Quantifizierung von Vibrio Cholerae Kolonisation und Durchfall bei Erwachsenen Zebrafisch-Modell

Zusammenfassung

Zebrafisch sind eine natürliche Vibrio Cholerae zu hosten und zu rekapitulieren und studieren den gesamten ansteckenden Zyklus von der Kolonisierung Übertragung verwendet werden. Hier zeigen wir wie Sie V. Cholerae Kolonisation Ebenen zu bewerten und Durchfall im Zebrafisch quantifizieren.

Zusammenfassung

Vibrio Cholerae ist am besten bekannt als das infektiöse Agens, das die menschliche Krankheit Cholera verursacht. Außerhalb der menschlichen Wirt besteht V. Cholerae in erster Linie in der aquatischen Umwelt, wo sie mit einer Vielzahl von höheren Wasserlebewesen interagiert. Wirbeltier Fisch sind dafür bekannt, eine ökologische Gastgeber zu sein und sind eine potenzielle V. Cholerae Reservoir in der Natur. V. Cholerae und teleost Fischarten Danio Rerio, allgemein bekannt als Zebrafisch, stammen aus dem indischen Subkontinent, was auf eine langjährige Interaktion in der aquatischen Umwelt. Zebrafisch sind eine ideale Modellorganismus für viele Aspekte der Biologie, einschließlich Infektionskrankheiten zu studieren. Zebrafisch kann einfach und schnell von V. Cholerae nach Exposition im Wasser kolonisiert. Intestinale Kolonisation von V. Cholerae führt zu die Produktion von Durchfall und die Ausscheidung von replizierten V. Cholerae. Diese Bakterien können ausgeschieden dann weitergehen, um neue Fisch-Hosts zu kolonisieren. Hier zeigen wir wie Sie V. Choleraebewerten-intestinale Kolonisation im Zebrafisch und wie V. Choleraezu quantifizieren-induzierte Zebrafisch Durchfall. Die Kolonisation-Modell sollte Forscher nützlich, die studieren ob Gene von Interesse für Host Kolonisation und/oder Umwelt Überleben von Bedeutung sein können. Die Quantifizierung der Zebrafisch Durchfall sollte sinnvoll, Forscher Darm-Erreger, die Zebrafisch als Modellsystem interessieren.

Einleitung

Vibrio Cholerae ist eine aquatische, gramnegatives Bakterium, das bewirkt, die menschliche Krankheit Cholera sowie sporadische Durchfall^{1,2 dass}. V. Cholerae findet sich in der Umwelt in vielen Bereichen der Welt, oft in Verbindung mit anderen Wasserlebewesen. Diese verknüpfen Organismen gehören Plankton, Insekten Ei Massen, Schalentiere und Wirbeltier Fisch Arten^3,4,5,6,7. Mehrere Studien haben V. Cholerae aus Darm-Trakt von Fischen in verschiedenen geographischen Gebieten^7,8,9,10isoliert. Das Vorhandensein von V. Cholerae in Fisch zeigt, dass Fische als eine ökologische Reservoir fungieren können. Fisch könnte auch in der Übertragung der Krankheit auf den Menschen und die geographische Verbreitung von V. Cholerae Stämme⁶verwickelt werden.

Zum besseren Verständnis der Interaktion von V. Cholerae mit Fisch wurde Danio Rerio, besser bekannt als Zebrafisch als Modellsystem zur Untersuchung V. Cholerae¹¹entwickelt. Zebrafisch stammen aus Südasien, einschließlich der Bucht von Bengal Region, die vermutlich das früheste Reservoir von V. Choleraewerden. Vor dem ersten Cholera pandemic Beginn im Jahre 1817 berichtete Cholera nicht außerhalb von, was jetzt Indien und Bangladesch ist. Daher Zebrafisch und V. Cholerae grenzender einander zugeordnet über evolutionäre Zeitskalen, was darauf hindeutet, dass Zebrafisch sind vielfältige V. Cholerae in der natürlichen Umwelt¹².

Der Zebrafisch-Modell für V. Cholerae ist einfach durchzuführen und kann verwendet werden, um die gesamte pathogenen studieren V. Cholerae Lebenszyklus. Fische sind V. Cholerae durch Baden im Wasser ausgesetzt, die mit einer bekannten Anzahl von V. Choleraegeimpft worden. Innerhalb von wenigen Stunden findet intestinale Kolonisation statt, gefolgt von der Herstellung von Durchfall. Durchfall besteht aus Mucin, Proteine, ausgeschiedenen Bakterien und anderen Darminhalt. Der Grad der Durchfall kann mit ein paar einfachen Messungen¹³quantifiziert werden. V. Cholerae , das durch infizierte Fische ausgeschieden worden ist kann dann weiter zu naiv Fische infizieren Abschluss des ansteckenden Zyklus. Daher, rekapituliert der Zebrafisch-Modell der V. Cholerae menschliche Krankheit Prozess^12,14.

Die am häufigsten verwendeten V. Cholerae Tiermodelle wurden historisch Mäusen und Kaninchen^{14,15,16,17,18}. Diese Modelle waren maßgeblich an der Zugabe unseres Wissens von V. Cholerae Pathogenese. Jedoch weil Mäuse und Kaninchen nicht natürliche V. Cholerae sind Gastgeber, gibt es Einschränkungen, welche Aspekte des Lebenszyklus V. Cholerae studiert werden können. Die V. Cholerae Besiedlung von Mäusen und Kaninchen erfordert in der Regel das Fehlen von intestinalen Mikrobiota oder eine Vorbehandlung mit Antibiotika, um die intestinale Mikrobiota beschädigen. Beide Modelle erfordern entweder Magensonde einzuführen die Bakterien den Magen-Darm-Trakt oder chirurgische Manipulation die Bakterien direkt in den Darm zu injizieren. Zebrafisch haben den Vorteil, dass Erwachsene Fische mit einem intakten Darm Microbiota sind leicht besiedelt und die infektiöse Prozess geschieht auf natürliche Weise, ohne jede Manipulation erforderlich.

Die vorliegende Arbeit zeigt die Auslastung der Zebrafisch als Model in V. Cholerae Infektion. Die Infektion, Dissektion, Aufzählung der Kolonisation V. Choleraeund die Quantifizierung der Durchfall von V. Cholerae verursacht werden beschrieben^12,13. Dieses Modell wird voraussichtlich für Wissenschaftler, die sowohl in den Krankheitsprozess V. Cholerae V. Cholerae ökologischen Lebensstil nützlich sein.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Wayne State University genehmigt. Diese Methode wurde zuerst in Runft Et Al. beschrieben. ¹²

1. Bestimmung der intestinalen Besiedlung

Hinweis: Intestinale Kolonisation ist die nützlichste Metrik im Zebrafisch-Modell, wie es verwendet werden kann, um die relative Fitness der verschiedenen V. Cholerae Stämme oder die Auswirkungen von Mutationen oder gen Knockouts zu vergleichen.

1. Inokulation von Zebrafisch durch Untertauchen
   Hinweis: Diese Art der Exposition gleicht den natürlichen Verlauf der Infektion.
   1. Vorbereitung von V. cholerae
      1. 5 mL Lysogeny Brühe (LB) mit einem isolierten V. Cholerae impfen Kolonie von einer LB Platte und inkubieren sie bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) für 6 – 8 Stunden (über Nacht Kultur).
      2. 25 mL frisch autoklaviert LB-Medium in einem 250 mL konische Kolben mit 50 µL der oben genannten über Nacht Kultur zu impfen. 16 – 18 h bei 37 ° C mit schütteln (150 u/min) inkubieren.
      3. Lesen Sie die Extinktion bei 600 nm (OD₆₀₀) einer Verdünnung von 1/10 der Nacht Kultur zur Schätzung der Anzahl der Bakterien pro mL (OD₆₀₀ = 1 beträgt ~ 10⁹ KBE/mL.)
      4. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 g für 10 Minuten entfernen Sie die Medien mit einer Pipette oder Gießen Sie sie in einer Desinfektionslösung. Die Zellen in sterilen PBS auf die gewünschte Konzentration, in der Regel zwischen 1 x 10⁷ bis 1 x 10¹⁰ pro ml PBS aufzuwirbeln.
         Hinweis: Hier, verweisen wir auf autoklaviert Umkehrosmose-Wasser mit Meersalz von 60 mg/L als sterile Infektion Wasser.
   2. Impfung und Inkubation
      1. Legen Sie vier oder fünf Zebrafisch in eine 400 mL-Becher mit 200 mL sterile Infektion Wasser.
      2. Fügen Sie 1 mL V. Cholerae (aus Schritt 1.1.1.4..), um die gewünschte Infektion Konzentration (in der Regel 5 x 10⁴ bis 5 x 10⁷ KBE/mL) in 200 mL Wasser Infektion zu bekommen.
      3. Decken Sie das Becherglas mit einem perforierten Deckel zu verhindern, dass die Fische springen; der Spitze einer 200 µL-Tipp-Box funktioniert gut für diese.
      4. Beschriften Sie jedes Becherglas und legen Sie sie in eine Glasfront Inkubator für die Dauer des Experiments auf 28 ° C eingestellt.
   3. Verfahren zur vorübergehenden Exposition
      Hinweis: Eine vorübergehende Exposition gegenüber V. Cholerae (in der Regel 6 h) gefolgt von der Beseitigung der Impfkeimen Bakterien eignet sich für das Studium der Übertragungs und für die genauere Quantifizierung der ausgeschiedenen Bakterien.
      1. Gießen Sie nach 6 h der Exposition das Becherglas Wasser durch ein Netz um die Fische zu sammeln. Entsorgen Sie das infizierte Wasser in einen Behälter mit Bleichmittel, die V. Choleraezu töten.
      2. Legen Sie die entfernten Fisch in einen Becher mit 200 mL sterile Infektion Wasser. Lassen Sie die Fische schwimmen in diesem sauberes Wasser für 5 min um die Oberflächen Bakterien aus dem Fisch zu entfernen.
      3. Wiederholen Sie das Nettoverfahren (Schritt 1.2.2) und legen Sie den Fisch in einen neuen Becher 200 mL sterile Infektion Wasser. Halten Sie den Fisch in diesem Becher für die Dauer des Experiments.
2. Euthanasie
   1. Wenn das Experiment der gewünschte Endpunkt erreicht hat, nehmen Sie eine Probe der Infektion Wasser (15 mL ist in der Regel ausreichend) ermöglicht ausgeschiedenen bakterielle zählt und die Messung von Durchfall (z. B. Mucin-Assay, Proteingehalt oder OD), wenn gewünscht (Abschnitt 2).
   2. Gießen Sie den Rest des Wassers durch ein Netz (um die Fische zu sammeln) in Bleichmittel, die V. Cholerae im Wasser zu töten.
   3. Legen Sie den Fisch in ein Becherglas mit Wasser Infektion plus 336 µg/mL von Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate (Tricaine) und inkubieren Sie die Fische in dieser Tricaine-Lösung für 20 min bei RT
      Hinweis: Die Netzstrümpfe waren mit einer 10 %-chloridlösung sterilisiert.
3. Dissektion
   1. Zubereitung von Fisch
      1. Scoop ein Fisch aus der Tricaine-Lösung mit einem Einweg-Plastik Löffel und legen Sie es auf der sezierenden Oberfläche.
      2. Position der Fisch mit der Bauchseite nach oben weisend und Pin es durch den Unterkiefer mit dem stumpfen Ende des Stiftes abgewinkelt, Weg von der Mitte des Körpers. Legen Sie eine andere Pin nur posterior bis zum Anus, auch vom Körper abgewinkelt.
   2. Exposition des Darm-Trakt
      1. In 70 % igem Ethanol getaucht Tupfer der ventralen Oberfläche der Fische mit einem fusselfreien Tuch.
      2. Ein Skalpell und Schere Vannas durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol und brennen sie zu sterilisieren.
      3. Machen Sie einen kleinen Schnitt längs in den Bauch direkt unter der Haut durch Eindringen in die Waage und das Skalpell verwenden. Achten Sie darauf, dass Sie nicht zu tief Schneiden der Darm-Trakt befindet sich direkt unter der Haut.
      4. Erweitern Sie mit der Schere, Schnitt sorgfältig entlang der Länge des Körpers, nicht tiefer als hautniveau schneiden und den Anus zu vermeiden.
      5. Zwei seitliche Einschnitte zu machen, mit der Schere in Richtung zum Kopf des Fisches zu eine Öffnung des Schnittes zu ermöglichen.
      6. Heften Sie die Haut auf jeder Seite die seitliche Einschnitte an der sezierenden Oberfläche, Angeln die Stifte heraus, vom Körper weg.
         Hinweis: Die Spitzen der Stifte waren zuvor sterilisiert durch Abflammen sie mit Alkohol.
   3. Entfernung von Darm-Trakt
      Hinweis: Der Darm-Trakt sollte als eine blasse, sehr dünne Röhre auf die anderen Organe sichtbar sein.
      1. Sterilisieren Sie die Zange Flamme zu und dann nutzen sie, um den gesamten Darm-Trakt (in der Regel 12-15 mm Länge) zu entfernen. Legen Sie den Darm in eine Homogenisierung Röhrchen mit Glasperlen (siehe Schritte 1.4.1–1.4.2) und 1 mL 1 x PBS oder LB auf Eis.
4. Homogenisierung
   1. Bereiten Sie die Homogenisierung Rohre im Voraus durch strömenden ~1.5 g von 1 mm Glasperlen in 2 mL Schraubverschluss-Röhrchen (füllen sie etwa halb) und dann durch Autoklavieren zu sterilisieren.
   2. Fügen Sie 1 mL sterile LB oder 1 X PBS.
   3. Sobald der Zebrafisch-Darm Schritt wurde hinzugefügt (1.3.3.1.) an den Rohren, Schraube die Kappen auf sehr eng wurden, und sichern Sie dann die Rohre in der Wirbel-Homogenisator.
   4. Die Proben für 1 min auf die maximale Einstellung zu homogenisieren, dann kühlen sie auf Eis für 1 – 2 min. wiederholen Homogenisierung noch einmal für eine vollständige Homogenisierung.
      Hinweis: Mehrere Alternativen für die Homogenisierung werden auch funktionieren.
5. Quantifizierung der intestinalen Besiedlung Ebenen
   1. Bereiten Sie Röhren (kleines Glas Reagenzgläser oder Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL) für die serielle Verdünnung der Homogenat indem Sie jedes Rohr 900 µL LB oder 1 X PBS hinzufügen. Für jeden Fisch bereiten Sie 5 – 6 Röhren und machen 10-divisibel serielle Verdünnungen der intestinalen Homogenat durch Zugabe von 100 µL Homogenat der ersten Röhre Vortexen es zu mischen, und dann hinzufügen 100 µL aus der ersten Röhre mit dem zweiten Rohr.
   2. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Verdünnungen vorbereitet worden sind.
   3. Platte 100 – 200 µL jeder Verdünnung auf LB-Agar-Platten mit 100 µg/mL von Streptomycin (bei Verwendung von Streptomycin-resistenter Stämme) und 40 µg/mL X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 16 – 18 h.
   4. Zählen Sie nach der Übernachtung Inkubation V. Cholerae Kolonien auf den Platten, entweder mit einem automatisierten Kolonie Zähler oder manuell zählen der Kolonien; Es ist hilfreich, um den gezählten Kolonien mit einem Marker-Spitze zu markieren.
   5. Bestimmen Sie die KBE pro Fisch Darm durch Multiplikation der Keimzahl mit der Verdünnungsfaktor der Suspension, unter Berücksichtigung das Volume, das überzogen war.

2. Messung der Fisch Durchfall

Hinweis: Vier verschiedene Messwerte wurden verwendet, um Fisch Durchfall zu beurteilen: die Mucin-Ebenen in das Wasser, die gesamte ausgeschiedenen proteingehalte in das Wasser, die OD₆₀₀ von Wasser und die V. Cholerae KBE in der Wasser-¹³. Durchfall wird normalerweise optisch deutlich ca. 6 Stunden nach der Exposition der Zebrafisch, V. Cholerae wie oben beschrieben.

1. Mucin zu bestimmen
   Hinweis: Mucin-Sekretion wird während der Kolonisierung V. Cholerae induziert und ist ein gutes Maß der Ausscheidung Ebenen, besonders früh in der Infektion¹³. Der Mucin-Assay ist eine Abwandlung der Mikrotiter Perjodsäure Schiff Assay¹⁹.
   1. Bereiten Sie die folgenden Materialien: 50 % (w/V) Perjodsäure-Stammlösung und 0,1 % Perjodsäure Arbeitslösung (10 µL der 50 % Perjodsäure bestand bis 5 mL 7 % Essigsäure hinzugefügt – verwenden Sie unmittelbar nach der Herstellung), Mucin Standards, 96-Well Mikrotiter-Platten, Schiff Reagenz.
      1. Mucin-Standards durch die Aussetzung der folgenden Mengen Mucin (von einem Schwein Magen Typ III) in einem Natrium-Acetat-Puffer (100 mM Natrium Acetat, 5mM EDTA pH 5,5 mit Eisessig) vorbereiten: 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL und 10 µg/mL.
         Bereiten Sie die Platte durch Zugabe von 100 µL einer Infektion Wasser in jede Vertiefung, die in der Probe wie folgt verwendet werden: leer, 1 X PBS; Mucin-Standards wie oben beschrieben, oder eine Wasserprobe aus der Fisch-Infektion. Jede Probe in dreifacher Ausfertigung zu tun.
   2. Fügen Sie 50 µL frische 0,1 % Perjodsäure Lösung jeweils gut mit einer Mehrkanal-Pipette und mischen Sie es mit nach oben und unten mehrmals pipettieren.
   3. Die Platte fest in Frischhaltefolie wickeln und bei 37 ° C für 1-1,5 h inkubieren.
   4. Kühlen Sie die Platte bis auf Raumtemperatur für 5 – 10 min. hinzufügen 100 µL Fuchsin-Lösung (Schiff's Reagenz) zu jedem Brunnen und pipettieren rauf und runter zu mischen.
   5. Wickeln Sie die Platte in Plastikfolie und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform, bis Farbe entwickelt hat; die Farbe entsteht in der Regel innerhalb von 20 min. lesen die Extinktion bei 560 nm mit einem Teller-Reader.
   6. Zeichnen Sie eine Standardkurve Mucin (OD₅₆₀vs. µg/mL Mucin standard). Bestimmen Sie die Mucin-Ebenen der unbekannten identifizieren, wo die OD-₅₆₀ jeden unbekannten fällt auf der Standardkurve und lesen die entsprechenden Mucin-Konzentration für diesen Wert.
2. Protein-Ebene bestimmen
   Hinweis: Abgesehen von Mucin sind insgesamt Proteinspiegel im Wasser einen anderen Proxy für die Ebenen von Durchfall (bewölkt, flüssigen Stuhl) produziert von den Fischen. Dieses Verfahren nutzt eine standard Bradford-Test, um Proteingehalt zu schätzen. Protein-Ebene werden basierend auf einer Standardkurve Rinderserumalbumin (BSA) geschätzt.
   1. Mischen Sie 100 µL einer der BSA Standards (siehe Hinweis weiter unten) oder 100 µL der Infektion (Wasser aus den Becher mit den infizierten Fisch) mit 900 µL Bradford Assay Reagenz (Pierce Protein Assay Reagenz eignet sich gut für diese) in eine Einweg-Küvette. Inkubieren Sie alle Proben bei Raumtemperatur für 2 min.
      Hinweis: Die folgenden BSA Standards wurden verwendet: 1.800 µg/mL, 1.000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL und 25 µg/mL. Die BSA-Standards wurden in autoklaviert destilliertem Wasser verdünnt.
   2. Lesen Sie der OD-₆₆₀ jeder Norm oder probieren Sie sie mit einem Spektrophotometer.
   3. Plot der BSA Standardkurve (OD₆₆₀vs. µg/mL). Die proteingehalte der unbekannten durch die Identifizierung wo OD₆₆₀ jeden unbekannten fällt auf der BSA Standardkurve und lesen Sie die entsprechenden Mucin-Konzentration für diesen Wert zu bestimmen.
3. Maßnahme OD₆₀₀
   Hinweis: Das Vorhandensein von Durchfall (bewölkt, flüssigen Stuhl) ist sichtlich erkennbar, nachdem mehrere h und eine einfache OD₆₀₀ Ermittlung verwendet werden können, um diese zu quantifizieren.
   1. Invertieren Sie das Rohr mit dem Infektion Wasser mehrmals um den Inhalt gleichmäßig zu verteilen. Ein Einweg-Küvette 1 mL der Wasserprobe hinzufügen. Verwenden Sie 1 mL sterile Infektion Wasser als die negativ-Kontrolle.
   2. Führen Sie eine "leere" Messung mit dem Spektralphotometer bei 600 nm mit der Negativkontrolle Probe. Lesen Sie jede Wasserprobe bei 600 nm und Aufzeichnung der Ergebnisse.
4. Bestimmung der ausgeschieden V. Cholerae KBE/mL nach der Infektion
   Hinweis: Ein wichtiger Bestandteil der Durchfall von dem Zebrafisch produziert wird ausgeschieden V. Cholerae. Die Bestimmung der KBE/mL kann für Zwecke wie die Abschätzung der bakteriellen Replikations in den Fisch-Darm-Trakt und als Maß für eine infektiöse Dosis in Übertragung Experimente verwendet werden. Diese Maßnahme erfolgt am besten, wenn eine vorübergehende Infektion stattgefunden hat. Wenn eine 24 h-Infektion verwendet wird, wird dieser Test das kombinierte Inokulum plus ausgeschiedenen V. Choleraemessen.
   1. Nehmen Sie eine Wasserprobe zum gewünschten Zeitpunkt und Seriell zu verdünnen Sie, wie zuvor beschrieben.
   2. Platte die serielle Verdünnungen auf selektivmedien (LB-Agar mit Streptomycin oder einem anderen geeigneten Antibiotikum oder DCLS) und inkubieren sie bei 30 ° C für 24 h.
   3. Zählen der Kolonien. Berechnen Sie die KBE pro mL Wasser, wie in Schritt 1.5 beschrieben.

Ergebnisse

V. Cholerae Besiedlung der Zebrafisch-Darm-Trakt

Um ein Beispiel für die typische Besiedlung Ebenen zu bieten, die wir beobachten, geimpft wir 5 x 10⁶ KBE der EL Tor V. Cholerae Pandemiestamm N16961 in 200 mL Wasser in einen Becher mit mehreren Zebrafisch. Nach 6 h von Infektion waren die Fische in frischem Wasser gewaschen und in einen Becher mit 200 mL autoklaviert Infektion Wasser wie im Protokoll b...

Diskussion

Der Zebrabärbling ist ein relativ neues Modell für die Untersuchung V. Cholerae aber viel verspricht für die Zukunft Entdeckung der bisher unbekannte Aspekte von V. Cholerae Biologie und Pathogenese^11,12,13 . Die Erwachsenen Zebrafisch-Modell hat die Vorteile der beiden natürlichen V. Cholerae Host, die intakt, Reife intestinalen Mikrobiota und ein Umweltmodell enthält. Nachteile des Modells sind ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
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