Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Özet

Zebra balığı vardır doğal Vibrio cholerae ev sahipliği ve özetlemek ve iletim tüm bulaşıcı döngüsüne kolonizasyon üzerinden çalışma için kullanılabilir. Burada, V. cholerae kolonizasyon düzeylerini değerlendirmek ve ishal içinde zebra balığı ölçmek nasıl gösterir.

Özet

Vibrio cholerae koleraya insan hastalığı bulaşıcı ajan olarak tanınmaktadır. İnsan konukçu dışında V. cholerae nerede yüksek sucul türler çeşitli ile etkileşim su ortamında öncelikle bulunmaktadır. Omurgalı balık çevresel bir ev sahibi olmak bilinir ve bir potansiyel V. cholerae rezervuar doğada bulunur. V. cholerae ve zebra balığı bilinen teleost balık türlerinin Danio rerio, Hindistan, sucul ortamlarda uzun zamandır devam eden bir etkileşim düşündüren kaynaklanır. Zebra balığı biyoloji, bulaşıcı hastalıklar da dahil olmak üzere birçok açıdan eğitim için ideal modeli organizma vardır. Zebra balığı kolayca ve hızla V. cholerae tarafından suya maruz kaldıktan sonra kolonize. V. cholerae tarafından bağırsak kolonizasyon ishal üretimi ve çoğaltılmış V. choleraeatılımı yol açar. Bunlar bakteri can atılır sonra yeni balık ana kolonize etmek devam. Burada, biz V. choleraedeğerlendirmek nasıl göstermek-zebra balığı ve nasıl V. choleraeölçmek için bağırsak kolonizasyon-zebra balığı ishal indüklenen. Kolonizasyon modeli olup olmadığını genler ilgi için ana bilgisayar kolonizasyon ve/veya çevresel hayatta kalmak için önemli olabilir okuyan araştırmacılar için yararlı olmalıdır. Zebra balığı ishal miktar zebra balığı bir modeli sistem olarak keşfetmek ilgilenen herhangi bir bağırsak patojen eğitim araştırmacılar için yararlı olmalıdır.

Giriş

Vibrio cholerae insan hastalık kolera gibi sporadik ishal^1,2neden olan su, gram-negatif bir bakteridir. V. cholerae dünyanın çoğu diğer Sucul organizmalar ile ilgili birçok alanda ortamda bulunur. Bu ilişkilendirirken organizmaların plankton, böcek Yumurta kitleler, kabuklu deniz ürünleri ve omurgalı balık tür^3,4,5,6,7içerir. Çeşitli çalışmalarda V. cholerae bağırsak yolları balık farklı coğrafi bölgelerin^7,8,9,10' dan izole ettim. V. cholerae huzurunda balık balık bir çevre su deposu olarak hareket edebilir gösterir. Balık aynı zamanda insanlar için hastalık verici ve V. cholerae suşları⁶/ coğrafi yayılmasında karıştığı.

V. cholerae balık ile nasıl etkileşim kurduğu daha iyi anlamak için Danio rerio, daha çok bilinen adıyla zebra balığı, Kolera V.e¹¹eğitim için bir model sistem olarak geliştirilmiştir. Zebra balığı V. choleraeerken rezervuarı düşünülmektedir Bengal Körfezi bölgesi dahil olmak üzere Güney Asya'ya yerli vardır. Kolera salgını başlayan ilk önce 1817 yılında, kolera şimdi Hindistan ve Bangladeş ne dışında bildirildi değil. Bu nedenle, zebra balığı ve V. cholerae neredeyse kesin birbirleriyle evrimsel zaman ölçekler üzerinde düşündüren o zebra balığı doğal çevre¹² V. cholerae konukçuda ilişkili.

V. cholerae zebra balığı model yürütmek basit ve patojenik tüm çalışma için kullanılan V. cholerae yaşam döngüsü. Balık V. cholerae için V. cholerae, bilinen bir dizi ile aşılanmış su yıkanan tarafından sunulur. Bir kaç saat içinde bağırsak kolonizasyon gerçekleşir, ishal üretim tarafından takip. İshal müsin, proteinler, atılan bakteri ve diğer bağırsak içeriği oluşur. İshal derecesini birkaç basit ölçüler¹³kullanarak sayılabilir. Atılır tarafından enfekte balık V. cholerae sonra saf balık, bulaştırmak için bulaşıcı döngüsü tamamlanıyor devam edebilirsiniz. Bu nedenle, zebra balığı modeli V. cholerae insan hastalık süreci^12,14beyannamedir.

En sık kullanılan V. cholerae hayvan modelleri tarihsel olarak fare ve tavşan^{14,15,16,17,18}olmuştur. Bu modeller V. cholerae patogenezi bilgimizi ekleme vesile olmuştur. Ancak, fare ve tavşan doğal V. cholerae olmadığı için ana bilgisayarlar, V. cholerae yaşam döngüsü ne yönlerini okudu sınırlamalar vardır. Fare ve tavşan V. cholerae kolonizasyon genellikle bağırsak microbiota ya da bağırsak microbiota zarar antibiyotiklerle Önarıtma gerektirir. Her iki model de sonda ile besleme bakteriler sindirim için tanıtmak ya da doğrudan bakterilerin bağırsak enjekte etmek için cerrahi işleme gerektirir. Zebra balığı bir avantajımız yetişkin balık ile sağlam bir bağırsak microbiota kolayca kolonize ve bulaşıcı süreç doğal olarak, gerekli herhangi bir manipülasyon olur.

Mevcut çalışma zebra balığı kullanımı model V. cholerae enfeksiyon olarak gösterir. Enfeksiyon, diseksiyon, sömürgeleşme V. choleraenumaralandırılmasına ve V. cholerae tarafından neden olduğu ishal miktar açıklanan^12,13olacaktır. Bu model V. cholerae hastalık süreci ve V. cholerae çevre yaşam tarzı ilgilenen bilim adamları için yararlı olması muhtemeldir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Wayne State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Bu yöntem ilk Runft vd. tarif ¹²

1. bağırsak kolonizasyon düzeylerinin belirlenmesi

Not: çeşitli V. cholerae suşlarının göreli fitness veya mutasyonlar gen bastırmayı veya renk çakışmalarını etkileri karşılaştırmak için kullanılabilir gibi bağırsak kolonizasyon en yararlı zebra balığı modelindeki ölçümdür.

1. Zebra balığı daldırma tarafından aşı
   Not: Maruz kalma anlamına gelir enfeksiyon doğal seyri benzer.
   1. V. cholerae hazırlanması
      1. Lysogeny suyu (LB) bir izole V. cholerae ile 5 mL aşılamak bir LB koloni plaka ve 6 – 8 h (gecede kültür) 37 ° C'de (180 rpm) sallayarak ile kuluçkaya.
      2. Taze autoclaved LB ortamda 250 mL konik şişesi 25 mL 50 µL yukarıdaki gecede kültür ile aşılamak. 16-18 h 37 ° C'de (150 devir/dakika) sallayarak ile için kuluçkaya.
      3. 600 optik yoğunluk okumak nm 1/10 seyreltme mL başına bakteri sayısını tahmin etmek için gecede Kültür (OD₆₀₀) (OD₆₀₀ = 1 ~ 10⁹ CFU/mL'dir.)
      4. Hücreleri tarafından Santrifüjü 10 dk. Kaldır için 6000 g de medya bir pipet ile hasat veya dezenfektan bir çözümde dök. 1 x 10⁷ 1 x 10 ml PBS¹⁰ arasında genellikle istenen konsantrasyonu steril PBS hücrelerde resuspend.
         Not: Burada, autoclaved ters ozmoz su 60 mg/L deniz tuzları içeren steril enfeksiyon su biz bakın.
   2. Aşılama ve kuluçka
      1. Dört ya da beş zebra balığı 200 mL steril enfeksiyon su içeren bir 400 mL kabı yerleştirin.
      2. V. cholerae 1 mL (adımından 1.1.1.4.) istenen enfeksiyon konsantrasyonu (genellikle 5 x 10⁴ 5 x 10⁷ CFU/mL) 200 mL enfeksiyon su almak için ekleyin.
      3. Balık dışarı atlama önlemek için bir delikli kapaklı ölçek kabı kapak; 200 µL ipucu kutusunun üstünde de bunun için çalışıyor.
      4. Her kabı etiket ve 28 ° C'de deneme süresi için ayarla bir cam-ön kuluçka makinesi içine koyun.
   3. Yordam geçici maruz kalma
      Not: inoculating bakteri kaldırma tarafından takip V. cholerae (genellikle 6 h) geçici maruz iletimi eğitim ve atılan bakterilerin daha doğru miktar için yararlıdır.
      1. Maruz kalma 6 h sonra balık toplamak için bir ağ yoluyla ölçek su dökmek. Virüslü su V. choleraeöldürmek için çamaşır suyu bir konteyner içine atın.
      2. Kaldırılan balık 200 mL steril enfeksiyon su kabı içinde yerleştirin. Balık balık yüzey bakteri kaldırmak 5 min için bu temiz suda yüzmek için izin.
      3. (Adım 1.2.2) net yordamı yineleyin ve 200 mL steril enfeksiyon su yeni bir ölçek içinde balık yer. Balık deneme süresi için bu kabı içinde tutun.
2. Ötenazi
   1. Deneme istenen bitim ulaştığında enfeksiyon örneğini su alın (15 mL genellikle yeterlidir) atılan bakteriyel sayar ve ishal (müsin tahlil, protein içeriği, ve/veya gibi OD), ölçümü için Eğer izin vermek için (Bölüm 2) isteniyorsa.
   2. Su (balık toplamak için) bir ağ üzerinden geri kalanı kapalı su V. cholerae öldürmek için çamaşır suyu içine dökün.
   3. Balık enfeksiyon su artı 336 µg/mL etil 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) içeren bir kabı yerleştirin ve bu tricaine çözüm için 20 dk RT. az balıkta kuluçkaya
      Not: File çorap % 10 çamaşır suyu çözüm ile sterilize.
3. Diseksiyon
   1. Balık hazırlanması
      1. Tek kullanımlık plastik kaşıkla tricaine çözüm çıkmış bir balık kepçe ve parçalanmış bir yüzeye yerleştirin.
      2. Pozisyon balık ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ve PIN PIN künt sonu ile alt çene içinden vücudun merkezinden açılı. Başka bir PIN Ayrıca uzak vücut açılı anüs, sadece arka yerleştirin.
   2. Bağırsak pozlama
      1. Pamuklu çubuk hav bırakmayan bir bezle balık ventral yüzeyinde % 70 etanol daldırma.
      2. Bir neşter ve kenasen makas % 70 etanol daldırma ve onları yanan sterilize.
      3. Küçük bir insizyon attım sadece derinin altında Karnında boyuna ölçekler delici ve neşteri kullanarak olun. Bağırsak deri altında bulunan gibi çok derin kesmemeye dikkat et.
      4. Makas kullanarak, belgili tanımlık kesme dikkatlice deri seviyesinden daha derin kesme ve anüs kaçınarak vücut uzunluğu boyunca uzanır.
      5. Belgili tanımlık kesme bir açılmasına izin balık başkanı doğru makasla iki yan kesim yapmak.
      6. PIN deri vücuttan dışarı, pins olta balıkçılığı diseksiyon yüzeye yanal insizyon her tarafında.
         Not: Bu pimlerden hiçbirinin ipuçları daha önce alkol ile yanan tarafından sterilize.
   3. Bağırsak Temizleme
      Not: Bağırsak üstünde tepe-in diğer organlara soluk, çok ince bir tüp olarak görünür olmalıdır.
      1. Forseps alev sterilize etmek ve onları tüm bağırsak (genellikle 12-15 mm uzunluğunda) kaldırmak için kullanın. Bağırsak (bkz. Adım 1.4.1–1.4.2) cam boncuk ve 1 mL 1 x PBS veya LB, buz üzerinde içeren bir homojenizasyon tüp içine koyun.
4. Homojenizasyon
   1. Homojenizasyon tüpler 2 mL 1 mm cam boncuk dökme ~1.5 g tarafından önceden vidalı kapak tüpler (yaklaşık yarım doldurun) hazır olun ve sonra onları tarafından ısıyla sterilize.
   2. 1 mL steril LB veya 1 x PBS ekleyin.
   3. Bir kez zebra balığı bağırsak eklendi (adıma 1.3.3.1) tüpler, vidalı kapaklar çok sıkı olmuştur ve sonra girdap homogenizer tüplerde güvenli.
   4. Homojenize örnekleri için maksimum ayar 1 dk sonra serin buz 1-2 dakika süreyle üzerlerine bu homojenizasyon döngü bir kez daha tam bir homojenizasyon için yineleyin.
      Not: Homojenizasyon için birkaç alternatif yöntem de aynı işi görür.
5. Bağırsak kolonizasyon düzeyleri miktarının
   1. Tüpler (küçük cam test tüpleri veya 1.5 mL microcentrifuge tüpler) her tüpün LB veya 1 x PBS 900 µL ekleyerek homogenate seri seyreltme için hazır olun. Her balık için 5-6 tüpler hazırlamak ve bağırsak homogenate 10 kat seri dilutions ilk Tüp, homogenate 100 µL ekleyerek bu duruma vortexing mix ve sonra 100 µL ilk tüp sizden ikinci tüp ekleyerek için.
   2. Tüm dilutions hazırlanan kadar bu yordamı yineleyin.
   3. 100-200 µL her seyreltme 100 µg/mL streptomisin (streptomisin dirençli suşların kullanıyorsanız) ve X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 40 µg/mL içeren LB agar plakaları, plaka. 16-18 h 30 ° C'de plakaları kuluçkaya.
   4. Gecede kuluçka sonra V. cholerae kolonileri tabaklarda, bir otomatik koloni sayaç kullanarak veya el ile kolonilerin sayımı saymak; bir marker ucu ile sayılan kolonileri işaretlemek yararlıdır.
   5. Balık bağırsak başına CFU kaplama hacmi dikkate alarak süspansiyon, seyreltme faktörü tarafından plaka sayısı çarpılarak belirler.

2. balık ishal ölçümü

Not: Balık ishal değerlendirmek için dört farklı ölçümleri kullanılmıştır: su, su, OD₆₀₀ su ve V. cholerae CFU su¹³' te genel atılan protein düzeyleri müsin seviyelerinde. İshal normalde görsel olarak belirgin olur yaklaşık 6 h zebra balığı yukarıda açıklandığı gibi V. cholerae maruz kaldıktan sonra.

1. Müsin düzeylerini belirlemek
   Not: Müsin salgılanmasını V. cholerae kolonizasyon sırasında indüklenen ve atılımı düzeylerinin, özellikle erken enfeksiyon¹³iyi bir ölçüsüdür. Müsin tahlil microtiter periyodik asit Schiff tahlil¹⁹bir çeşididir.
   1. Aşağıdaki belgeleri hazırlamak: % 50 (w/v) hisse senedi çözüm periyodik asit ve % 0.1 periyodik asit çalışma çözüm (5 mL % 7 asetik asitin eklendi % 50 periyodik asit stokunun 10 µL — hemen yaptıktan sonra kullanın), müsin standartları, 96-de microtiter plakaları, Schiff'ın reaktif.
      1. Müsin (üzerinden bir domuz mide tip III) aşağıdaki miktarda sodyum asetat arabellekte (100 mM sodyum asetat, 5 mM EDTA, pH 5.5 buzul asetik asit ile) askıya tarafından müsin standartları hazırlamak: 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL ve 10 µg/mL.
         Plaka enfeksiyon 100 µL ekleyerek su assay olarak aşağıdaki gibi kullanılacak olan her şey için hazır olun: 1 x PBS; boş Yukarıda açıklandığı gibi müsin standartlar, ya da--dan balık hastalık su örneği. Her örnekte nüsha yapmak.
   2. Her bir çok kanallı pipet ile iyi ve yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırarak için taze % 0,1 periyodik asit çözüm 50 µL ekleyin.
   3. Plaka sıkıca plastik wrap sarın ve 37 ° c için 1-1.5 saat kuluçkaya.
   4. Oda sıcaklığında 5-10 dk. eklemek 100 µL Fuchsin çözüm (Schiff'ın reaktif) her şey ve damlalıklı yukarı ve aşağı karıştırmak için aşağı plaka ne yapıyorsun?
   5. Plaka plastik wrap sarın ve renk geliştirdiği kadar oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde kuluçkaya; rengi genellikle 20 dk. 560 absorbans okumak içinde geliştirilen bir plaka okuyucu kullanarak nm.
   6. Müsin standart eğri (OD₅₆₀vs µg/mL müsin standart) arsa. Her bilinmeyen OD₅₆₀ standart eğri üzerinde düştüğü belirlenmesi ve bu değeri karşılık gelen müsin konsantrasyona okuma bilinmeyenli müsin düzeylerini belirlemek.
2. Protein düzeyleri belirlemek
   Not: müsin yanı sıra, genel protein düzeyleri suda balık tarafından üretilen ishal (bulutlu, sıvı dışkı) düzeyleri için başka bir proxy vardır. Bu yordamı bir standart Bradford tahlil protein düzeyleri hesaplamak için kullanır. Protein düzeyleri bir sığır serum albumin (BSA) standart eğri dayanarak tahmin edilir.
   1. (Aşağıdaki nota bakın) BSA standartları birinin 100 µL veya enfeksiyon su (suyu kabı virüslü balık içeren) 100 µL Bradford 900 µL ile tahlil reaktif (Pierce protein tahlil reaktif de bunun için çalışır) tek kullanımlık bir küvet içinde karıştırın. Tüm örnekleri, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
      Not: Aşağıdaki BSA standartları kullanılmıştır: 1.800 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL ve 25 µg/mL. BSA standartları autoclaved distile suda seyreltilmiş.
   2. Her standart OD₆₆₀ okuma veya bir spektrofotometre kullanarak örnek.
   3. BSA standart eğri (OD₆₆₀vs µg/mL) arsa. Burada her bilinmeyen OD₆₆₀ BSA standart eğri üzerinde düşüyor ve bu değeri karşılık gelen müsin konsantrasyona okumak tanımlayan tarafından bilinmeyen protein düzeyleri belirler.
3. Ölçü OD₆₀₀
   Not: sonra birkaç h ve basit OD₆₀₀ kararlılık bu ölçmek için kullanılabilir olup olmadığını diyare (bulutlu, sıvı dışkı) gözle görülür belirgindir.
   1. Eşit içeriği dağıtmak için birkaç kez enfeksiyon su içeren tüp tersine çevirin. Su örneği 1 mL tek kullanımlık bir küvet için ekleyin. 1 mL steril enfeksiyon su negatif kontrol kullanın.
   2. "Boş" bir ölçüm spektrofotometre 600 kullanarak gerçekleştirmek negatif denetimi örneğini kullanarak nm. Her su örneği 600 nm ve kayıt okumak sonuçları.
4. Belirlenmesi V. cholerae CFU/mL enfeksiyon sonra atılır.
   Not: Zebra balığı tarafından üretilen ishal önemli bir bileşeni atılır V. cholerae. CFU/mL belirlenmesi bakteriyel çoğaltma balık bağırsak ve bulaşıcı bir doz iletim deneylerde bir ölçüsü olarak tahmin etme gibi amaçlar için kullanılabilir. Geçici bir enfeksiyon gerçekleştiğinde bu ölçü en iyi yapılır. 24 h enfeksiyon kullandıysanız, bu tahlil kombine inoculum artı atılan V. choleraeölçecektir.
   1. Su örneği istenen saat noktada al ve seri olarak daha önce açıklandığı gibi sulandırmak.
   2. Seçmeli medya (streptomisin veya başka bir uygun antibiyotik veya DLC'ler içeren LB agar) seri dilutions plaka ve onları 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
   3. Kolonilerin sayımı. CFU mL su başına 1.5 adımda anlatıldığı gibi hesaplayın.

Sonuçlar

V. cholerae kolonizasyon in zebra balığı bağırsak arazi

Örnek olarak biz gözlemlemek tipik kolonizasyon düzeyleri sağlamak için 5 x 10⁶ 200 mL su birkaç zebra balığı içeren bir ölçek içinde pandemi EL Tor V. cholerae zorlanma N16961 CFU aşılandı. Enfeksiyon 6 h sonra balık tatlı suda yıkanmış ve 200 mL iletişim kuralında tanımlandığı gibi autoclaved enfeksiyon su kabı i?...

Tartışmalar

Zebra balığı V. cholerae çalışmak için nispeten yeni bir model ama V. cholerae biyoloji Patogenez^11,12,ve¹³ önceden bilinmeyen yönlerini gelecekteki keşfi için fazla söz sahibidir . Yetişkin zebra balığı modeli her iki doğal olmanın avantajı vardır sağlam, Olgun bağırsak microbiota ve çevresel bir modeli içeren V. cholerae ana bilgisayar. Dezavantajları modelinin iki önemli i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5