التحديد الكمي لاستعمار الكوليرا والإسهال في النموذج الزرد الكبار

Dhrubajyoti Nag; Kristie Mitchell; Paul Breen; Jeffrey H. Withey

doi:10.3791/57767

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هي الزرد طبيعية الكوليرا استضافة ويمكن استخدامها للخص ودراسة دورة المعدية بأكملها من الاستعمار إلى انتقال العدوى. هنا، نحن لشرح كيفية تقييم مستويات الاستعمار ضد الكوليرا والإسهال في الزرد كمياً.

Abstract

الضمة الكوليرية أفضل المعروف كعامل المعدية التي تسبب الكوليرا الأمراض البشرية. خارج المضيف البشرية، ضد الكوليرا أساسا موجود في البيئة المائية، حيث يتفاعل مع مجموعة متنوعة من الأنواع المائية أعلى. الأسماك فقاريات معروفة ليكون مضيف بيئية ومحتملة ضد الكوليرا خزان في الطبيعة. ضد الكوليرا وأنواع الأسماك تيليوست دانيو rerio، المعروف الزرد، تنبع من شبه القارة الهندية، مما يوحي بوجود تفاعل منذ أمد بعيد في البيئات المائية. الزرد كائن نموذج مثالي لدراسة جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك الأمراض المعدية. الزرد يمكن أن تكون بسهولة وسرعة من استعمر ضد الكوليرا بعد التعرض في المياه. استعمار الأمعاء ضد الكوليرا يؤدي إلى إنتاج الإسهال وإفراز منسوخة ضد الكوليرا. هذه تفرز البكتيريا يمكن ثم انتقل إلى استعمار جديد الأسماك المضيفين. هنا، نحن لشرح كيفية تقييم ضد الكوليرا-استعمار الأمعاء في الزرد، وكيفية قياس ضد الكوليرا-التي يسببها الإسهال الزرد. نموذج الاستعمار ينبغي أن تكون مفيدة للباحثين الذين يدرسون ما إذا كانت الجينات للفائدة قد تكون هامة لاستعمار المضيف و/أو للبقاء على قيد الحياة البيئية. التحديد الكمي للإسهال الزرد ينبغي أن يكون مفيداً للباحثين الذين يدرسون أي مسببات الأمراض المعوية المهتمين باستكشاف الزرد كنظام نموذجي.

Introduction

الضمة الكوليرية هو بكتيريا سلبية الغرام المائية، والذي يسبب مرض الكوليرا فضلا عن الإسهال متفرقة¹^،². خامسا-الكوليرا وجدت في البيئة في مناطق كثيرة من العالم، وغالباً ما ترتبط مع غيرها من الكائنات المائية. وتشمل هذه الكائنات تربط العوالق والجماهير بيض الحشرات والرخويات والأسماك الفقارية الأنواع³^،⁴^،⁵^،^،من⁶⁷. وقد عزل العديد من الدراسات ضد الكوليرا من أصقاع المعوية من الأسماك في مناطق جغرافية مختلفة⁷^،^،من⁸⁹^،¹⁰. الوجود ضد الكوليرا في الأسماك يشير إلى أن الأسماك قد تعمل كخزان بيئية. يمكن أن يكون تورط الأسماك أيضا في نقل المرض إلى البشر وفي انتشار جغرافي ضد الكوليرا سلالات⁶.

لفهم كيفية تفاعل ضد الكوليرا مع الأسماك، وضعت دانيو rerio، المعروف الزرد، كنظام نموذجي لدراسة ضد الكوليراه¹¹. الزرد أصلية في جنوب آسيا، بما في ذلك منطقة خليج البنغال، الذي يعتقد أنه أقرب خزان ضد الكوليرا. قبل بداية وباء الكوليرا الأولى في 1817، لم يبلغ الكوليرا خارج ما هو الآن في الهند وبنغلاديش. ولذلك، الزرد و ضد الكوليرا يكاد يكون من المؤكد المرتبطة مع بعضها البعض عبر مقاييس زمنية تطورية، مما يوحي بأن الزرد مجموعة ضد الكوليرا في البيئة الطبيعية¹².

بسيط لتنفيذ نموذج الزرد ضد الكوليرا ويمكن استخدامها لدراسة كامل الممرضة ضد الكوليرا دورة الحياة. تتعرض الأسماك ضد الكوليرا بالاستحمام في المياه التي قد تم تلقيح مع عدد معروف من ضد الكوليرا. في غضون ساعات قليلة، تجري استعمار الأمعاء، يليه إنتاج الإسهال. يتكون الإسهال الميوسين والبروتينات، أغلبه البكتيريا وغيرها من محتويات الأمعاء. يمكن قياس درجة الإسهال باستخدام القياسات البسيطة قليلة¹³. ضد الكوليرا التي قد تم تفرز بالأسماك المصابة يمكن ثم انتقل إلى تصيب الأسماك السذاجة، واستكمال دورة المعدية. ولذلك، يلخص النموذج الزرد ضد الكوليرا مرض بشري العملية¹²^،¹⁴.

الأكثر استخداماً ضد الكوليرا نماذج حيوانية تاريخيا الفئران والأرانب¹⁴^،^،من¹⁵¹⁶^،^،من¹⁷¹⁸. هذه النماذج قد ساعدت في إضافة إلى معرفتنا بالمرضية ضد الكوليرا . ومع ذلك، نظراً للفئران والأرانب ليست طبيعية ضد الكوليرا المضيفين، هناك قيود يمكن أن يدرس ما هي جوانب دورة حياة ضد الكوليرا . الاستعمار ضد الكوليرا من الفئران والأرانب يتطلب عادة غياب المعوية الحجمية أو المعالجة بالمضادات الحيوية للتلف الحجمية المعوية. تتطلب كلا النموذجين تزقيمية لإدخال البكتيريا الجهاز الهضمي أو التلاعب الجراحية مباشرة حقن البكتيريا في الأمعاء. الزرد يتمتعون بميزة هي سهولة استعمرت الأسماك الكبار مع الحجمية الأمعاء سليمة وعملية المعدية يحدث بطبيعة الحال، دون أي تلاعب المطلوبة.

يوضح هذا العمل الاستفادة الزرد كنموذج للإصابة ضد الكوليرا . سوف تكون العدوى وتشريح وتعداد المستعمر ضد الكوليرا، والتحديد الكمي للإسهال الناجم عن ضد الكوليرا وصف¹²^،¹³. هذا النموذج من المحتمل أن تكون مفيدة للعلماء المهتمين في عملية المرض ضد الكوليرا وفي نمط الحياة البيئية ضد الكوليرا .

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية وين. وكان أول من وصف هذا الأسلوب في رونفت et al. ¹²

1-تحديد مستويات استعمار الأمعاء

ملاحظة: استعمار الأمعاء هو المقياس الأكثر فائدة في النموذج الزرد كما يمكن استخدامه لمقارنة اللياقة البدنية النسبية من سلالات مختلفة ضد الكوليرا أو آثار الطفرات أو الجينات بالضربة القاضية.

تطعيم الزرد بالغمر
ملاحظة: هذا يعني التعرض لتمثل المسار الطبيعي للعدوى.
1. إعداد ضد الكوليرا
  1. تلقيح 5 مل مرق ليسوجيني (رطل) مع معزولة ضد الكوليرا مستعمرة من رطل لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز (180 لفة في الدقيقة) عن 6 – 8 ح (الثقافة بين عشية وضحاها).
  2. تلقيح 25 مل من الطازجة المتوسطة رطل يعقم في قارورة مخروطية 250 مل مع 50 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها أعلاه. احتضانها من أجل ح 16 – 18 في 37 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة).
  3. قراءة الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD₆₀₀) من 1/10 إضعاف الثقافة بين عشية وضحاها تقدير العدد من البكتيريا كل مل (OD₆₀₀ = 1 هو ~ 10⁹ زيمبابوي/mL.)
  4. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 6,000 ز لأدنى 10 إزالة وسائل الإعلام مع ماصة أو من أجل إيقاف في حل مطهر. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة إلى التركيز المطلوب، عادة ما بين 1 × 10⁷ إلى 1 × 10¹⁰ لكل مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: هنا، نشير إلى يعقم ماء التناضح العكسي التي تحتوي على أملاح البحر 60 مغ/لتر كالماء العدوى العقيمة.
2. التلقيح والحضانة
  1. ضع الزرد أربعة أو خمسة إلى 400 مل كوب يحتوي على 200 مل من الماء العدوى العقيمة.
  2. أضف 1 مل من ضد الكوليرا (من الخطوة 1.1.1.4.) للحصول على تركيز العدوى المطلوب (عادة 5 × 10⁴ إلى 5 × 10⁷ زيمبابوي/mL) في 200 مل من الماء العدوى.
  3. تغطية الكأس بغطاء مثقب لمنع السمك من القفز؛ الجزء العلوي من مربع تلميح 200 ميليلتر يعمل جيدا لهذا.
  4. قم بتسمية كل الكأس ووضعها في حاضنة الزجاج الأمامي تعيين عند 28 درجة مئوية خلال مدة التجربة.
3. الداخلي للتعرض عابرة
  ملاحظة: تعرض عابرة إلى ضد الكوليرا (عادة 6 ح) متبوعاً بإزالة البكتيريا إينوكولاتينج مفيد لدراسة الانتقال وتقدير أكثر دقة للبكتيريا أغلبه.
  1. بعد 6 ح تعرض، صب الماء كوب من خلال شبكة صيد السمك لجمع الأسماك. تجاهل المياه المصابة في وعاء للتبييض بالقتل ضد الكوليرا.
  2. ضع الأسماك تمت إزالتها في كوب 200 مل من الماء العدوى العقيمة. السماح للأسماك على السباحة في هذه المياه النظيفة لمدة 5 دقائق لإزالة البكتيريا السطحية من الأسماك.
  3. كرر الإجراء الصافي (الخطوة 1.2.2) والأسماك في كوب جديد 200 مل مياه العدوى العقيمة. الحفاظ على الأسماك في هذا الكأس طوال فترة التجربة.
القتل الرحيم
1. عندما وصلت هذه التجربة في النهاية المرجوة، أخذ عينة من الإصابة المياه (15 مل عادة كافية) للسماح للتهم البكتيرية أغلبه، وقياس الإسهال (مثل المقايسة الميوسين محتوى البروتين و/أو OD)، إذا كان المطلوب (القسم 2).
2. صب التبييض بالقتل ضد الكوليرا في المياه قبالة ما تبقى المياه من خلال شبكة صيد السمك (لجمع الأسماك).
3. ضع السمك في كوب يحتوي على الإصابة بالمياه بالإضافة إلى 336 ميكروغرام/مل من إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (تريكيني) واحتضان السمك في هذا الحل تريكيني لمدة 20 دقيقة في الرايت
  ملاحظة: تم تعقيمهن fishnets مع حل التبييض 10%.
تشريح
1. إعداد الأسماك
  1. حلج القطن سمكة خارج الحل تريكايني مع ملعقة بلاستيك القابل للتصرف ووضعه على سطح تشريح.
  2. موقف الأسماك تواجه الجانب البطني إلى الأعلى ورقم التعريف الشخصي أنه عن طريق الفك السفلي، مع نهاية حادة من الدبوس الزاوية بعيداً عن مركز الجسم. مكان طرف آخر الخلفي فقط لفتحه الشرج، الزاوية أيضا بعيداً عن الجسم.
2. التعرض للامعاء
  1. وانخفض مسحه السطح البطني من الأسماك مع مسح خالية من الوبر في الإيثانول 70%.
  2. تعقيم دون مشرط ومقص فانس غمس لهم في الإيثانول 70% ويلهب لهم.
  3. جعل شق صغير طوليا في بطن فقط تحت الجلد باختراق الجداول واستخدام دون مشرط. أن يكون حريصا على عدم قطع عميقا جداً، كما الأمعاء يقع فقط تحت الجلد.
  4. باستخدام المقص، توسيع الشق بعناية على طول الجسم، وقطع لا أعمق من مستوى الجلد وتجنب فتحه الشرج.
  5. جعل التخفيضات الجانبية اثنين مع المقص تجاه رئيس الأسماك للسماح فتح الشق.
  6. دبوس الجلد على كل جانب من الشقوق الجانبية إلى السطح تشريح، الصيد دبابيس، بعيداً عن الجسم.
    ملاحظة: تم سابقا تعقيمهن نصائح المسامير التي يلهب بها مع الكحول.
3. إزالة الأمعاء
  ملاحظة: يجب أن تكون مرئية كأنبوب شاحب، رقيقة جداً على رأس الأجهزة الأخرى في الأمعاء.
  1. لهب-تعقيم الملقط وثم استخدامها لإزالة كامل الأمعاء (عادة 12 – 15 ملم في الطول). ضع الأمعاء في أنبوب تجانس التي تحتوي على حبات الزجاج (انظر الخطوات 1.4.1–1.4.2) و 1 مل 1 x برنامج تلفزيوني أو رطل, على الجليد.
تجانس
1. إعداد أنابيب التجانس مقدما بصب غ ~1.5 من حبات الزجاج 1 ملم إلى 2 مل أنابيب ملولبة (ملء لهم في منتصف الطريق تقريبا) وتعقيم ثم لهم بالتعقيم.
2. أضف 1 مل من رطل العقيمة أو برنامج تلفزيوني x 1.
3. وبمجرد الأمعاء الزرد المسمار المضافة (الخطوة 1.3.3.1) للأنابيب، القبعات على شكل محكم جداً، وثم تأمين الأنابيب في الخالطون دوامة.
4. مجانسة العينات لمدة 1 دقيقة على إعداد الحد الأقصى، ثم بارد لهم على الجليد للحد الأدنى 1 – 2 كرر دورة التجانس هذا مرة أخرى تجانس كامل.
  ملاحظة: سوف تعمل عدة أساليب بديلة لتحقيق التجانس أيضا.
قياس مستويات استعمار الأمعاء
1. إعداد الأنابيب (أنابيب اختبار زجاجية صغيرة أو 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب) لتمييع المسلسل هوموجيناتي عن طريق إضافة ميليلتر 900 رطل أو برنامج تلفزيوني x 1 لكل أنبوبة. لكل الأسماك، إعداد أنابيب 5 – 6 وجعل الوقت تخفيف المسلسل من هوموجيناتي المعوية بإضافة 100 ميليلتر من هوموجيناتي إلى الأنبوب الأول، فورتيكسينج إلى المزيج، ومن ثم إضافة 100 ميليلتر من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الثاني.
2. كرر هذا الإجراء إلى تخفيف جميع قد أعدت.
3. 100-200 ميليلتر لتمييع كل رطل أجار لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين (في حالة استخدام سلالات مقاومة ستربتوميسين) و 40 ميكروغرام/مل من X-غال (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) على لوحة. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية ح 16 – 18.
4. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، عد المستعمرات ضد الكوليرا في اللوحات، وأما باستخدام عداد مستعمرة الآلي أو يدوياً عد المستعمرات؛ أنه من المفيد بمناسبة المستعمرات التي تم جردها مع تلميح ماركر.
5. تحديد زيمبابوي في الأمعاء السمك بضرب العدد لوحة عامل التخفيف من التعليق، آخذا في الاعتبار وحدة التخزين التي تم مطلي.

2-قياس إسهال السمك

ملاحظة: استخدمت أربعة مقاييس مختلفة لتقييم الإسهال الأسماك: مستويات الميوسين في الماء، ومستويات البروتين أغلبه عموما في الماء، والتطوير التنظيمي₆₀₀ من الماء، و ضد الكوليرا زيمبابوي في المياه¹³. الإسهال عادة ما تتضح بصريا حوالي 6 ح بعد تعرض الزرد إلى ضد الكوليرا كما هو موضح أعلاه.

تحديد مستويات الميوسين
ملاحظة: إفراز الميوسين فعل أثناء الاستعمار ضد الكوليرا ، وهو مقياس جيد لمستويات إفراز، خصوصا في المراحل الأولى في إصابة¹³. والرزن الميوسين اختلاف في حمض الدوري microtiter شيف المقايسة¹⁹.
1. إعداد المواد التالية: 50% (w/v) حمض الدوري حل الأسهم وحل العامل حمض الدوري 0.1% (10 ميليلتر الأسهم حمض الدوري 50% إضافة إلى 5 مل حمض الخليك 7% — استخدم فورا بعد إجراء)، المعايير الميوسين، ولوحات microtiter 96، حسنا، شيف كاشف.
  1. إعداد معايير الميوسين بتعليق المبالغ التالية من الميوسين (من نوع المعدة الخنزير الثالث) في المخزن مؤقت خلات صوديوم (pH خلات، يدتا 5 مم، الصوديوم 100 مم إلى 5.5 مع حمض الخليك الجليدية): 400 ميكروغرام/ملليلتر، 300 ميكروغرام/مل، 200 ميكروغرام/مل، 150 ميكروغرام/مل ، 100 ميكروغرام/مل 75 ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل، 25 ميكروغرام/مل و 10 ميكروغرام/مل.
    إعداد اللوحة عن طريق إضافة 100 ميليلتر من الإصابة بالماء لكل بئر التي سيتم استخدامها في مقايسة النحو التالي: فارغة 1 x PBS؛ الميوسين المعايير كما هو موضح أعلاه، أو عينة مياه من العدوى الأسماك. كل عينة في ثلاث نسخ.
2. إضافة 50 ميليلتر من 0.1% حمض الدوري حل جديدة لكل جيدا مع ماصة متعددة القنوات وأنها مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات.
3. التفاف اللوحة محكم في غلاف بلاستيكي واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية ح 1 – 1.5.
4. بارد لوحة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة عن 5 – 10 دقيقة إضافة 100 ميليلتر حل فوكسين (كاشف شيف الشعبية) لكل بئر، وبيبيت صعودا وهبوطاً لمزجها.
5. التفاف اللوحة في غلاف بلاستيكي واحتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز حتى وضعت اللون؛ عموما هو وضع اللون ضمن 20 دقيقة قراءة امتصاص في 560 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
6. رسم منحنى قياسي الميوسين (OD₅₆₀مقابل ميكروغرام/مل الميوسين القياسية). تحديد مستويات الميوسين المجهولة بتحديد حيث يسقط OD₅₆₀ من كل معروف على المنحنى القياسي وقراءة تركيز الميوسين المقابلة لتلك القيمة.
تحديد مستويات البروتين
ملاحظة: وبصرف النظر عن الميوسين، مستويات البروتين عموما في الماء وكيل آخر لمستويات الإسهال (البراز غائم، السائلة) التي تنتجها الأسماك. يستخدم هذا الإجراء فحص برادفورد قياسية لتقدير مستويات البروتين. وتقدر مستويات البروتين على منحنى قياسي ألبومين المصل بقرى (BSA).
1. مزيج 100 ميليلتر من أحد المعايير جيش صرب البوسنة (راجع الملاحظة أدناه) أو 100 ميليلتر من الإصابة بالمياه (من الكأس التي تحتوي على الأسماك المصابة) مع ميليلتر 900 من برادفورد كاشف الإنزيم (الكاشف مقايسة البروتين بيرس يعمل جيدا لهذا) في ومبومو المتاح. احتضان جميع العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  ملاحظة: استخدمت المعايير جيش صرب البوسنة التالية: 1,800 ميكروغرام/مل 1,000 ميكروغرام/ملليلتر، 750 ميكروغرام/مل، 500 ميكروغرام/مل، 250 ميكروغرام/ملليلتر، 125 ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل و 25 ميكروغرام/مل. كانت تضعف المعايير جيش صرب البوسنة في الماء المقطر يعقم.
2. قراءة OD₆₆₀ كل معيار أو عينة عليها باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
3. ارسم المنحنى القياسي جيش صرب البوسنة (OD₆₆₀مقابل ميكروغرام/مل). تحديد مستويات البروتين المجهولة بتحديد حيث تقع على المنحنى القياسي جيش صرب البوسنة OD₆₆₀ من كل معروف وقراءة تركيز الميوسين المقابلة لتلك القيمة.
قياس القطر الخارجي₆₀₀
ملاحظة: وجود الإسهال (البراز غائم، سائلة) واضح وضوحاً بعد عدة ح وعزم₆₀₀ OD بسيطة يمكن استخدامها لقياس هذا.
1. عكس الأنبوب الذي يحتوي على الماء الإصابة عدة مرات توزيعها بالتساوي المحتويات. إضافة 1 مل عينة الماء إلى ومبومو المتاح. استخدم 1 مل من الماء العدوى العقيمة كعنصر سلبي.
2. القيام بقياس "فارغة" باستخدام جهاز المطياف الضوئي مبلغ 600 نانومتر باستخدام نموذج المراقبة السلبية. قراءة كل عينة المياه في 600 نانومتر وسجل النتائج.
تصميم تفرز ضد الكوليرا زيمبابوي/مل بعد الإصابة
ملاحظة: يفرز عنصرا رئيسيا من الإسهال التي تنتجها في الزرد ضد الكوليرا. البت في زيمبابوي/مل يمكن استخدامها لأغراض مثل تقدير النسخ المتماثل البكتيرية في الأمعاء الأسماك، وكتدبير الجرعة المعدية في تجارب الإرسال. ويتم هذا التدبير أفضل عندما حدث مرض انتقالي. إذا كان يستخدم عدوى ح 24، سيتم قياس هذا التحليل العدوى المشتركة بالإضافة إلى أغلبه ضد الكوليرا.
1. أخذ عينة مياه عند نقطة الوقت المطلوب وتمييع تسلسلياً كما هو موضح سابقا.
2. لوحة تخفيف المسلسل على وسائط انتقائية (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة آخر أو ستربتوميسين أو DCLS أجار رطل) واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية ح 24.
3. عد المستعمرات. حساب زيمبابوي الواحد مل من الماء كما هو موضح في الخطوة 1، 5.

النتائج

خامسا-الكوليرا الاستعمار المسالك المعوية الزرد

تقديم مثال لمستويات الاستعمار نموذجية نلاحظ، نحن تلقيح 5 × 10⁶ زيمبابوي من تور ش ضد الكوليرا السلالة الجائحة N16961 في 200 مل الماء في كوب يحتوي على عدة الزرد. بعد 6 ح للإصابة، تم غسله...

Discussion

الزرد هو نموذج جديد نسبيا لدراسة ضد الكوليرا ولكن يحمل الكثير من الوعود للمستقبل اكتشاف جوانب غير معروفة من قبل ضد الكوليرا البيولوجيا والمرضية¹¹^،^،من¹²¹³ . النموذج الزرد الكبار لديه مزايا كلا طبيعية ضد الكوليرا المضيف يحتوي ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وبفضل ميلودي نيلي، جون الين، أبوعيطة بازل، ودونا رونفت لجهودها في المساعدة على تطوير النموذج الزرد. البحث الذي ذكرته هنا أيده بالمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة الأرقام R21AI095520 و R01AI127390 (لجيفري فتحي حاء). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

References

Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: