Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Résumé

Depuis près de 40 ans, injection d’ADN pronucléaire représente la méthode standard pour générer des souris transgéniques avec intégration aléatoire des transgènes. Une telle procédure systématique est largement utilisée dans le monde entier et sa principale limitation réside dans l’efficacité médiocre de l’intégration de transgene, ce qui entraîne un faible rendement des animaux fondateurs. Seulement quelques pour cent des animaux nés après l’implantation des ovocytes fécondés injectés ont intégré le transgène. En revanche, les vecteurs LENTIVIRAUX sont des outils puissants pour le transfert de gène intégrative et leur utilisation pour transmettre les ovocytes fécondés permet une production très efficace du fondateur de souris transgéniques avec un rendement moyen supérieur à 70 %. En outre, toute souche de souris peut être utilisé pour produire des animaux transgénique et la pénétrance d’expression du transgène est extrêmement élevée, supérieur à 80 % avec des gènes transgénèse médiée par rapport à la microinjection de DNA. La taille du fragment ADN qui peut être des marchandises par le vecteur lentiviral est limitée à 10 Ko et représente la limitation majeure de cette méthode. À l’aide d’un simple et facile à exécuter la procédure d’injection sous la zone pellucide des ovocytes fécondés, plus de 50 animaux fondateurs peut être produites en une seule séance de microinjection. Une telle méthode est très adaptée pour effectuer, directement aux animaux fondateurs, gain rapide et perte de fonction ou de régions d’ADN génomiques écran pour leur capacité à contrôler et réglementer gene expression in vivo.

Introduction

Le travail de pionnier de Gordon et coll. en 1980 ont montré qu’après l’implantation chez des souris pseudopregnant, l’injection d’ADN de plasmide dans pronucléus mâle d’ovocytes fécondés peut produire la production d’animaux transgéniques qui intègre la l’ADN de plasmide¹. La démonstration que les mammifères transgéniques peuvent être générés a eu un impact énorme sur les sciences de la vie mondiales, ouvrant la voie aux nouveaux champs de recherche pour les sciences fondamentales et sciences biomédicales translationnelles. Au cours des quatre dernières décennies, la microinjection de DNA est devenu une pratique courante. Bien qu’un grand nombre de souris transgéniques ont été produit, la méthode standard n’est pas parfaitement utilisable pour toutes les souches de souris et fonctionne avec votre temps rétrocroisements^2,3. Son application à d’autres espèces reste difficile⁴ et le rendement global de l’intégration des transgènes est limité à quelques pourcentage d’animaux né⁵. En outre, l’efficacité de l’intégration du transgène représente le facteur limitant qui explique le faible rendement global de pronucléaire injection d’ADN. À cet égard, les vecteurs viraux intégratives sont les outils les plus efficaces pour la marchandise et intègrent des transgènes et ainsi pourraient fournir de nouveaux moyens d’augmenter sensiblement le rendement de l’intégration, la seule limite étant que la taille du transgène qui ne doit pas dépasser 10Ko⁶ .

Les vecteurs LENTIVIRAUX Pseudo-aléatoire typés avec la protéine de l’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sont des outils de transfert de gène Pantropes et hautement intégrative et peuvent être utilisés pour transmettre des ovocytes fécondés⁷. La zone pellucide entourant les ovocytes est une barrière naturelle virus et doit être transmis pour permettre la transduction avec les vecteurs LENTIVIRAUX. Animaux transgéniques ont été générés par transduction ovocytes fécondés après forage au micro ou de la suppression de la zone pellucide^8,9. Cependant, injection sous la zone pellucide dans l’espace périvitellin semble être la méthode la plus simple pour transmettre les œufs fécondés initialement décrite par les Lois et les collègues⁷.

L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX permet des rendements élevés dans la production d’animaux transgéniques qui sont plus de 70 % des animaux nés. Ce rendement est de plus de 10 fois plus élevée que le meilleur rendement possible qui peut être réalisé à l’aide de standard pronucléus ADN injection^7,10,11. Dans ce contexte, une seule séance d’injections va générer au moins 50 fondateurs transgéniques (F0). Le grand nombre des fondateurs est, par conséquent, compatible avec phénotypage de l’effet de transgene directement effectuée sur des souris F0 sans la nécessité de produire des lignées de souris transgéniques. Cet avantage permet un dépistage rapide de l’effet du transgène et est spécifiquement adapté pour effectuer en vivo gain et perte de fonction dans les semaines. En outre, éléments régulateurs de l’ADN peuvent également être projetés rapidement pour mapper des exhausteurs et des motifs d’ADN liés par des facteurs de transcription^11,12. Pour les injections pronucléaire, transgènes intègrent généralement en plusieurs copies dans un locus unique. Avec les vecteurs LENTIVIRAUX, intégration se produit dans plusieurs loci en un seul exemplaire par locus^10,13. Par conséquent, la multiplicité des loci intégrée est probablement associée à la pénétrance de très haute expression observée chez les fondateurs transgéniques, qui rend le nouveau modèle généré plus robustes.

Ce qui est important, lorsque vous utilisez pronucléaire injection d’ADN, visualisation des pronucléi au cours de la procédure est absolument nécessaire. Cette limitation technique empêche l’utilisation d’ovocytes fécondés provenant d’une grande variété de souches de souris. Par conséquent, la production d’un modèle transgénique dans un spécifique de la souche pour laquelle pronucléus sont invisibles exige la production d’animaux dans une souche permissive suivie d’au moins 10 rétrocroisements successifs de transférer du transgène chez la souris désiré souche. Avec les injections de vecteur lentiviral, espace périvitellin est toujours visible, et l’injection ne nécessite pas de compétences très spécifiques. À titre d’exemple, les souris transgéniques NOD/SCID qui ne conviennent pas pour injection pronucléus ont été obtenus avec le vecteur viral injections¹⁴.

Un protocole complet est présenté ici, afin de permettre la simple production de souris transgéniques à l’aide d’injections de vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un embryon de scène une seule cellule. Transgene expression contrôlée soit omniprésente ou promoteurs spécifiques de la cellule est décrite en détail.

L’épine dorsale des gènes de pTrip ΔU3 a été utilisé dans cette étude de¹⁵. Ce vecteur permet de produire des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux de réplication dans lequel la séquence U3 a été partiellement supprimée pour supprimer l’activité du promoteur U3 et générer une inactivation automatique vector (SIN)¹⁶. Les stocks de vecteur lentiviral ont été produits par transfection transitoire des cellules HEK-293 t avec le p8.91 encapsulation plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, le pHCMV-G codant pour la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G¹⁷et le ΔU3 pTRIP vecteur recombinant. La procédure de production détaillé est fournie en tant que méthodes supplémentaires.

Production de stocks de vecteur lentiviral titre élevé est réalisée dans des conditions de biosécurité de niveau II (BSL-2). Cela est vrai pour la plupart des transgènes à l’exception des oncogènes qui doivent être produits au niveau de biosécurité 3. Par conséquent, la production dans des conditions de BSL-2 pour la plupart des cas est suffisante. En outre, l’utilisation et la production sont souvent déconnectés pour la plupart des organismes réglementaires nationales portant sur les organismes génétiquement modifiés (OGM). Une quantité limitée de réplication incompétent SIN vecteurs LENTIVIRAUX (en dessous de 2 µg de protéines de capside p24) peut être utilisée dans des conditions de BSL-1 tel que décrit par l’Office Français OGM en accord avec les recommandations de l’Union européenne.

Protocole

Toutes les procédures qui comprennent le travail animal ont obtenu une approbation éthique et ont été autorisés par le Ministère Français de la recherche et l’éducation sous le numéro APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 et 05311.02. L’animalerie de l’ICM PHENOPARC a été accrédité par le Ministère Français de l’Agriculture sous le numéro d’agrément B75 13 19. Le protocole général doit réaliser chaque acte dans un délai précis qui est résumé dans la Figure 1.

1. animal achat et préparation de base composés

1. Achat animaux
   1. Commandez 25 hommes vasectomisés B6CBAF1/JRj qui sont de 8 semaines d’âge (génération F1 d’original traverse entre ♀C57Bl/6JRj et ♂CBA/JRj).
      NOTE : Isoler les mâles à l’arrivée. Les hommes vasectomisés peuvent être réutilisés pendant au moins un an.
      Changer les cages toutes les 3 semaines.
   2. Commandez 50 femelles B6CBAF1/JRj que sont l’âge de 10 semaines et garder un bassin d’au moins 50 animaux.
   3. Commander 10-15 C57BL/6JRj mâles fertiles qui sont âgés de 8 semaines.
   4. Femelles de C57BL/6JRj commande de 30 qui sont âgés de 4 semaines.
2. Anesthésie et l’euthanasie
   1. L’anesthésie est effectuée à l’aide d’un volume de 300μL mélange de kétamine/xylazine, injecté par voie intrapéritonéale (kétamine à une dose de 150μg/g de poids corporel, xylazine à une dose de 0.15μg / g de poids corporel). Animaux est placés sous le coussin pour ajuster la température du corps chauffant. Vérifier les réflexes en pinçant la queue de l’animal avant de démarrer la procédure.
   2. L’euthanasie a été effectuée par dislocation cervicale. La décapitation a été incluse comme une méthode secondaire pour confirmer la mort de l’animal. L’euthanasie des embryons a été effectuée par décapitation.
      Remarque : À l’arrivée, laissez animaux un minimum de 1 semaine à s’habituer à l’installation (aucune manipulation ou accouplement). Ce qui est important, des souches de souris, y compris les lignées transgéniques peuvent être utilisés comme fertiles mâles et des femelles fertiles pour la superovulation. Le choix de la souche il faudrait selon les exigences de la question scientifique.
3. Préparation d’hormone
   1. Ajouter 910 µL de tampon de PSMG (enceintes Mare Serum Gonadotropin) dans 1 flacon lyophilisé de la PMSG, faire 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
      Remarque : Chaque aliquote contient 55 UI pour 11 souris. Ne jamais garder PMSG aliquotes pendant plus de 2 semaines après la première utilisation.
   2. Ajouter lyophilisé de 2730 µL de tampon de hCG (gonadotrophine chorionique humaine) dans 1 flacon de hCG. Faire 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
      Remarque : Chaque aliquote contient 55 UI pour 11 souris.
4. Préparation de l’hyaluronidase
   1. Reconstituer 1 flacon de hyaluronidase avec 3 mL de milieu de M2 pour obtenir un 10 mg/mL de solution mère et faire 50 µL d’extraits. Puis conserver à-20 ° C.
5. Préparation des outils de chirurgie
   1. Stériliser tous les outils de chirurgie à l’aide de l’autoclave.

2. superovulation des donateurs femelles

1. Dans une animalerie, à l’aide de 12 h jour - cycles nuit, injecter PMSG à 14:00 jour -3. Injecter des hCG à 12 h le jour -1 et le second avec des mâles fertiles juste après l’injection d’hCG.
2. Jour -3, ajouter 1 mL de solution de NaCl 0,9 % stérile dans 1 aliquote de 100 µL de PMSG (55 UI). Injecter 10 femelles C57BL/6JRj avec 100 µL par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue sans n’importe quel volume mort.
   Remarque : Chaque souris recevra 5 UI de PMSG.
3. Jour -1, ajouter 1 mL de solution de NaCl 0,9 % stérile en quantité de 1 100 µl d’hCG (55 UI). Injecter les souris qui ont reçu l’injection de PMSG avec 100 µL de la solution diluée de hCG (5UI) par voie intrapéritonéale. Utiliser une seringue sans n’importe quel volume mort. Effectuer l’injection lentement et attendre avant d’enlever l’aiguille pour que le liquide ne coule pas.
   Remarque : Chaque souris recevra 5 UI d’hCG. Injection de hCG doit être effectuée 46 h après PMSG.
4. Placer chaque femelle C57BL/6JRj dans la cage du mâle stud directement après l’injection d’hCG.
5. Vérifier vaginales bouchons dans la matinée du jour 0 et les femelles positives pour ramasser les œufs fécondés.

3. préparer les femelles Pseudopregnant B6CBAF1/jRj

1. Accoupler un mâle vasectomisé la veille de la collecte des œufs (jour -1) avec 2 femelles B6CBAF1/JRj à 17:00.
   Remarque : Il est très important de s’accoupler avec les femelles qui sont originaires de différentes cages afin d’éviter la synchronisation des cycles féminins. Cela augmentera le rendement de l’obtention des fiches vaginales. En outre, ne pas ajouter une femelle à une mâle cage qui a été changée au cours des 2 jours. L’efficacité du comportement reproducteur chez l’homme augmente quand la cage est sale.

4. fécondés Collection

1. Préparation
   1. Ajouter 1450 µL de M2 dans la solution mère de hyaluronidase pour préparer la solution de travail hyaluronidase.
   2. Déposer une goutte de 100 µL de solution de travail hyaluronidase par femelle permettant de produire des oeufs fécondés dans un 100 mm boîte de Pétri et conserver à température ambiante.
   3. Ajouter 500 µL de M16 en plaques de 4 puits. Utiliser 2 puits par type de vecteurs LENTIVIRAUX qui sera injectée : l’un contiendra bien les oeufs injectées et l’autre celles non injectées. Placer les 4 plaques bien dans l’incubateur à 37 ° C, avec une atmosphère de₂ CO 5 %.
2. Préparer les pipettes pour la collecte et du traitement des embryons.
   1. Adoucir les capillaires en verre hématocrite (75 mm/60 µL) en tournant le centre du tube capillaire verre dur dans la flamme.
   2. Retirer les capillaires du feu aussi rapidement que possible et tirez dessus pour obtenir un tube avec un diamètre intérieur d’environ 300 µm. Tirez sur le tube refroidi afin d’obtenir une pause soignée.
3. Recueillir les oviductes.
   1. Euthanasier les femelles C57BL/6JRj par dislocation cervicale à 09:00 au jour 0. La mort est confirmée par la décapitation.
      Remarque : Cette méthode d’euthanasie a été approuvée par l’IACUC et suit les recommandations européennes.
   2. Réaliser une grande incision horizontale pour ouvrir la cavité abdominale avec des ciseaux. L’oviducte est situé entre l’utérus et l’ovaire.
   3. Retirer le mesometrium et la membrane transportant des vaisseaux sanguins importants avec une pince courbe.
   4. Séparer l’oviducte de l’ovaire avec une pince courbe.
   5. Utilisez pince courbée comme guide pour découper l’oviducte de l’ovaire à l’aide de ciseaux courbes.
   6. Tirez l’oviducte et taillés dans l’utérus avec des ciseaux courbes.
      ATTENTION : Ne pas toucher l’ampoule gonflée qui contient les œufs fécondés. Effectuer toute la procédure à l’aide d’instruments stériles.
   7. Placer des oviductes tous recueillis dans milieu de M2 (boîte de Petri 35 mm) à température ambiante
   8. Placer 2 oviductes dans la même chute de 100 µL de solution de travail hyaluronidase (0,3 mg/mL).
4. Retirer les oeufs fécondés cellules du cumulus.
   1. Sous un stéréomicroscope, utiliser 2 seringues à insuline : le premier pour tenir l’oviducte et l’autre à déchirer l’ampoule et disperse les oeufs fécondés dans la solution de travail hyaluronidase.
   2. Tenir la pipette de verre préparée pour la collecte des oeufs et connectez-le à la tuyauterie et un filtre de 0,22 μm monté sur l’embout pour aspirer tous les oeufs. Recueillir tous les oeufs et les laver par passage successifs en 6 différentes gouttes de 100 µL de milieu de M2.
   3. Placez les oeufs fécondés lavés dans incubateur humidifié 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ dans un milieu M16.

5. prise de Pipettes d’Injection

1. Utilisez des tubes capillaires de verre à parois minces (10-15 cm de long) avec un diamètre extérieur de 1 mm et serrer ce capillaire dans l’horizontale de micropipettes.
   Remarque : En arrache plus horizontale de la pipette, 3 paramètres peuvent être ajustés : énergie thermique, en tirant la force et l’effet delay entre chauffage et en tirant. Ajuster ces paramètres pour obtenir des pipettes injection qui ressemble à celle présentée dans la Figure 2 a. Pour les utilisateurs qui effectuent régulièrement la microinjection de DNA, utilisez les paramètres standards et régler le délai entre le chauffage et en tirant pour modifier la forme globale de l’embout de la pipette.

6. faire Holding Pipettes

1. Une pipette d’injection permet de préparer la pipette de l’exploitation.
2. Fixer une pipette d’injection sur une microforge. Couper la pipette avec le microforge pour obtenir un bout pointu symétrique de 80 à 100 µm de diamètre. Puis polir le bout avec la chaleur sur la microforge pour obtenir une forme ronde symétrique sans haies vives.

7. préparation de la Pipette d’Injection contenant le vecteur Lentiviral

1. Centrifuger la suspension de vecteur lentiviral à 160 x g pendant 2 min granuler débris souvent présent dans les stocks des gènes figés.
2. Récupérer le surnageant et le transférer dans un nouveau tube de 0,5 mL dans une classe de sécurité II.
3. Transférer 1 µL du liquide surnageant dans une pipette d’injection préparée comme décrit à l’étape 5 à l’aide d’un Micro-chargeur.
4. Définissez la pipette d’injection sur le titulaire de l’instrument de la droit micromanipulateur. Connectez la pipette de tenue à la gauche micromanipulateur.
   NOTE : Le titre de transduction du vecteur lentiviral va être directement corrélé avec l’efficacité de la production du fondateur. Pour une efficacité élevée (> 70 %), utiliser des vecteurs viraux avec un titre dans l’ordre de 100 ng de p24 capside protéique/µL. Le titre est exprimée en unités de transduction (TU), le titre devrait être supérieur à 10⁹ TU/mL. Les stocks de vecteur lentiviral doivent être produits par transfection transitoire des cellules 293 t avec le plasmide d’encapsidation de p8.91, pHCMV-G, codage de la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G comme décrit dans méthodes complémentaires¹⁸.

8. la micro-injection

1. Administrer 8 µL de milieu M2 dans le centre d’une diapositive de la dépression et la couverture avec du pétrole léger (embryon testé) pour éviter l’évaporation.
2. Place 20 oeufs dans la baisse moins dispersés que possible.
   ATTENTION : Ne faites pas de bulles au moment du dépôt des embryons.
3. Assurez-vous que l’embout de la pipette d’injection est ouvert. Si ce n’est pas le cas, cliquez sur la pipette d’injection avec la pipette de l’exploitation.
4. La valeur de la microinjector pour un moment de l’injection de 20 s.
   Remarque : La viscosité de la suspension virale permet une visualisation claire de la dispersion du vecteur viral dans l’espace périvitellin. La pression d’injection doit être ajustée afin de combler tout l’espace intérieur 20 s d’injection, ce qui représente un volume de 10 à 100 pL. Pression d’injection ne doit pas dépasser 600 hPa.
5. Aspirer un ovule fécondé qui contient 2 noyaux pro et 2 corps polaires avec la pipette de tenue sous le stéréomicroscope.
6. Injecter le œuf avec le microinjector à l’aide de paramètres décrits en 8.4, dans l’espace périvitellin.
   ATTENTION : Ne pas toucher la membrane plasmique avec la pipette d’injection.
7. Injecter des oeufs fécondés tous disponible en lots de 20 oeufs et placer les oeufs injectés immédiatement dans un milieu M16 préchauffé dans l’incubateur humidifié 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO₂.
   NOTE : Incuber les œufs injectées pendant au moins 30 min après l’injection avant transferts d’embryons.

9. transfert des embryons dans les femelles pseudo-gravides B6CBAF1/JRj

1. Vérifiez la copulation fiche 16 h après l’accouplement B6CBAF1/JRj femelles avec des mâles de vasectomie B6CBAF1/JRj. Cela juste avant de commencer la collecte des œufs.
2. Préparer pipettes d’implantation de l’embryon injectée.
   1. Faire des pipettes d’implantation des embryons comme décrit pour la collecte et la manipulation des embryons (étape 4.2). Sélectionnez pipettes avec un diamètre intérieur d’environ 150 µm, avec une partie étroite d’environ 4-5 cm de longueur.
      Remarque : La pointe est flamme poli, afin de réduire les dommages possibles pour les oeufs ou l’oviducte.
      1. Remplir avec du pétrole léger (embryon testé) juste au-dessus de l’épaule de la pipette.
      2. Aspirer une petite bulle, puis M2 moyen et enfin une deuxième bulle d’air.
      3. Élaborer des embryons un derrière l’autre afin de minimiser le volume total de milieu qui est injecté dans l’oviducte ainsi que les embryons.
      4. Finition en chargeant une très petite goutte d’huile de paraffine légères (embryon testé) de largeur sur un embryon.
         ATTENTION : Soyez doux tout en gérant la pipette.
3. Transfert d’embryon.
   1. Stériliser tous les instruments.
   2. Anesthésier la femelle à l’aide d’une injection intrapéritonéale de 300 μL de solution stérile et NaCl 0,9 % 150 μg / g de poids corporel de kétamine et 0,15 μg / g de poids corporel de Xylazine.
   3. Vérifier la profondeur de l’anesthésie en pinçant la queue de l’animal avec une pince et injecter subcutaneouly 0,1 mg/kg d’analgésiques (buprénorphine) avant de démarrer la procédure.
   4. Se raser 2 cm des deux côtés de l’arrière le long de la moelle épinière au niveau de la dernière côte.
   5. Placez votre souris femelle sur un coussin chauffant et dans un champ stérile. Découper une fenêtre de 2 cm sur 2 cm au milieu du dos de la souris.
   6. Appliquer une solution antiseptique (10 % d’iodure de Povidone) sur la peau et faire une incision transversale de 1 cm avec des ciseaux, puis faites glisser la peau latéralement jusqu'à ce que l’ovaire (couleur orange) est visible à travers la paroi du corps.
   7. Faire une incision de 5 mm dans la paroi du corps juste au-dessus de l’ovaire avec les ciseaux fines au microscope binoculaire chirurgical.
   8. Ramasser les coussinets adipeux avec une pince de bouledogue atraumatique et sortir de l’ovaire, l’oviducte et le haut de l’utérus.
   9. Visualiser l’ampoule et faire une hémisection avec des ciseaux de vannas sur le segment de l’oviducte qui relie l’ovaire à l’ampoule.
   10. Introduire à la pipette de transfert embryonnaire et livrer des oeufs dans l’ampoule, s’arrêtant à la première bulle d’air dans la pipette de l’implantation.
   11. Répétez l’opération sur le deuxième oviducte.
   12. Bouchent la peau avec des clips de la plaie.
   13. Place l’animal dans la récupération de la chambre (39 ° C, 30-60 min) jusqu'à ce que tout à fait réveillé.
   14. Répéter l’injection analgésique après 12 h et 48 h en cas de signes de douleur ou de détresse.
   15. Retirez les clips de plaie 7-10 jours après la chirurgie.
   16. Vérifiez implanté les femelles pour la grossesse en suivant leur courbe de poids tous les 3 jours après l’implantation. Un gain de poids significatif peut être observé après l’implantation de 10 à 12 jours et sera indicatif pour la grossesse.
       Remarque : Tous les embryons qui vont se développer ici volonté représentent putatifs fondateurs transgéniques. Le phénotype de ces fondateurs peut être analysé à des stades de développement, ou après que la naissance selon la question scientifique liée à la génération de ces animaux transgéniques.

10. génotypage fondateurs transgéniques

1. Préparer un tampon génotypage contenant 10 mM Tris-HCl, pH 8 ; 5 mM EDTA, pH 8.0 avec du SDS de 0,2 % (p/v), 50 mM NaCl. Stériliser le tampon de génotypage à travers une 0,22 µm et conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.
2. Mettre les membranes extra-embryonnaires (pour les embryons) ou petit morceau de queue (pour les animaux nés) dans 500 µL de filtré tampon de génotypage et ajouter 15 µL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber une nuit à 55 ° C.
3. Centrifuger le lysat à 15 000 x g pendant 5 min, puis utilisez 1 µL de surnageant de la réaction PCR. Lysate peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois.
4. Effectuer l’amplification par PCR d’un fragment du transgène dans un volume de réaction 20 µL contenant 1 x PCR tampon, 1,5 mM MgCl₂200 µM des dNTPs, 0,2 µM de chaque amorces PCR, 1 UI de Taq DNA polymérase et 1 µL de chaque échantillon digéré. Comme témoin négatif, utilisez 1 µL d’H₂O. Comme témoin positif, utiliser l’ADN du plasmide vecteur lentiviral contenant le transgène.
5. Pour la détection d’eGFP décrit l’utilisation :
   eGFP Forward Primer : 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
   eGFP Reverse Primer : 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
6. Effectuer l’amplification par PCR dans un thermocycleur : 4 min à 94 ° C suivie de 35 cycles de 1 min à 94 ° C, 1 min à 60 ° C et 2 min à 72 ° C.
7. Charger le produit PCR sur un gel d’agarose de 2 % afin de visualiser un 300 bp eGFP produit PCR comme illustré dans la Figure 2 b.
   Remarque : Tous les individus présentant une bande PCR bp 300 ont intégré le transgène eGFP et peuvent être considérés comme des organismes transgéniques.
8. Analyser l’expression du transgène chez les animaux transgéniques. Par exemple, effectuer histologiques et immuno-coloration comme illustré à la Figure 3 et Figure 4 et décrites dans les méthodes supplémentaires.
   NOTE : Les transgene expression analyse et phénotype analyse doivent être effectuées à l’aide des méthodes pertinentes selon la question scientifique mondiale.

11. quantification du nombre de copies de transgènes

1. Préparer les échantillons d’ADN pour PCR quantitative.
   1. Extraire l’ADN génomique (ADNg) de la protéinase K lysat obtenu à l’étape de 10,3 à l’aide d’une trousse commerciale conformément aux instructions du fabricant.
   2. Quantifier l’ADNg par spectrophotométrie à 260 nm.
   3. Diluer chaque échantillon ADNg à une concentration finale de 10 ng/µL.
   4. Pour chaque échantillon, préparer 5 dilutions successives (1:5) en H₂O d’obtenir 6 tubes pour les concentrations suivantes : 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL et 0,0032 ng/µL
2. Préparer le mélange de réaction quantitatif PCR (qPCR).
   1. Préparer le mélange de l’apprêt pour qPCR. Pour chaque couple d’amorces à utiliser pour qPCR, ajouter 10µl d’apprêt avant (solution d’amorce 100µm), 10 µL d’apprêt inverse (100 µM) et 80 µL d’H₂O.
      Remarque : Pour amplifier eGFP, utiliser les amorces TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA Forward et Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG. CDX2 gène sert normalisateur pour le qPCR (2 copies par génome). Pour Cdx2 normalisateur utiliser les amorces GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG Forward et Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT
   2. Préparer les 2 mélanges de qPCR, un avec le mélange d’apprêt eGFP et l’autre avec mélange d’apprêt Cdx2. Préparer le mélange de qPCR suffisante pour amplifier les 6 dilutions en double de chaque ADNg. Une réaction de qPCR contient 3,8 µL d’H₂O, 5 µL de fluorescent vert 2 x mélange réactionnel et 0.2 µL du mélange de l’apprêt.
      Remarque : Pour chaque animal transgénique tester, 24 réactions qPCR seront effectuées. Le mélange réactionnel est fourni pour une machine à 384 puits qPCR.
   3. Pour chaque animal tester, distribuer : 12 puits avec 9 µL du mélange de qPCR eGFP et 12 puits avec 9 µL du mélange de qPCR Cdx2. Ajouter 1 µL de chaque dilution ADNg 2 puits contenant le mélange de qPCR eGFP et 2 puits contenant le mélange de qPCR eGFP.
   4. Congé de 2 puits pour chaque qPCR mélangent dans laquelle ADNg a été remplacer par H₂O comme contrôle négatif.
3. Placer la plaque 384 puits dans la machine de qPCR et appliquer le protocole en cours d’exécution suivant : 10 min à 95 ° C puis 50 cycles de 10 s à 95 ° C et 1 min à 60 ° C.
4. Analyser les données. Pour chaque ADNg tester, tracer les valeurs de Ct en fonction du Log du montant total ADNg (6 points en double). Ajustement de la courbe de régression linéaire par la méthode des moindres carrée et extrapoler la valeur de Ct correspondant à l’intersection avec l’axe des y. Les valeurs de Ct extrapolées pour eGFP et le Cdx2 normalisée permet de calculer le nombre de copies eGFP par rapport à Cdx2 (2 exemplaires) à l’aide de la méthode standard 2^{ΔdCt 11}.

Résultats

Animaux transgéniques ont été générés en utilisant le protocole présenté ici. Représentant les résultats tant omniprésents et expression de transgene spécifiques de type de cellule sont illustrées.

Expression constitutive de transgènes

Promoteurs omniprésents sont des outils de recherche fondamentale pour exprimer des transgènes de faç...

Discussion

L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX dans les ovocytes fécondés décrites ici a entraîné la production d’embryons transgéniques qui ont rapporté plus de 70 % d’embryons transgéniques par rapport au nombre total d’embryons collectés. Ce résultat est conforme aux précédents rapports et illustre la spécificité de la procédure^2,7,10,11,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG 50UI	Sigma	G4527
hCG 5000UI	Sigma	CG5-1VL
NaCl	Sigma	7982
100 mm petri dish	Dutsher	353003
4 wells Nunc dish	Dutsher	56469	IVF dish
M2 medium	Sigma	M7167
M16 medium	Sigma	M7292
0,22 µm Syringe filter	Dutsher	146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg	Sigma	H4272	mouse embryo tested
Insulin serynge	VWR	613-3867	Terumo Myjector
Curved forceps	Moria	2183
Curved scissors	Moria	MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries	Harvard apparatus	GC 100-10
Horizontal micropipette puller	Narishige	PN-30
Microforge	Narishige	MF-900
Inverted microscope	Nikon	Transferman NK2 5188	Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator	Eppendorf	Celltram air
Controler of holding pipet	Eppendorf	Femtojet
Mineral oil	Sigma	M8410	mouse embryo tested
Microinjector	Eppendorf	Femtojet	Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps	Moria	MC 40
vannas micro scissors	Moria	9600
Isoflurane	centravet	ISO005	ISO-VET 100% 250ml
ocrygel	centravet	OCR002
Povidone iodure	centravet	VET001	vetedine 120ml
Buprenorphine	centravet	BUP002	Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl	Sigma	T5941	Trizma hydrochloride
EDTA	Sigma	E9884
SDS	Sigma	436143
NaCl	Sigma	S7653	powder
proteinase K	Sigma	P2308
oneTaq kit	NEB	M0480L
Primers	Eurogentec
Strip of 8 PCR tube	4titude	4ti-0781
96 well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786	Veriti
Genomic DNA mini kit	invitrogen	K1820-02
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000C
qPCR Master mix	Roche	4887352001	SYBR Green
Multiwell plate 384	Roche	5217555001
qPCR instrument 384 well	Roche	5015243001	LightCycler 480