Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Resumo

Há quase 40 anos, injeção de DNA pró-nuclear representa o método padrão para gerar ratos transgénicos com integração aleatória de transgenes. Um procedimento de rotina é amplamente utilizado em todo o mundo e sua principal limitação reside na eficácia da integração do transgene, resultando em um baixo rendimento dos animais fundador pobre. Apenas alguns por cento dos animais nascidos após a implantação de oócitos fertilizados injetados integraram o transgene. Em contraste, Lentivirus vetores são ferramentas poderosas para a transferência de genes integrativa e sua utilização para transduce oócitos fertilizados permite uma produção altamente eficiente do fundador ratos transgénicos com um rendimento médio acima de 70%. Além disso, toda a tensão do mouse pode ser usada para produzir animais transgénicos e a penetrância da expressão do transgene é extremamente elevada, acima de 80% com particulas de Lentivirus transgênese mediada comparado a microinjeção de DNA. O tamanho do fragmento de DNA que pode ser a carga pelo vetor de Lentivirus é limitado a 10 kb e representa a principal limitação deste método. Usando um simples e fácil de executar o procedimento de injeção por baixo da zona pelúcida de oócitos fertilizados, mais de 50 animais do fundador podem ser produzidos em uma única sessão da microinjeção. Tal método é altamente adaptado para executar, diretamente em animais fundador, ganho rápido e perda de estudos de função ou de regiões de DNA genômicas tela por sua capacidade de controlar e regular o gene expressão na vivo.

Introdução

O trabalho pioneiro de Gordon et al . em 1980 mostrou que, após a implantação em ratos pseudopregnant, a injeção de DNA de plasmídeo para o sexo masculino pró-núcleos de oócitos fertilizados pode render a produção de animais transgénicos que integrado a Plasmideo DNA¹. A demonstração de que os mamíferos transgênicos podem ser gerados teve um enorme impacto sobre ciências da vida globais, abrindo o caminho para novos campos de pesquisa, tanto para as ciências básicas e ciências biomédicas translacionais. Nas últimas quatro décadas, a microinjeção de DNA tornou-se uma prática de rotina. Embora um enorme número de ratos transgênicos foram produzido, o método padrão não é totalmente utilizável para todas as estirpes de rato e requer demorado retrocruzamentos^2,3. Sua aplicação a outras espécies permanece desafiador⁴ e o rendimento global de integração do transgene é limitado a alguns porcentagem de animais nascido⁵. Além disso, a eficácia da integração do transgene representa o fator limitante que explica o pobre rendimento total da injeção de DNA pró-nuclear. A este respeito, Integrativa vetores virais são as ferramentas mais eficientes para carga e integram transgenes em assim poderiam fornecer novos meios para aumentar significativamente o rendimento de integração, a única limitação é que o tamanho do transgene que não pode exceder 10 kb⁶ .

Particulas de Lentivirus vetores pseudo digitados com a proteína do envelope do vírus da estomatite Vesicular (VSV) são ferramentas de transferência do gene pantropic e altamente integrativa e podem ser usados para transduce oócitos fertilizados⁷. A zona pelúcida envolvendo oócitos é uma barreira natural de vírus e precisa ser passado para permitir a transdução com os vetores de Lentivirus. Animais transgénicos foram gerados pelo transducing oócitos fertilizados após micro perfuração ou remoção da zona pelúcida^8,9. No entanto, injeção sob a zona pelúcida no espaço perivitelline parece ser o método mais simples para transduce os ovos fertilizados como inicialmente descrito por Lois e colegas⁷.

A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores permite altos rendimentos na produção de animais transgénicos que estão acima de 70% dos animais nascidos. Tal rendimento é mais 10-fold maior do que o melhor rendimento que pode ser conseguido usando padrão pró-núcleos DNA injeção^7,10,11. Neste contexto, uma única sessão de injeções irá gerar pelo menos 50 fundadores transgénicos (F0). O grande número de fundadores é, portanto, compatível com fenotipagem do transgene efeito diretamente realizada em F0 ratos sem a necessidade de gerar linhas de rato transgénico. Esta vantagem permite a seleção rápida do efeito do transgene e é especificamente adaptada para executar na vivo ganho e perda de estudos de função dentro de semanas. Além disso, elementos reguladores do DNA podem também ser rapidamente analisados para mapear enhancers e motivos de DNA vinculados por fatores de transcrição^11,12. Com injeções pró-nuclear, transgenes integrar normalmente como várias cópias em um único locus. Com vetores de Lentivirus, integração ocorre em múltiplos loci como uma única cópia por locus^10,13. Portanto, a multiplicidade dos loci integrado é provavelmente associada a penetrância de expressão muito alta observada em fundadores transgénicos, que faz com que o novo modelo gerado mais robusto.

Importante, quando usando injeção pró-nuclear do ADN, visualização dos pró-núcleos durante o procedimento é absolutamente necessária. Essa limitação técnica impede o uso de oócitos fertilizados, provenientes de uma grande variedade de estirpes de rato. Portanto, a produção de um modelo transgênico em uma determinada tensão para qual pró-núcleos são invisíveis exige a produção de animais em uma cepa permissiva, seguido pelo menos 10 sucessivos retrocruzamentos para transferir o transgene no mouse desejado estirpe. Com as injeções de vetor de Lentivirus, perivitelline espaço é sempre visível e a injeção não requer habilidades altamente específicas. Por exemplo, ratos transgénicos de NOD/SCID que não são apropriados para injeção de pró-núcleos foram obtidos com o vector viral injeções¹⁴.

Aqui, apresenta-se um protocolo abrangente para permitir que a simples produção de camundongos transgênicos usando injeções de vetor de Lentivirus no espaço perivitelline de um embrião de fase de uma célula. Expressão do transgene controlada com qualquer onipresente ou promotores específicos de célula é descrito em detalhes.

O backbone de Lentivirus de ΔU3 de pTrip foi usado no presente estudo¹⁵. Esse vetor permite produzir vetores de Lentivirus defeituoso replicação, no qual a sequência de U3 foi parcialmente excluída para remover a atividade de promotor U3 e gerar um self inactivating vector (SIN)¹⁶. Estoques de vetor de Lentivirus foram produzidos por transfecção transiente de células HEK-293T com o p8.91 encapsulamento do plasmídeo (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, a codificação a estomatite vesicular (VSV) de vírus glicoproteína-G¹⁷e o ΔU3 de pTRIP pHCMV-G vector recombinante. O processo de produção detalhado é fornecido como métodos complementares.

Produção das unidades populacionais de vetor de Lentivirus de alta concentração é realizada em condições de biossegurança nível II (BSL-2). Isto é verdade para a maioria dos transgenes exceto oncogenes que têm de ser produzidos em BSL-3. Portanto, a produção em condições de BSL-2 para a maioria dos casos é suficiente. Além disso, o uso e a produção são geralmente desconectados para a maioria das agências reguladoras nacionais, lidando com organismos geneticamente modificados (OGM). Quantidades limitadas de replicação incompetente SIN Lentivirus vetores (abaixo de 2 µ g da proteína do capsídeo p24) podem ser usadas sob condições de BSL-1 conforme descrito pela agência francesa OGM, de acordo com as recomendações da União Europeia.

Protocolo

Todos os procedimentos que incluem trabalho animal têm aprovação ética e autorizados pelo Ministério francês de investigação e educação sob o número APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 e 05311.02. As instalações de animais ICM PHENOPARC foi credenciado pelo Ministério da agricultura francês sob o número de acreditação B75 13 19. O protocolo global necessita de executar cada procedimento dentro de um frame de tempo preciso que é resumido na Figura 1.

1. animal compra e preparação de compostos básicos

1. Compra de animais
   1. Ordem de 25 homens vasectomizados B6CBAF1/JRj que são 8 semanas de idade (geração F1 original cruza entre ♀C57Bl/6JRj e ♂CBA/JRj).
      Nota: Isolar os machos à chegada. Vasectomizado machos podem ser reutilizados pelo menos um ano.
      Mude as gaiolas em 3 semanas.
   2. Encomendar 50 B6CBAF1/JRj fêmeas que são 10 semanas de idade e mantém uma piscina de pelo menos 50 animais.
   3. Ordem de 10-15 C57BL/6JRj machos férteis que são 8 semanas de idade.
   4. Ordem 30 C57BL/6JRj as fêmeas que são 4 semanas de idade.
2. Anestesia e eutanásia
   1. Anestesia é realizada utilizando um volume de mistura de xilazina/cetamina 300μL, injectado intraperitonealmente (cetamina na dose de 150μg/g de massa corporal, xilazina, na dose de 0.15μg / g de peso corporal). Os animais são colocados sob aquecimento pad para ajustar a temperatura do corpo. Verificar os reflexos por beliscar a cauda do animal antes de iniciar o procedimento.
   2. A eutanásia foi realizada por deslocamento cervical. Decapitação foi incluída como um método secundário para confirmar a morte do animal. Eutanásia de embriões foi realizada por decapitação.
      Nota: Após a chegada, permitem que os animais um mínimo de 1 semana para se habituar a instalação (sem manipulação ou acasalamento). Importante, qualquer cepas de rato incluindo linhas transgénicas podem ser utilizadas como férteis machos e fêmeas férteis para superovulação. A escolha da variedade deve ser feita de acordo com os requisitos da questão científica.
3. Preparação de hormônio
   1. Adicionar 910 µ l de tampão PSMG (soro de égua grávida gonadotropina) em 1 frasco de liofilizado PMSG, fazer 100 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
      Nota: Cada alíquota contém 55 UI para 11 ratos. Nunca mantenha PMSG alíquotas para mais de 2 semanas após a primeira utilização.
   2. Adicione-se frasco hCG liofilizado, 2730 µ l de tampão de hCG (gonadotrofina coriônica humana) em 1. Faça 100 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
      Nota: Cada alíquota contém 55 UI para 11 ratos.
4. Preparação de hialuronidase
   1. 1 frasco de hialuronidase com 3 mL de meio de M2 para obter um 10 mg/mL de solução-mãe e fazer 50 alíquotas µ l de reconstituir. Em seguida, armazenar a-20 ° C.
5. Preparação de instrumentos de cirurgia
   1. Esterilize todos os equipamentos de cirurgia, usando o autoclave.

2. superovulação de doadoras

1. Em uma instalação animal usando 12 h dia - ciclos de noite, injetar PMSG às 14:00 no dia -3. Injete hCG às 12 da manhã de dia -1 e companheiro com os machos férteis logo após injeção de hCG.
2. Dia -3, adicionar 1 mL de solução de NaCl 0,9% estéril em 1 alíquota de 100 µ l de PMSG (55 UI). Injecte 10 fêmeas C57BL/6JRj com 100 µ l intraperitonealmente, usando uma seringa sem qualquer volume morto.
   Nota: Cada rato receberá 5 UI de PMSG.
3. Dia -1, adicione 1 mL de solução de NaCl 0,9% estéril em 1 alíquota de 100 µ l de hCG (55 UI). Injete os ratos que receberam a injeção de PMSG com 100 µ l de solução diluída de hCG (5UI) intraperitonealmente. Use uma seringa sem qualquer volume morto. Executar a injeção lentamente e esperar antes de retirar a agulha, para que o líquido não vaza.
   Nota: Cada rato receberá 5 UI de hCG. Injeção de hCG deve ser realizada 46 h após PMSG.
4. Coloque cada fêmea C57BL/6JRj na gaiola do macho garanhão diretamente após a injeção de hCG.
5. Verifique plugues vaginais na manhã do dia 0 e usar as fêmeas positivas para coletar ovos fertilizados.

3. preparar as fêmeas Pseudopregnant B6CBAF1/jRj

1. Acasalar com um macho vasectomizado o dia antes da coleta do ovo (dia -1) com 2 fêmeas de B6CBAF1/JRj às 17:00.
   Nota: É muito importante se acasalar com as fêmeas que são provenientes de gaiolas diferentes para evitar a sincronização de ciclos femininos. Isto irá aumentar o rendimento da obtenção de tampões vaginais. Além disso, não adicione uma fêmea para uma gaiola masculina que foi alterada nos últimos 2 dias. Eficácia do comportamento reprodutivo no sexo masculino é maior quando a gaiola é suja.

4. fertilizado ovos coleção

1. Preparação
   1. Adicione µ l 1450 de M2 a solução para preparar a solução de trabalho de hialuronidase hialuronidase.
   2. Coloque uma gota de 100 µ l de solução de trabalho de hialuronidase por fêmea, usada para produzir ovos fertilizados em uma placa de Petri de 100mm e manter à temperatura ambiente.
   3. Adicione 500 µ l do M16 em placas de 4 poços. Use 2 poços por tipo de Lentivirus vetores que será injetado: um bem irá conter os ovos injetados e o outro os que não injectada. Coloque as 4 placas bem na incubadora a 37 ° C com 5% CO₂ atmosfera.
2. Prepare-se pipetas para coleta e manipulação de embriões.
   1. Suavizar os capilares de hematócrito de vidro (75 mm/60 µ l), rodando o centro do tubo capilar de vidro duro na chama.
   2. Remova os capilares do calor tão rapidamente quanto possível e puxe-o para obter um tubo com diâmetro interno de cerca de 300 µm. Puxe o tubo de refrigeração para obter um tempo puro.
3. Recolha os ovidutos.
   1. Eutanásia em fêmeas C57BL/6JRj por deslocamento cervical às 09:00 no dia 0. Morte confirmada por decapitação.
      Nota: Este método de eutanásia foi aprovado pelo IACUC e segue as recomendações europeias.
   2. Realize uma grande incisão horizontal para abrir a cavidade abdominal com uma tesoura. O oviduto situa-se entre o útero e o ovário.
   3. Remova o mesometrium e a membrana carregando proeminentes vasos sanguíneos com pinça curvada.
   4. Separe o oviduto do ovário com pinça curvada.
   5. Use pinça curvada como um guia para cortar o oviduto do ovário usando tesouras curvas.
   6. Puxar o oviduto e corte do útero com uma tesoura curva.
      Cuidado: Não toque na ampola inchada que contém os ovos fertilizados. Execute todo o procedimento usando instrumentos esterilizados.
   7. Coloque todos recolhidos ovidutos M2 médio (prato de cultura de 35 mm) à temperatura ambiente
   8. Coloque 2 ovidutos na mesma gota de 100 µ l de solução de trabalho de hialuronidase (0,3 mg/mL).
4. Remova células cumulus de ovos fertilizados.
   1. Sob um estereomicroscópio, utilize 2 seringas de insulina: o primeiro que segure o oviduto e o segundo para rasgar a ampola e dispersar fertilizado ovos para a solução de trabalho de hialuronidase.
   2. Levar a pipeta de vidro preparado para a coleta de ovos e ligue-o para o tubo e um filtro de 0,22 μm montado no bocal para aspirar todos os ovos. Recolher todos os ovos e lavá-los pela passagem sucessiva em 6 diferentes gotas de 100 µ l de meio M2.
   3. Coloque os ovos fertilizados lavados na incubadora umidificado 37 ° C, com uma atmosfera de 5% de CO₂ em meio de M16.

5. fazer injeção pipetas

1. Use o tubo capilar de vidro de paredes finas (10-15 cm de comprimento) com um diâmetro externo de 1 mm e fixar este capilar no extrator micropipeta horizontal.
   Nota: Em extratores de pipeta mais horizontais, 3 parâmetros podem ser ajustados: calor energia, força e tempo de atraso entre aquecimento e puxando a puxar. Ajuste esses parâmetros para obter injetando pipetas que se assemelha o um apresentado na Figura 2A. Para os usuários que são rotineiramente realizando microinjeção de DNA, use as configurações padrão e ajustar o atraso entre aquecimento e puxando para alterar a forma global da ponta da pipeta.

6. fazer exploração pipetas

1. Use uma pipeta injetando para preparar a pipeta de exploração.
2. Anexe uma pipeta injetando um microforge. Corte a pipeta com o microforge para obter uma ponta aguda simétrica de 80 a 100 µm de diâmetro. Então polir a ponta com calor sobre o microforge para obter uma forma redonda simétrica sem sebes afiadas.

7. preparação da pipeta de injeção que contém o vetor de Lentivirus

1. Centrifugar a suspensão de vetor de Lentivirus 160 x g por 2 min para detritos frequentemente presentes nas existências de Lentivirus congeladas de Pelotas.
2. Recuperar o sobrenadante e transferir para um novo tubo de 0,5 mL em uma classe de segurança II.
3. Transferi 1 µ l do sobrenadante para uma pipeta de injeção, preparada conforme descrito na etapa 5, usando um Microcarregador.
4. Defina a pipeta de injeção sobre o titular do instrumento de micromanipulador o certo. Conectar-se a pipeta de exploração para a esquerda micromanipulador.
   Nota: O título de transdução do vetor de Lentivirus vai ser diretamente correlacionado com a eficácia da produção do fundador. De alta eficácia (> 70%), uso de vetores virais com um título na faixa de 100 ng de p24 capsídeo proteínas / µ l. O título é expressa em unidades de transdução (TU), o título deve ser acima de 10⁹ TU/mL. Estoques de vetor de Lentivirus devem ser produzidos por transfection transiente de 293T células com o plasmídeo de encapsidation p8.91, pHCMV-G, codificação da estomatite vesicular (VSV) de vírus glicoproteína-G, conforme descrito em métodos complementares¹⁸.

8. microinjecção

1. Dispense 8 µ l de meio M2 no centro de uma depressão slide e tampa com óleo parafínico leve (embriões testados) para evitar a evaporação.
2. Lugar 20 ovos à gota como menos dispersos quanto possível.
   Cuidado: Não faça bolhas quando depositar os embriões.
3. Certifique-se de que a ponta da pipeta de injeção é aberta. Se não, toque a pipeta de injeção com a pipeta de exploração.
4. Definir o microinjector para um tempo de injeção de 20 s.
   Nota: A viscosidade da suspensão viral permite visualização clara da dispersão do vetor viral no espaço perivitelline. A pressão de injeção deve ser ajustada a fim de preencher todo o espaço dentro de 20 s de injeção, que representa um volume de 10 a 100 pl. Pressão de injeção não deve exceder 600 hPa.
5. Aspire um óvulo fertilizado que contém 2 núcleos pro e 2 corpos polares com a pipeta de exploração sob o microscópio.
6. Injete o ovo com o microinjector usando as configurações descritas em 8.4, no espaço perivitelline.
   Cuidado: Não toque a membrana plasmática com pipeta de injeção.
7. Injetar tudo fertilizados ovos disponíveis em lotes de 20 ovos e colocar os ovos injetados imediatamente médio pré-aquecido e M16 da incubadora umidificado 37 ° C, com uma atmosfera de 5% de CO₂.
   Nota: Incube os ovos injetados por um período mínimo de 30 min após a injeção antes de transferências de embrião.

9. transferência de embriões em fêmeas Pseudopregnant B6CBAF1/JRj

1. Verificar plug cópula 16 h após o acasalamento as fêmeas B6CBAF1/JRj com machos de vasectomia B6CBAF1/JRj. Faça isso antes de iniciar a coleta de ovos.
2. Prepare-se pipetas de implantação do embrião injetado.
   1. Fazer pipetas de implantação de embriões conforme descrito para coleta e manipulação de embriões (etapa 4.2). Selecione pipetas com diâmetro interno de cerca de 150 µm com uma parte estreita em torno de 4-5 cm de comprimento.
      Nota: A dica deve ser chama lustrada, a fim de reduzir possíveis danos para os ovos ou o oviduto.
      1. Encha com óleo parafínico leve (embrião testado) logo acima do ombro da pipeta.
      2. Aspire a uma bolha de ar pequena, então M2 médio e, finalmente, uma segunda bolha de ar.
      3. Elaborar os embriões um atrás de outro para minimizar o volume total do meio que será injetado no oviduto juntamente com os embriões.
      4. Acaba por carregar uma gota muito pequena de óleo parafínico leve (embriões testados) de largura de cerca de um embrião.
         Atenção: Cuidado durante o manuseio da pipeta.
3. Transferência de embriões.
   1. Esterilize todos os instrumentos.
   2. Anestesia a fêmea usando uma injeção intraperitoneal de 300 μL de solução estéril de NaCl 0,9% contendo 150 μg por g de peso corporal de cetamina e 0,15 μg por g de peso corporal de xilazina.
   3. Verificar a profundidade da anestesia por beliscar a cauda do animal com fórceps e injetar subcutaneouly 0,1 mg/kg de analgésico (buprenorfina) antes de iniciar o procedimento.
   4. Barba de 2 cm em ambos os lados da parte traseira ao longo da medula espinhal ao nível da última costela.
   5. Coloque o mouse feminino sobre uma almofada de aquecimento e em um campo estéril. Corte uma janela de 2 x 2 cm no meio da parte traseira do mouse.
   6. Aplicar uma solução anti-séptica (10% iodeto de povidona) sobre a pele e fazer uma incisão transversal de 1 cm com uma tesoura e, em seguida, deslize a pele lateralmente até o ovário (cor laranja) é visível através da parede do corpo.
   7. Faça uma incisão de 5 mm na parede do corpo, logo acima do ovário com a tesoura bem sob um microscópio binocular cirúrgico.
   8. Buscar a almofada de gordura com uma braçadeira de buldogue atraumática e puxe para fora do ovário, oviduto e parte superior do útero.
   9. Visualize a ampola e fazer um hemisection com tesoura vannas no segmento oviduto que liga o ovário para a ampola.
   10. Introduzir a pipeta de transferência embrião e entregar os ovos para a ampola, parando na primeira bolha de ar na pipeta a implantação.
   11. Repita o procedimento na segundo oviduto.
   12. Perto da pele com clipes de ferida.
   13. Lugar do animal na recuperação de câmara (39 ° C, 30-60 min) até totalmente acordado.
   14. Repita a injeção analgésica após 12 h e 48 h no caso de sinais de dor ou sofrimento.
   15. Remova os clipes de ferida 7-10 dias após a cirurgia.
   16. Fêmeas de seleção implantada para a gravidez, seguindo a curva de peso em 3 dias após o implante. Um ganho de peso significativo pode ser observado de 10 a 12 dias após o implante e será indicativo para a gravidez.
       Nota: Todos os embriões que desenvolverão aqui vai representam putativos fundadores transgénicos. O fenótipo destes fundadores pode ser analisado em quaisquer fases do desenvolvimento, ou após o nascimento, de acordo com a questão científica ligados à geração destes animais transgénicos.

10. genotipagem fundadores transgénicos

1. Preparar a solução tampão de genotipagem com 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8.0 com SDS de 0,2% (p/v), 50 mM de NaCl. Esterilizar o buffer de genotipagem através de um filtro de 0,22 µm e armazenar em temperatura ambiente por vários meses.
2. Colocar as membranas extraembryonic (para embriões) ou pequeno pedaço da cauda (para animais nascidos) em 500 µ l do filtrado buffer de genotipagem e adicionar 15 µ l de proteinase K (20 mg/mL). Incubar durante uma noite a 55 ° C.
3. Centrifugue o lisado a 15.000 x g por 5 min e em seguida, use 1 µ l do sobrenadante para a reação de PCR. Lisado pode ser armazenado a 4 ° C por vários meses.
4. Execute a amplificação por PCR de um fragmento do transgene em um volume de reação 20 µ l contendo 1 tampão de x PCR, 1,5 mM MgCl₂, 200 µM de dNTPs, 0,2 µM cada primers de PCR, 1 UI de Taq DNA polimerase e 1 µ l de cada amostra digerida. Como um controle negativo, use 1 µ l de H₂O. Como um controle positivo, use o DNA do plasmídeo vetor de Lentivirus contendo o transgene.
5. Para a deteção de eGFP descreveu o uso:
   eGFP em frente da primeira demão: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
   eGFP Primer Reverse: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
6. Executar a amplificação por PCR em um thermocycler: 4 min a 94 ° C, seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, a 1 min a 60 ° C e 2 min a 72 ° C.
7. Carrega o produto do PCR em um gel de agarose 2% a fim de Visualizar um 300 bp eGFP produto PCR conforme ilustrado na Figura 2B.
   Nota: Todos os indivíduos apresentando uma banda PCR bp 300 integraram o transgene eGFP e podem ser considerados como transgênicos.
8. Analise a expressão do transgene em animais transgénicos. Por exemplo, executar histológica e imunocoloração como ilustrado na Figura 3 e Figura 4 e descrito em métodos complementares.
   Nota: Ambos análise de fenótipo e análise da expressão do transgene devem ser realizadas utilizando métodos pertinentes de acordo com a questão científica global.

11. a quantificação do número de cópia do Transgene

1. Prepare as amostras de DNA por PCR quantitativo.
   1. Extrair DNA genômico (gDNA) da Proteinase K lisado obtido na etapa 10.3 usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Quantificar gDNA por espectrofotometria em 260 nm.
   3. Dilua cada amostra gDNA a uma concentração final de 10 ng / µ l.
   4. Para cada amostra, preparar diluições em série 5 (1:5) em H₂O para obter 6 tubos nas seguintes concentrações: 10 ng / µ l, 2 ng / µ l, 0,4 ng / µ l, 0,08 ng / µ l, 0,016 ng / µ l e 0.0032 ng / µ l
2. Prepare a mistura de reação de PCR (qPCR) quantitativa.
   1. Prepare a mistura de cartilha para qPCR. Para cada par de primer usar para qPCR, adicionar 10 µ l de primer para a frente (solução de primer 100 µM), 10 µ l de primer reverso (100 µM) e 80 µ l de H₂O.
      Nota: Para amplificar eGFP, use primers para a frente TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA e TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG de reverter. Gene Cdx2 é usado como normalizador para o qPCR (2 cópias por genoma). Para Cdx2 normalizador usar primers para a frente GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG e inverter GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT
   2. Prepare 2 misturas de qPCR, uma com a mistura de cartilha de eGFP e um com mistura de cartilha Cdx2. Prepare a mistura de qPCR suficiente para amplificar as 6 diluições em duplicatas de cada gDNA. Uma reação de qPCR contém 3.8 µ l de H₂O, 5 µ l de fluorescente verde 2 x mistura de reação e 0,2 µ l de mistura da primeira demão.
      Nota: Para cada animal transgênico testar, 24 qPCR reações serão executadas. A mistura de reação é fornecida por uma máquina de 384 qPCR bem.
   3. Para cada animal testar, distribuir: 12 poços com 9 µ l de mistura de qPCR eGFP e 12 poços com 9 µ l do mix de qPCR Cdx2. Adicione 1 µ l de cada diluição gDNA 2 poços contendo a mistura de qPCR eGFP e 2 poços contendo a mistura de qPCR eGFP.
   4. Deixe 2 poços para cada qPCR misturam no qual gDNA foi substituir por H₂O como controlo negativo.
3. Coloque a placa bem 384 na máquina de qPCR e aplicar o seguinte protocolo de execução: 10 min a 95 ° C depois de 50 ciclos de 10 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C.
4. Analise os dados. Para cada gDNA testar, plotar os valores de Ct em função do Log do montante total gDNA (6 pontos em duplicatas). Ajustar a curva usando a regressão linear com o método menos quadrado e extrapolar o valor de Ct correspondente a interseção com o eixo y. Use os valores de Ct extrapolados para eGFP e o Cdx2 normalizado para calcular o número de cópia eGFP relativo Cdx2 (2 cópias) usando o método de padrão 2^{ΔdCt 11}.

Resultados

Animais transgénicos foram gerados usando o protocolo aqui apresentado. Representante resultados ambos onipresente e expressão de transgene específica de tipo de célula são ilustrados.

Expressão constitutiva de transgenes

Promotores onipresentes são ferramentas de pesquisa básica para expressar transgenes de forma sustentada e eficiente. Esses ...

Discussão

A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores em oócitos fertilizados descritos aqui resultou na produção de embriões transgênicos que rendeu mais de 70% dos embriões geneticamente modificados em relação ao número total de embriões coletados. Este resultado é consistente com relatórios anteriores e exemplifica a especificidade do procedimento^2,7,10,11,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG 50UI	Sigma	G4527
hCG 5000UI	Sigma	CG5-1VL
NaCl	Sigma	7982
100 mm petri dish	Dutsher	353003
4 wells Nunc dish	Dutsher	56469	IVF dish
M2 medium	Sigma	M7167
M16 medium	Sigma	M7292
0,22 µm Syringe filter	Dutsher	146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg	Sigma	H4272	mouse embryo tested
Insulin serynge	VWR	613-3867	Terumo Myjector
Curved forceps	Moria	2183
Curved scissors	Moria	MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries	Harvard apparatus	GC 100-10
Horizontal micropipette puller	Narishige	PN-30
Microforge	Narishige	MF-900
Inverted microscope	Nikon	Transferman NK2 5188	Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator	Eppendorf	Celltram air
Controler of holding pipet	Eppendorf	Femtojet
Mineral oil	Sigma	M8410	mouse embryo tested
Microinjector	Eppendorf	Femtojet	Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps	Moria	MC 40
vannas micro scissors	Moria	9600
Isoflurane	centravet	ISO005	ISO-VET 100% 250ml
ocrygel	centravet	OCR002
Povidone iodure	centravet	VET001	vetedine 120ml
Buprenorphine	centravet	BUP002	Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl	Sigma	T5941	Trizma hydrochloride
EDTA	Sigma	E9884
SDS	Sigma	436143
NaCl	Sigma	S7653	powder
proteinase K	Sigma	P2308
oneTaq kit	NEB	M0480L
Primers	Eurogentec
Strip of 8 PCR tube	4titude	4ti-0781
96 well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786	Veriti
Genomic DNA mini kit	invitrogen	K1820-02
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000C
qPCR Master mix	Roche	4887352001	SYBR Green
Multiwell plate 384	Roche	5217555001
qPCR instrument 384 well	Roche	5015243001	LightCycler 480