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In diesem Artikel

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  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Zusammenfassung

Seit fast 40 Jahren stellt man DNA-Injektion der standard Methode zur Erzeugung transgener Mäuse mit zufälligen Integration der Transgene. Solch ein Routineverfahren ist weit verbreitet in der ganzen Welt genutzt und seine wichtigste Einschränkung befindet sich in der schlechten Wirksamkeit von Transgen-Integration, was zu einer geringen Ausbeute von Gründer Tiere. Nur wenige Prozent der Tiere geboren nach der Implantation der befruchteten Eizellen injiziert haben das Transgen integriert. Im Gegensatz dazu Lentivirale Vektoren sind leistungsfähige Werkzeuge für integrative Gentransfer und deren Einsatz zur befruchtete Eizellen transduzieren ermöglicht hocheffiziente Produktion des Gründers transgener Mäuse mit einem Durchschnittsertrag über 70 %. Darüber hinaus jede Maus Belastung kann verwendet werden, um Transgene Tiere zu erzeugen und die Penetranz des Transgens Ausdruck ist extrem hoch, über 80 % mit Lentivirale vermittelten Transgenese im Vergleich zu DNA-Mikroinjektion. Die Größe des DNA-Fragments, die Ladung durch den Lentivirale Vektor sein können beschränkt sich auf 10 kb und die große Einschränkung dieser Methode darstellt. Mit einer einfachen und leicht durchzuführen Injektion unter die Zona Pellucida der befruchteten Eizellen, sind mehr als 50 Gründer Tiere in einer einzigen Sitzung der Mikroinjektion herstellbar. Diese Methode eignet sich sehr direkt in Gründer Tiere, schnellen Gewinn und Verlust von Funktionsstudien oder Bildschirm genomische DNA-Regionen für ihre Fähigkeit zur Kontrolle und Regulierung Gen Ausdruck in Vivodurchführen.

Einleitung

Die Pionierarbeit von Gordon Et Al. 1980 zeigte, dass die Plasmid DNA-Injektion in die männliche Vorkerne von befruchteten Eizellen nach der Implantation bei pseudopregnant Mäusen die Erzeugung transgener Tiere hervorbringen kann, die integriert die Plasmid DNA-1. Die Demonstration, dass transgene Säugetiere generiert werden können hatte einen enormen Einfluss auf global Life-Sciences, öffnet den Weg zu neuen Feldern der Forschung sowohl für Grundlagenwissenschaften und Translationale Biomedizin. In den vergangenen vier Jahrzehnten ist DNA Mikroinjektion Routinepraxis geworden. Obwohl eine enorme Anzahl von transgenen Mäuse hergestellt wurden, die standard-Methode ist nicht voll einsatzfähig für alle Maus-Stämmen und erfordert zeitaufwendig Rückkreuzungen2,3. Seine Anwendung auf andere Arten bleibt herausfordernd4 und der Gesamtertrag der Transgen-Integration beschränkt sich auf wenige Prozentsatz der geborenen Tiere5. Darüber hinaus stellt die Wirksamkeit der Transgen-Integration den limitierenden Faktor, der die Armen Gesamtausbeute von man DNA-Injektion erklärt. In dieser Hinsicht integrative virale Vektoren sind die effizientesten Tools zum Fracht und transgene zu integrieren und so könnten neue Mittel, um deutlich erhöhen Integration Ausbeute, die einzige Einschränkung ist, dass die Transgen-Größe, die6 10 kb nicht überschreiten darf .

Mit dem Briefumschlag-Protein von vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) Pseudo-typisierte Lentivirale Vektoren sind pantropic und hoch integrative gen-Transfer-Tools und können verwendet werden, um die befruchteten Eizellen7transduzieren. Die Zona Pellucida rund um die Eizellen ist eine natürliche Virus Barrier und damit Transduktion mit Lentivirale Vektoren können übergeben werden muss. Transgene Tiere wurden durch 3D-Steuerung befruchtete Eizellen nach dem Mikro-Bohren oder Entfernen der Zona Pellucida8,9generiert. Injektion unter die Zona Pellucida in den Perivitelline Raum scheint jedoch die einfachste Methode, um die befruchteten Eier wie anfangs beschrieben von Lois und Kollegen7transduzieren.

Die Perivitelline Injektion von Lentivirale Vektoren kann hohe Erträge bei der Herstellung transgener Tiere, die mehr als 70 % der geborenen Tiere sind. Dieser Ertrag ist mehr als 10-fach höher als die beste Ausbeute, die mit standard Vorkerne DNA Injektion7,10,11erreicht werden kann. In diesem Zusammenhang wird eine Einzelsitzung der Injektionen mindestens 50 transgenen Gründer (F0) generieren. Die große Zahl der Gründer ist daher kompatibel mit Phänotypisierung des Effekts Transgens direkt auf F0 Mäuse ohne die Notwendigkeit zu erzeugen transgene Mauslinien durchgeführt. Dieser Vorteil ermöglicht schnelle Screening des Effekts Transgens und ist speziell auf in Vivo -Gewinn und Verlust der Funktionsstudien innerhalb von Wochen durchführen. Darüber hinaus können regulatorische DNA-Elemente auch rasch untersucht werden, um Karte Enhancer und DNA-Motive, die durch Transkription Faktoren11,12gebunden. Transgene Integration mit man Injektionen in der Regel als mehrere Kopien in einen einzigartigen Ort. Mit Lentivirale Vektoren kommt Integration in mehrere Loci als eine einzelne Kopie pro Locus10,13. Daher ist die Vielzahl der integrierten Loci am ehesten, die sehr hohe Expression Penetranz beobachtet in transgenen Gründer, wodurch das neue generierte Modell robuster zugeordnet.

Wichtig ist, wenn man Injektion von DNA, ist Visualisierung der Vorkerne während des Verfahrens zwingend notwendig. Diese technische Einschränkung verhindert die Verwendung von befruchteten Eizellen, die aus einer Vielzahl von Maus-Stämmen. Daher die Produktion eines transgenen Modells in einem bestimmten Stamm für die Vorkerne sind unsichtbar die Produktion von Tieren in einem freizügigen Stamm erfordert, gefolgt von mindestens 10 aufeinander folgenden Rückkreuzungen das Transgen in der gewünschten Maus übertragen Zuchtlinie Mit der Lentivirale Vektor-Injektionen Perivitelline Raum ist immer sichtbar und die Injektion erfordert keine hochspezifische Fähigkeiten. Als Beispiel wurden NOD/SCID transgenen Mäusen, die nicht geeignet für die Vorkerne Injektion sind mit dem viralen Vektoren Injektionen14gewonnen.

Hier ist ein umfassendes Protokoll präsentiert, um einfache Herstellung von transgenen Mäusen mit Lentivirale Vektor-Injektionen in den Perivitelline Raum des Embryos Bühne einer Zelle zu ermöglichen. Transgene Ausdruck gesteuert entweder mit allgegenwärtigen oder Zelle spezifische Promotoren wird ausführlich beschrieben.

PTrip ΔU3 Lentivirale Rückgrat wurde in dieser Studie15verwendet. Dieser Vektor kann für die Herstellung von Replikation defekt Lentivirale Vektoren in denen U3-Sequenz teilweise gelöscht wurde zum Entfernen U3 promotoraktivität und generieren eine Self inactivating Vektor (SIN)16. Lentivirale Vektor Bestände wurden durch Transiente Transfektion von Zellen der HEK-293T mit dem p8.91 Kapselung Plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G, Codierung die vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) Glykoprotein-G17und pTRIP ΔU3 produziert. rekombinanten Vektor. Die produktionsfeinplanung Verfahren wird als ergänzende Methoden bereitgestellt.

Produktion von hohen Titer Lentivirale Vektor Aktien erfolgt unter Biosafety Level II Bedingungen (BSL-2). Dies gilt auch für die meisten transgene außer Onkogene, die in BSL-3 hergestellt werden. Daher ist die Produktion in BSL-2 Bedingungen in den meisten Fällen ausreichend. Darüber hinaus werden der Einsatz und die Produktion in der Regel für die meisten nationalen Regulierungsbehörden Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) getrennt. Begrenzte Mengen an Replikation inkompetent SIN Lentivirale Vektoren (unter 2 µg Protein p24 Kapsid) können unter BSL-1 Bedingungen wie die französischen GVO-Agentur in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Union beschrieben verwendet werden.

Protokoll

Alle Prozeduren, die tierische Arbeit beinhalten ethische Genehmigung erhalten haben und sind durch das französische Ministerium für Forschung und Bildung unter der Nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 und 05311.02 autorisiert worden. Die ICM Tierhaus PHENOPARC hat durch das französische Landwirtschaftsministerium unter der Akkreditierungsnummer B75 akkreditiert 13 19. Das gesamte Protokoll erfordert Durchführung jedes Verfahren innerhalb eines präzisen Zeitrahmens, das in zusammengefasst werden in Abbildung 1.

1. Tier Kauf und Vorbereitung der basischen Verbindungen

  1. Tierische Kauf
    1. Bestellen Sie 25 vasektomierten Männer B6CBAF1/JRj, die 8 Wochen alt sind (F1-Generation von Original Kreuze zwischen ♀C57Bl/6JRj und ♂CBA/JRj).
      Hinweis: Isolieren Sie Männchen bei der Ankunft. Vasektomierten Männer können für mindestens ein Jahr wieder verwendet werden.
      Ändern Sie die Käfige alle 3 Wochen.
    2. Bestellen Sie 50 B6CBAF1/JRj-Weibchen, die 10 Wochen alt und halten Sie einen Pool von mindestens 50 Tiere.
    3. Bestellen Sie 10-15 C57BL/6JRj fruchtbaren Männchen, die 8 Wochen alt sind.
    4. Bestellen Sie 30 C57BL/6JRj-Weibchen, die 4 Wochen alt sind.
  2. Anästhesie und Euthanasie
    1. Betäubung erfolgt mit einem Volumen von 300μL Ketamin/Xylazin-Mix, intraperitoneal injiziert (Ketamin in einer Dosis von 150μg/g Körpergewicht, Xylazin bei einer Dosis von 0.15μg / g Körpergewicht). Tiere sind unterstellt Heizkissen um Körpertemperatur anzupassen. Reflexe durch Kneifen der Schweif des Tieres vor Beginn des Verfahrens zu überprüfen.
    2. Euthanasie erfolgte durch zervikale Dislokation. Enthauptung wurde als eine sekundäre Methode zum Tod des Tieres zu bestätigen. Euthanasie von Embryonen erfolgte durch Enthauptung.
      Hinweis: Bei der Ankunft, können Sie Tiere mindestens 1 Woche bis zur Anlage (ohne Behandlung oder Paarung) gewöhnen. Wichtig ist, können jede Mausstämme einschließlich der Transgene Linien als fruchtbare Männchen und fruchtbaren Weibchen für Superovulation genutzt werden. Die Wahl der Sorte sollte entsprechend den Anforderungen der wissenschaftlichen Fragestellung erfolgen.
  3. Hormon-Vorbereitung
    1. 910 µL PSMG (Schwangere Stute Serum Gonadotropin) Puffer in 1 lyophilisierten PMSG Durchstechflasche einfügen, machen 100 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
      Hinweis: Jedes aliquoten enthält 55 UI für 11 Mäuse. Niemals halten PMSG Aliquote für mehr als 2 Wochen nach der ersten Anwendung.
    2. Fügen Sie 2730 hCG (humanes Choriongonadotropin) Puffer in 1 µL hCG Fläschchen lyophilisiert. 100 µL-Aliquots, erstellen und speichern bei-20 ° C.
      Hinweis: Jedes aliquoten enthält 55 UI für 11 Mäuse.
  4. Hyaluronidase-Vorbereitung
    1. Wiederherzustellen Sie 1 Durchstechflasche mit Hyaluronidase mit 3 mL M2 Medium zu erhalten eine 10 mg/mL Stammlösung 50 µL-Aliquots. Dann speichern Sie bei-20 ° C.
  5. Chirurgie-Instrumente-Vorbereitung
    1. Sterilisieren Sie alle Operation-Tools mit dem Autoklaven.

(2) Superovulation weibliche Spender

  1. In einem Tierhaus mit 12 h Tag - Nacht-Zyklen, injizieren PMSG um 14:00 am Tag-3. Injizieren Sie hCG um 12 Uhr am Tag-1 und Mate mit fruchtbaren Männchen kurz nach hCG-Injektion.
  2. Am Tag-3, fügen Sie 1 mL steriler 0,9 % NaCl-Lösung in 1 aliquoten von 100 µL der PMSG (55 UI). Injizieren Sie 10 C57BL/6JRj Weibchen mit 100 µL intraperitoneal mit einer Spritze ohne jede Totvolumen.
    Hinweis: Jede Maus erhalten 5 UI der PMSG.
  3. Am Tag-1, fügen Sie 1 mL steriler 0,9 % NaCl-Lösung in 1 aliquoten von 100 µL von hCG (55 UI). Spritzen Sie die Mäuse, die die PMSG-Injektion mit 100 µL verdünnter hCG-Lösung (5UI) intraperitoneal erhielten. Verwenden Sie eine Spritze ohne jede Totvolumen. Führen Sie die Injektion langsam und warten Sie vor dem Entfernen der Nadelöhrs, so dass die Flüssigkeit nicht leckt.
    Hinweis: Jede Maus erhalten 5 UI von hCG. Injektion von hCG sollte 46 h nach PMSG durchgeführt werden.
  4. Platzieren Sie jedes C57BL/6JRj-Weibchen in den Käfig des Männchens Stud direkt nach der hCG-Injektion.
  5. Überprüfen Sie vaginalen Stecker am Morgen der Tag 0 und nutzen Sie die positiven Weibchen befruchtete Eier zu sammeln.

3. bereiten Sie die B6CBAF1/jRj Pseudopregnant Weibchen

  1. Paaren Sie ein vasektomierten Mann am Vortag Eiersammlung (Tag-1) mit 2 B6CBAF1/JRj Weibchen um 17:00.
    Hinweis: Es ist sehr wichtig zur Paarung mit Weibchen, die stammen aus verschiedenen Käfigen, Synchronisation von weiblichen Zyklen zu vermeiden. Dadurch erhöht sich die Ausbeute an vaginalen Stecker zu erhalten. Darüber hinaus fügen Sie ein Weibchen nicht zu einem männlichen Käfig, der in den letzten 2 Tagen geändert wurde. Wirksamkeit des reproduktiven Verhaltens bei den Männchen wird erhöht, wenn der Käfig schmutzig ist.

4. die befruchteten Eier Sammlung

  1. Vorbereitung
    1. Hyaluronidase-Stammlösung, die Hyaluronidase Arbeitslösung vorzubereiten fügen Sie 1450 µL M2 hinzu.
    2. Geben Sie einen Tropfen von 100 µL Arbeitslösung Hyaluronidase pro Weibchen verwendet, um die befruchteten Eier in einem 100 mm Petrischale zu produzieren und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
    3. Fügen Sie 500 µL M16 in 4 Brunnen Platten. Verwenden Sie 2 Brunnen je nach Art der Lentivirale Vektoren, die injiziert werden: eines enthält auch die injizierten Eizellen und andererseits die, die nicht gespritzt. Platzieren Sie die 4-well-Platten im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 Atmosphäre.
  2. Erhebung und Verarbeitung von Embryonen Pipetten vorbereiten.
    1. Die Glas-Hämatokrit-Kapillaren (75 mm/60 µL) durch das Zentrum des Hartglas Kapillare Schläuche in der Flamme drehen zu erweichen.
    2. Nehmen Sie die Kapillaren so schnell wie möglich und ziehen Sie einen Schlauch mit einem Innendurchmesser von ca. 300 µm. ziehen auf den gekühlten Schläuche, eine nette Pause zu erhalten erhalten vom Herd.
  3. Sammeln Sie röhrenförmig.
    1. Einschläfern Sie C57BL/6JRj Weibchen durch zervikale Dislokation um 09:00 am Tag 0. Tod wird durch Enthauptung bestätigt.
      Hinweis: Diese Sterbehilfe-Methode wurde von der IACUC genehmigt und Europäische Empfehlungen folgt.
    2. Führen Sie einen großen horizontalen Schnitt um die Bauchhöhle mit einer Schere zu öffnen. Die Eileiter befindet sich zwischen der Gebärmutter und der Eierstöcke.
    3. Entfernen Sie die handelt und die Membran mit prominenten Blutgefäße mit gebogenen Pinzette.
    4. Trennen Sie die Eileiter aus dem Eierstock mit gebogenen Pinzette.
    5. Orientieren Sie gebogene Pinzetten, um die Eileiter aus dem Eierstock mit gebogenen Schere zu schneiden.
    6. Ziehen Sie die Eileiter und aus der Gebärmutter mit einer gebogenen Schere geschnitten.
      Vorsicht: Berühren Sie nicht der geschwollenen Ampulle, die die befruchteten Eier enthält. Führen Sie die gesamte Prozedur mit sterilen Instrumenten.
    7. Legen Sie alle gesammelten röhrenförmig in M2 Medium (35 mm Kulturschale) bei Raumtemperatur
    8. Legen Sie 2 röhrenförmig in den gleichen 100 µL Tropfen Hyaluronidase Arbeitslösung (0,3 mg/mL).
  4. Entfernen Sie kumuluszellen aus befruchteten Eiern.
    1. Unter einem Stereomikroskop verwenden 2 Insulinspritzen: erstens um die Eileiter zu halten und die zweite zu zerreißen der Ampulle und zerstreuen befruchtet Eier in die Hyaluronidase Arbeitslösung.
    2. Nehmen Sie die vorbereitete Glas pipettieren für das Sammeln von Eiern und verbinden Sie es mit Schlauch und ein 0,22 μm-Filter montiert auf das Mundstück zu Aspirieren Sie die Eier. Sammeln Sie alle Eier und waschen Sie sie durch aufeinander folgende Passage in 6 verschiedenen Tropfen 100 µL M2 Medium.
    3. Legen Sie gewaschene befruchtete Eier in befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 M16 Medium.

5. Herstellung Injektion Pipetten

  1. Dünnwandige Kapillaren Glasröhren (10-15 cm lang) mit einem Außendurchmesser von 1 mm verwenden Sie und Klemmen Sie diese Kapillare in horizontalen Mikropipette Puller.
    Hinweis: In die horizontale Pipette Abzieher 3 Parameter einstellbar: Hitze macht, Kraft und Zeit-Verzögerung zwischen Heizung und ziehen ziehen. Passen Sie diese Parameter zu injizierenden mehrkanalpipette, die die in Abbildung 2Apräsentiert ähnelt. Verwenden Sie für Benutzer, die routinemäßig DNA Mikroinjektion ausführen die standard-Einstellungen und passen Sie die Verzögerung zwischen Heizung und ziehen um die globale Form der Pipettenspitze ändern.

6. machen Holding Pipetten

  1. Verwenden Sie eine Injektion Pipette, um der haltepipette vorzubereiten.
  2. Legen Sie eine Injektion Pipette auf eine Microforge. Schneiden Sie die Pipette mit der Microforge eine symmetrische Spitze von 80 bis 100 µm Durchmesser zu erhalten. Dann Polieren Sie die Spitze mit Wärme auf die Microforge um eine symmetrische Runde Form ohne scharfe Hecken zu erhalten.

7. Vorbereitung der Injektion Pipette mit der Lentivirale Vektor

  1. Zentrifugieren der Lentivirale Vektor-Aufhängung an 160 X g für 2 min, pellet-Ablagerungen oft in gefrorenen Lentivirale Bestände vorhanden.
  2. Den überstand zu erholen und in eine neue 0,5 mL Tube in einer Klasse II Sicherheitsschrank übertragen.
  3. Übertragen Sie 1 µL überstand auf eine Injektion Pipette wie in Schritt 5 mit einem Micro-Loader beschrieben.
  4. Die Injektion Pipette auf dem Instrument-Halter von der richtigen Mikromanipulator festgelegt. Verbinden Sie die Holding Pipettieren mit der linken Mikromanipulator.
    Hinweis: Die Transduktion Titer des Lentivirale Vektors werden direkt mit der Wirksamkeit der Gründer Produktion in Verbindung gebracht. Für hohe Wirksamkeit (> 70 %), virale Vektoren verwenden, mit einem Titer im Bereich von 100 ng von p24 Kapsid Protein/µL. Wenn der Titer als Transduktion Einheiten (TU) zum Ausdruck kommt, sollte die Titer über 109 TU/mL. Lentivirale Vektor Bestände müssen hergestellt werden, durch Transiente Transfektion von Zellen der 293T mit dem p8.91 Encapsidation Plasmid, pHCMV-G, Kodierung der vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) Glykoprotein-G wie in ergänzenden Methoden18beschrieben.

(8) Mikro-Injektion

  1. 8 µL M2 Medium in der Mitte einer Depression Folie und Deckel mit leichten Paraffinöl (Embryo getestet) zu verzichten um Verdunstung zu vermeiden.
  2. Platz 20 Eier in den Tropfen wie zuletzt wie möglich verteilt.
    Achtung: Machen Sie keine Luftblasen, bei der Hinterlegung der Embryonen.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Injektion PIPETTENSPITZE geöffnet ist. Ist dies nicht der Fall, tippen Sie auf die Injektion-Pipette mit der haltepipette.
  4. Festlegen der Microinjector für eine Einspritzzeit 20 s.
    Hinweis: Die Viskosität der viralen Aufhängung ermöglicht klare Visualisierung der Dispersion von viralen Vektoren im Perivitelline Raum. Der Einspritzdruck sollte angepasst werden, um füllen den gesamten Raum innerhalb von 20 s der Injektion, entspricht einem Volumen von 10 bis 100 pl. Einspritzdruck sollte 600 hPa nicht überschreiten.
  5. Aspirieren Sie ein befruchtetes Ei, das pro 2 Kernen und 2 Polkörper mit der haltepipette unter dem Stereomikroskop enthält.
  6. Injizieren Sie das Ei mit der Microinjector in 8,4 im Bereich Perivitelline beschriebene Einstellungen verwenden.
    Vorsicht: Berühren Sie nicht die Plasmamembran mit Einspritzung pipettieren.
  7. Injizieren Sie alle befruchteten Eier in Chargen von 20 Eiern zur Verfügung und die eingespritzte Eier sofort in vorgewärmte M16-Medium in den Brutkasten befeuchtete 37 ° C mit einer Atmosphäre von 5 % CO2.
    Hinweis: Brüten Sie die injizierten Eier für ein Minimum von 30 min nach der Injektion vor Embryonentransfers.

9. Übertragung der Embryonen in B6CBAF1/JRj Pseudopregnant Weibchen

  1. Überprüfen Sie nach der Paarung B6CBAF1/JRj Weibchen mit B6CBAF1/JRj Vasektomie Männchen Kopulation Stecker 16 h. Hierzu kurz vor Beginn der Ei-Sammlung.
  2. Die injizierten Embryo Implantation Pipetten vorbereiten.
    1. Implantation Pipetten für Embryonen wie beschrieben für das Sammeln und den Umgang mit Embryonen (Schritt 4.2) zu machen. Wählen Sie Pipetten mit einem Innendurchmesser von ca. 150 µm mit einem schmalen Teil ca. 4-5 cm in der Länge.
      Hinweis: Die Spitze sollte Flamme poliert, um mögliche Schäden für die Eier oder die Eileiter zu verringern.
      1. Füllen Sie mit leichten Paraffinöl (Embryo getestet) oberhalb der Pipette Schulter.
      2. Aspirieren Sie eine kleine Luftblase, dann M2 Medium, und schließlich eine zweite Luftblase.
      3. Aufstellen Sie, Embryonen ein hinter einander das Gesamtvolumen des Mediums zu minimieren, die im Eileiter zusammen mit den Embryonen injiziert wird.
      4. Abschließend laden einen sehr kleinen Tropfen leicht Paraffinöl (Embryo getestet) über einen Embryo Breite.
        Achtung: Seien Sie beim Umgang mit der Pipette sanft.
  3. Embryo-Transfer.
    1. Sterilisieren Sie alle Instrumente.
    2. Das Weibchen mit einer intraperitonealen Injektion von 300 μL sterile NaCl 0,9 % Lösung mit 150 μg pro g Körpergewicht von Ketamin und 0,15 µg pro Gramm Körpergewicht von Xylazin zu betäuben.
    3. Überprüfen Sie die Tiefe der Narkose durch den Schweif des Tieres mit Zangen Kneifen und injizieren Sie Subcutaneouly 0,1 mg/kg Analgetikum (Buprenorphin) vor Beginn des Verfahrens zu.
    4. Rasieren Sie 2 cm auf beiden Seiten des Rückens entlang des Rückenmarks auf der Ebene der letzten Rippe.
    5. Platzieren Sie die weibliche Maus auf ein Heizkissen und in einem sterilen Bereich. Schneiden Sie einen 2 x 2 cm-Fenster in der Mitte der Maus zurück.
    6. Tragen Sie eine antiseptische Lösung (10 % Povidon-Jod auf) auf die Haut und machen Sie einen 1 cm quer Schnitt mit der Schere zu, dann schieben Sie die Haut seitlich, bis der Fruchtknoten (Farbe orange) durch die Körperwand sichtbar ist.
    7. Machen Sie einen 5 mm-Schnitt in der Körperwand oberhalb der Eierstock mit der feinen Schere unter chirurgischen Binokular.
    8. Holen Sie die Fettpolster mit einer atraumatischen Bulldog-Klemme und herausziehen Sie des Eierstocks, der Eileiter und der Spitze des Uterus.
    9. Visualisieren Sie der Ampulle und machen Sie eine Hemisektion mit Vannas Schere auf das Segment der Eileiter, das Eierstöcke mit der Ampulle verbindet.
    10. Einführen der transferpipette Embryo und Eier in der Ampulle, Halt an die erste Luftblase in der Implantation Pipette zu liefern.
    11. Wiederholen Sie den Vorgang auf der zweite Eileiter.
    12. Die Haut mit Wunde Clips hautnah.
    13. Ort des Tieres bei der Beitreibung Kammer (39 ° C, 30-60 min) bis ganz wach.
    14. Wiederholen Sie schmerzstillende Injektion nach 12 h und 48 h bei Anzeichen von Schmerzen oder Stress.
    15. Wunde Clips ca. 7-10 Tage nach der Operation zu entfernen.
    16. Überprüfen Sie implantierte Weibchen für Schwangerschaft indem Sie ihre Gewichtskurve alle 3 Tage nach der Implantation. Eine signifikante Gewichtszunahme beobachtet werden 10 bis 12 Tage nach der Implantation und werden Richtwerte für die Schwangerschaft.
      Hinweis: Alle Embryonen, die hier Willen entwickeln werden stellen vermeintliche transgenen Gründer. Der Phänotyp der diese Gründer kann analysiert werden, in alle Entwicklungsphasen oder nach der Geburt nach wissenschaftlichen Fragestellung an die Generation dieser transgenen Tiere verbunden.

10. die Genotypisierung transgenen Gründer

  1. Bereiten Sie Genotypisierung Puffer mit 10 mM Tris-HCl, pH 8 vor; 5 mM EDTA, pH 8.0 mit 0,2 % SDS (w/V), 50 mM NaCl. Die Genotypisierung Puffer durch einen 0,22 µm-Filter zu sterilisieren und für mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern.
  2. Put extraembryonic Membranen (für Embryonen) oder kleines Stück Schwanz (für geborene Tiere) in 500 µL Genotypisierung Puffer gefiltert und fügen 15 µL Proteinase K (20 mg/mL). Inkubation über Nacht bei 55 ° C.
  3. Zentrifugieren Sie lysate 15.000 x g für 5 min und dann mit 1 µL des Überstandes für die PCR-Reaktion. Lysate kann bei 4 ° C mehrere Monate aufbewahrt werden.
  4. Durchführen Sie die PCR-Amplifikation eines Fragments des Transgens in einem 20 µL Reaktionsvolumen mit 1 X PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 0,2 µM jeder PCR-Primer, 1 UI Taq DNA-Polymerase und 1 µL jeder verdauten Probe. Als Negativkontrolle verwenden Sie 1 µL H2O. Als Positivkontrolle verwenden Sie DNA aus der Lentivirale Vektor-Plasmid enthält das Transgen.
  5. Für die Erkennung von eGFP beschrieben verwenden:
    eGFP Forward Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP Reverse Primer: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. PCR-Amplifikation in einem Thermocycler durchführen: 4 min bei 94 ° C, gefolgt von 35 Zyklen 1 min bei 94 ° C, 1 min bei 60 ° C und 2 min bei 72 ° C.
  7. Laden Sie das PCR-Produkt auf einem 2 % Agarose-Gel, um ein 300 bp eGFP PCR-Produkt wie in Abbildung 2 bdargestellt zu visualisieren.
    Hinweis: Alle Personen mit einer 300 bp PCR Band eGFP Transgen integriert haben und als Transgenik angesehen werden können.
  8. Transgene Ausdruck bei transgenen Tieren zu analysieren. Führen Sie beispielsweise histologischen und Immunostaining wie in Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellten und beschriebenen ergänzenden Methoden.
    Hinweis: Beide Transgene Ausdruck und Phänotyp-Analyse sollte mit entsprechenden Methoden nach globalen wissenschaftlichen Fragestellung durchgeführt werden.

11. die Quantifizierung des Transgens Exemplarzahl

  1. Quantitative PCR DNA-Proben vorbereiten.
    1. Genomischen DNA (gDNA) von der Proteinase K lysate erwarb Schritt 10.3 mithilfe eines kommerziellen Kits nach Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
    2. Quantifizieren Sie gDNA durch Spektralphotometrie bei 260 nm.
    3. Verdünnen Sie jede gDNA Probe, eine Endkonzentration von 10 ng/µL.
    4. Für jede Probe vorbereiten 5 serielle Verdünnungen (1:5) in H2O, 6 Rohre in den folgenden Konzentrationen zu erhalten: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL und 0.0032 ng/µL
  2. Die quantitative PCR (qPCR) Reaktion Mischung vorbereiten.
    1. Bereiten Sie den Primer-Mix für qPCR. Für jedes Paar der Grundierung für qPCR verwenden, fügen Sie 10 µL vorwärts Grundierung (100 µM Grundierung Stammlösung), 10 µL des rückwärts-Primer (100 µM) und 80 µL H2O.
      Hinweis: Um eGFP verstärken, verwenden Sie nach vorne TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA und Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG Primer. Cdx2 gen dient als Normalizer für qPCR (2 Exemplare pro Genom). Verwenden Sie für Cdx2 Normalizer vorwärts GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG und Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT Primern
    2. Bereiten Sie 2 qPCR-Mixe, eine mit dem eGFP-Grundierung-Mix und eine mit Cdx2 Grundierung Mix. Bereiten Sie ausreichend qPCR-Mischung, die 6 Verdünnungen Duplikate von jeder gDNA zu verstärken. Eine qPCR Reaktion enthält 3,8 µL H2O, 5 µL fluoreszierend grün 2 x Reaktion Mischung und 0,2 µL Grundierung-Mix.
      Hinweis: Für jedes transgenen Tier zu testen, werden 24 qPCR Reaktionen durchgeführt werden. Die Reaktion Mischung sorgt für eine 384 auch qPCR-Maschine.
    3. Für jedes Tier zu testen, zu verteilen: 12 Brunnen mit 9 µL eGFP qPCR Mix und 12 Brunnen mit 9 µL Cdx2 qPCR-Mix. 2 Brunnen mit den eGFP qPCR Mix 1 µL jeder gDNA Verdünnung hinzu und mischen Sie 2 Brunnen mit eGFP qPCR.
    4. Urlaub 2 Brunnen für jeden qPCR mischen in welche gDNA wurde durch H2O als Negativkontrolle ersetzen.
  3. 384-well-Platte in der qPCR-Maschine und die folgende laufenden Protokoll anwenden: 10 min bei 95 ° C dann 50 Zyklen von 10 s bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C.
  4. Analysieren von Daten. Zeichnen Sie für jedes gDNA testen die Ct-Werte als Funktion des Protokolls von insgesamt gDNA Betrag (6 Punkte in der Duplikate). Passen Sie die Kurve über lineare Regression mit der zuletzt Quadrat-Methode und extrapolieren Sie den Ct-Wert entspricht der Schnittpunkt mit der y-Achse zu. Die hochgerechneten Ct-Werte für eGFP und normalisierten Cdx2 verwenden, um die Kopienzahl eGFP relativ Cdx2 berechnen (2 Exemplare) mit den standard 2ΔdCt Methode11.

Ergebnisse

Transgene Tiere wurden mit dem hier vorgestellten Protokoll generiert. Vertreter führt beide allgegenwärtig und Zelle Art spezifische Transgene Ausdruck dargestellt.

Konstitutive Expression von transgenen

Allgegenwärtige Promotoren sind Grundlagenforschung Werkzeuge transgene in eine nachhaltige und effiziente Weise zum Ausdruck zu bringen. Diese Pr...

Diskussion

Die Perivitelline Injektion von Lentivirale Vektoren in befruchteten Eizellen, die hier beschriebenen führte zu die Herstellung von transgenen Embryonen, die mehr als 70 % der transgenen Embryonen bezogen auf die Gesamtzahl der gesammelten Embryonen ergab. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten und beispielhaft für die Besonderheit des Verfahrens2,7,10,11,

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Danksagungen

Wir danken Magali Dumont und Rolando Meloni für kritische Lektüre des Manuskripts und iVector und Phenoparc ICM Kerne für technische Unterstützung bei Lentivirale Vektor Produktion und Tier bzw. Gehäuse. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Institut Hospitalo Universitaire de Neurowissenschaften Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.r. erhielt die Mittel für die Association de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) und eine gemeinsame JDRF / INSERM gewähren.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
100 mm petri dishDutsher353003
4 wells Nunc dishDutsher56469IVF dish
M2 mediumSigmaM7167
M16 mediumSigmaM7292
0,22 µm Syringe filterDutsher146611
Hyaluronidase Enzyme 30mgSigmaH4272mouse embryo tested
Insulin seryngeVWR613-3867Terumo Myjector
Curved forcepsMoria2183
Curved scissorsMoriaMC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigmaA5177-5EA
Borosilicate glass capillariesHarvard apparatusGC 100-10
Horizontal micropipette pullerNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Inverted microscopeNikonTransferman NK2 5188Hoffman modulation contrast illumination is required
MicromanipulatorEppendorfCelltram air
Controler of holding pipetEppendorfFemtojet
Mineral oilSigmaM8410mouse embryo tested
MicroinjectorEppendorfFemtojetCan be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forcepsMoriaMC 40
vannas micro scissorsMoria9600
IsofluranecentravetISO005ISO-VET 100% 250ml
ocrygelcentravetOCR002
Povidone iodurecentravetVET001vetedine 120ml
BuprenorphinecentravetBUP002Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HClSigmaT5941Trizma hydrochloride
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653powder
proteinase KSigmaP2308 
oneTaq kitNEBM0480L
PrimersEurogentec
Strip of 8 PCR tube4titude4ti-0781
96 well thermal cyclerApplied Biosystems4375786Veriti
Genomic DNA mini kitinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master mixRoche4887352001SYBR Green 
Multiwell plate 384Roche5217555001
qPCR instrument 384 wellRoche5015243001LightCycler 480

Referenzen

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