

La inyección perivitelino de vectores lentivirales en ovocitos fertilizados descritos aquí dio lugar a la producción de embriones transgénicos que rindió más del 70% de los embriones transgénicos en relación con el número total de embriones colectados. Este resultado es consistente con informes anteriores y ejemplifica la especificidad del procedimiento^2,7,10,11,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG 50UI	Sigma	G4527
hCG 5000UI	Sigma	CG5-1VL
NaCl	Sigma	7982
100 mm petri dish	Dutsher	353003
4 wells Nunc dish	Dutsher	56469	IVF dish
M2 medium	Sigma	M7167
M16 medium	Sigma	M7292
0,22 µm Syringe filter	Dutsher	146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg	Sigma	H4272	mouse embryo tested
Insulin serynge	VWR	613-3867	Terumo Myjector
Curved forceps	Moria	2183
Curved scissors	Moria	MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries	Harvard apparatus	GC 100-10
Horizontal micropipette puller	Narishige	PN-30
Microforge	Narishige	MF-900
Inverted microscope	Nikon	Transferman NK2 5188	Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator	Eppendorf	Celltram air
Controler of holding pipet	Eppendorf	Femtojet
Mineral oil	Sigma	M8410	mouse embryo tested
Microinjector	Eppendorf	Femtojet	Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps	Moria	MC 40
vannas micro scissors	Moria	9600
Isoflurane	centravet	ISO005	ISO-VET 100% 250ml
ocrygel	centravet	OCR002
Povidone iodure	centravet	VET001	vetedine 120ml
Buprenorphine	centravet	BUP002	Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl	Sigma	T5941	Trizma hydrochloride
EDTA	Sigma	E9884
SDS	Sigma	436143
NaCl	Sigma	S7653	powder
proteinase K	Sigma	P2308
oneTaq kit	NEB	M0480L
Primers	Eurogentec
Strip of 8 PCR tube	4titude	4ti-0781
96 well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786	Veriti
Genomic DNA mini kit	invitrogen	K1820-02
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000C
qPCR Master mix	Roche	4887352001	SYBR Green
Multiwell plate 384	Roche	5217555001
qPCR instrument 384 well	Roche	5015243001	LightCycler 480