לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Dhrubajyoti Nag; Kristie Mitchell; Paul Breen; Jeffrey H. Withey

doi:10.3791/57767

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

Abstract

ויבריו cholerae ידועה בתור הסוכן זיהומיות הגורמת הכולירע מחלות אנושיות. בחוץ הפונדקאי. האנושי, נ' cholerae בעיקר קיימת בסביבה המימית, איפה זה מקיים אינטראקציה עם מגוון מינים ימיים גבוה יותר. דגים חוליות ידועים להיות מארח הסביבה והם פוטנציאל נ' cholerae מאגר בטבע. גם נ' cholerae וגם מיני דגים teleost רזבורה rerio, הידוע בכינויו דג זברה, מקורן היבשת ההודית, רומז על אינטראקציה ארוכת שנים בסביבות מימיות. דג זברה הם אורגניזם מודל אידיאלי ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה, כולל מחלות זיהומיות. דג זברה יכול בקלות, במהירות קולוניה נ' cholerae לאחר חשיפה במים. קולוניזציה מעיים מאת נ' cholerae מוביל את הייצור של שלשול הפרשה של משוכפלים נ' cholerae. אלה מופרש חיידקים יכולים אז קדימה ליישב פונדקאים חדשים של דגים. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae-קולוניזציה מעיים דג זברה ואיך לכמת נ' cholerae-induced דג זברה שלשול. המודל קולוניזציה צריך להועיל לחוקרים הלומדים אם הגנים של עניין עשוי להיות חשוב עבור המארח קולוניזציה ו/או להישרדות סביבתיים. כימות של דג זברה שלשול צריך להיות שימושי החוקרים ללמוד כל פתוגן מעיים המעוניינים לחקור את דג זברה כמערכת מודל.

Introduction

ויבריו cholerae הוא חיידק הימית, גראם שליליים, הגורמת של מחלות אנושיות כולרה, כמו גם שלשול נמשך "טפטוף"¹^,². (פ') cholerae נמצא בסביבה בתחומים רבים של העולם, קשורה לעיתים קרובות עם אורגניזמים ימיים אחרים. אורגניזמים שיוך אלה כוללים פלנקטון, ביצה חרקים ההמונים, רכיכה חוליות דגים מינים³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷. מספר מחקרים שללו נ' cholerae מ ספינלי מעיים של דגים ב אזורים גאוגרפיים שונים⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. הנוכחות של נ' cholerae בדגים מציין כי דגים עשוי לפעול כמו מאגר הסביבה. גם יכול להיות מעורב דגים בהעברת המחלה לבני, פיזור גיאוגרפי נ' cholerae זנים⁶.

כדי להבין טוב יותר איך נ' cholerae אינטראקציה עם דגים, רזבורה rerio, הידועה יותר בשם דג זברה, פותחה כמערכת מודל לימוד נגד כולרהe¹¹. דג זברה הם ילידי דרום אסיה, כולל באזור מפרץ בנגל, אשר נחשב מאגר המוקדם של נ' cholerae. עד הראשון כולרה מגיפה בשנת 1817, כולרה לא דווח כי מחוץ מה שעכשיו הודו ובנגלדש. לכן, דג זברה, נ' cholerae כמעט בוודאות הקשורים אחד לשני על סולמות אבולוציוני, רומז כי דג זברה הם שורה נ' cholerae הסביבה הטבעית¹².

דג זברה המודל נ' cholerae פשוטה לביצוע והוא יכול לשמש כדי לחקור את כל פתוגניים נ' cholerae מחזור החיים. דגים נחשפים נ' cholerae על ידי רחצה במים אשר חיסנה עם מספר ידוע של נ' cholerae. בתוך מספר שעות, קולוניזציה מעיים מתקיים, ואחריו את הייצור של שלשול. שלשול מורכב mucin, חלבונים, החיידקים מופרש ותוכן מעיים אחרים. ניתן לכמת את מידת שלשול באמצעות מדידות פשוטות מספר¹³. (פ') cholerae זה יש כבר מופרש על ידי דגים נגועים יכול להמשיך להדביק לדגים נאיביים, להשלמת המעגל זיהומיות. לפיכך, המודל דג זברה recapitulates נ' cholerae מחלות אנושיות תהליך¹²^,¹⁴.

בשימוש לעתים קרובות ביותר נ' cholerae חייתיים היו עכברים וארנבות,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. מודלים אלה סייעו בהוספת לידע שלנו של נ' cholerae פתוגנזה. עם זאת, כי עכברים וארנבות, אינם טבעיים נ' cholerae מארחים, קיימות מגבלות אילו היבטים של מחזור חיי נ' cholerae יכול להילמד. הקולוניזציה נ' cholerae של עכברים וארנבות, דורש בדרך כלל העדר של microbiota מעיים או רעלני באנטיביוטיקה כדי לפגוע microbiota של המעי. שני הדגמים דורשים gavage להציג לחיידקים מערכת העיכול או מניפולציה כירורגי ישירות להחדיר את החיידקים לתוך המעיים. דג זברה יש יתרון בכך דג בוגר עם microbiota מעיים ללא פגע הם התנחלו בקלות תהליך זיהומיות קורה באופן טבעי, ללא כל פעולה הדרושה.

העבודה הנוכחית ממחישה את הניצול של דג זברה כמודל באיזמיר נ' cholerae זיהום. הזיהום, דיסקציה, ספירה של להמדינות נ' cholerae, כימות של שלשול הנגרם על ידי נ' cholerae יהיה לתאר¹²^,¹³. מודל זה סביר להניח שתהיה שימושית למדענים מעוניין תהליך המחלה נ' cholerae והן בסגנון נ' cholerae סביבתיים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ווין סטייט. שיטה זו תוארה לראשונה בשנת Runft. et al. ¹²

1. קביעת רמות קולוניזציה מעיים

הערה: קולוניזציה מעיים הוא מדד שימושי ביותר במודל דג זברה כמו זה יכול לשמש כדי להשוות את הכושר היחסי של זנים שונים נ' cholerae או את ההשפעות של מוטציות או הסתרה ג'ין.

חיסון של דג זברה על ידי טבילה
הערה: פירוש של חשיפה דומה את המסלול הטבעי של זיהום.
1. הכנת נ' cholerae
  1. לחסן מ ל מרק lysogeny (ליברות) עם מבודדים נ' cholerae המושבה מ LB צלחת, תקופת דגירה זה ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד) של 6-8 h (לילה תרבות).
  2. לחסן 25 מ של טרי בינוני LB בלוק בבקבוקון חרוט 250 מ עם 50 µL של התרבות לילה לעיל. תקופת דגירה זה של 16 – 18 h ב 37 ° C עם טלטול (150 סל ד).
  3. לקרוא את הצפיפות האופטית-600 nm (OD₆₀₀) של 1/10 לדילול של התרבות לילה כדי להעריך את מספר החיידקים לכל mL (ה OD₆₀₀ = 1 הוא ~ 10⁹ CFU/mL.)
  4. הקציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g עבור 10 דקות להסיר את המדיה עם פיפטה או שופכים אותו לתוך פתרון החיטוי. Resuspend התאים ב- PBS סטרילי לריכוז הרצוי, בדרך כלל בין 1 x 10⁷ עונה 1 פרק 10¹⁰ מ"ל ל- PBS.
    הערה: הנה, אנחנו מתייחסים מים אוסמוזה הפוכה בלוק המכיל מלחי ים 60 מ ג/ליטר כ סטרילי זיהום מים.
2. חיסון, דגירה
  1. מניחים דג זברה ארבעה או חמישה לתוך גביע 400 מ ל המכיל 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית.
  2. להוסיף 1 מ"ל של נ' cholerae (מתוך שלב 1.1.1.4.) כדי להכניס את ריכוז זיהום הרצוי (בדרך כלל 5 x 10⁴ ל- 5 x 10⁷ CFU/mL) 200 מ של זיהום מים.
  3. לכסות את. הספל עם מכסה מחורר כדי למנוע את הדגים קופצים החוצה; העליון של תיבה עצה 200 µL עובד עליו היטב.
  4. תווית לכל כוס כימית, למקם אותם לתוך חממה חזית הזכוכית שוכן בגובה 28 º C משך זמן הניסוי.
3. נוהל חשיפה חלוף
  הערה: חלוף חשיפה נ' cholerae (בדרך כלל 6 h) ואחריו הסרת של החיידק לחסן שימושית עבור הלומדים את השידור, כימות מדויקת יותר של החיידקים מופרש.
  1. לאחר 6 שעות של חשיפה, שופכים את המים הספל דרך מחוך כדי לאסוף את הדגים. למחוק את המים נגועים לתוך מכולה של אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae.
  2. מניחים את הדג שהוסר ב גביע 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית. לאפשר את הדגים לשחות במים נקיים זה עבור 5 דקות כדי להסיר את החיידקים משטח של הדג.
  3. חזור על הפעולות נטו (שלב 1.2.2) ומניחים את הדגים בתוך החדש של 200 מ ל סטרילי זיהום מים. לשמור את הדגים בתוך זה משך זמן הניסוי.
המתת חסד
1. כאשר הניסוי הגיעה נקודת הסיום הרצוי שלו, לקחת דגימה של הזיהום מים (15 מ ל היא בדרך כלל מספקות) כדי לאפשר מופרש ספירת חיידקים ועל המידה של שלשול (כגון mucin assay, תכולת החלבון ו/או יתר), אם הרצויה (סעיף 2).
2. יוצקים את שארית המים דרך מחוך (כדי לאסוף את הדגים) לתוך אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae במים.
3. מניחים את הדג לתוך גביע המכילים זיהום מים בתוספת µg 336/mL של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine), דגירה הדג בפתרון זה tricaine למשך 20 דקות ב- RT.
  הערה: רשת הדיג חיטוי עם פתרון 10% מלבין.
דיסקציה
1. הכנת דגים
  1. סקופ דג מחוץ הפתרון tricaine עם כפית פלסטיק חד פעמיות ומניחים אותו על פני השטח ויבתר.
  2. מיקום הדג עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה, pin זה דרך הלסת התחתונה, עם הצד הקהה של ה-pin בזווית מהמרכז של הגוף. במקום אחר pin רק האחורי עד פי הטבעת, גם בזווית, והגוף.
2. חשיפה של מערכת העיכול
  1. ספוגית (גחוני) של הדג עם מגבון נטולת טבול 70% אתנול.
  2. לחטא סכין ומספריים Vannas על ידי טובלים אותם 70% אתנול בוער להם.
  3. עושים חתך קטן לאורכו בבטן רק מתחת לעור על ידי חדירה המאזניים באמצעות את האזמל. תיזהרי לא לחתוך יותר מדי עמוק, כמו מערכת העיכול ממוקם בדיוק מתחת לעור.
  4. בעזרת המספריים, להרחיב את החתך בקפידה לאורך הגוף, חיתוך לא עמוק יותר מאשר רמת העור והימנעות פי הטבעת.
  5. לעשות שני חתכים לרוחב עם המספריים לכיוון הראש של הדג כדי לאפשר פתיחה של החתך.
  6. להצמיד את העור בכל צד של חתכים לרוחב השטח ויבתר לדוג את הסיכות החוצה מהגוף.
    הערה: הקצוות של הסיכות בעבר חיטוי על ידי שלהוב אותם עם אלכוהול.
3. הסרה של מערכת העיכול
  הערה: מערכת העיכול צריך להיות גלוי כמו צינור חיוור, רזה מאוד על האיברים האחרים.
  1. להבה-לעקר את המלקחיים ולאחר מכן להשתמש בהם כדי להסיר את כל מערכת העיכול (בדרך כלל 12-15 מ"מ אורך). מקם את המעי לתוך צינור המגון המכילה חרוזי זכוכית (ראה שלבים 1.4.1–1.4.2) ו 1 מ"ל של 1 x PBS או LB, על קרח.
המגון
1. להכין הצינורות המגון מראש מאת g ~1.5 השוטף של חרוזי זכוכית 1 מ מ לתוך 2 mL צינורות פקקי בורג (למלא אותם בערך בחצי הדרך), ואז לחטא אותם על-ידי autoclaving.
2. להוסיף 1 מ"ל של LB סטרילי או 1 x PBS.
3. ברגע במעי דג זברה היו מוסף (שלב 1.3.3.1) את הצינורות, בורג הפקקים בחוזקה, ולאחר מכן לאבטח את צינורות מהמגן מערבולת.
4. Homogenize הדגימות עבור 1 דקות על ההגדרה המרבי, ולאחר מכן מגניב אותם על קרח דק 1-2 לחזור מחזור המגון זה פעם נוספת עבור המגון מלאה.
  הערה: מספר שיטות חלופיות המגון גם יעבוד.
לכימות קולוניזציה מעיים רמות
1. להכין צינורות (מבחנות זכוכית קטנים או צינורות microcentrifuge 1.5 mL) דילול homogenate טורי על-ידי הוספת µL 900 ק ג או 1 x PBS כל שפופרת. עבור כל דג, להכין 5 – 6 צינורות ולעשות דילולים טורי 10-fold של homogenate המעי על ידי הוספת µL 100 של homogenate הרכבת התחתית הראשונה, vortexing זה לערבב ולאחר מכן הוספת 100 µL ברכבת התחתית הראשונה הצינור השני.
2. חזור על הליך זה עד דילולים כל היה מוכן.
3. צלחת 100-200 µL של כל דילול על פלטות אגר LB המכיל 100 µg/mL של סטרפטומיצין (אם משתמשים זנים עמידים בפני סטרפטומיצין) ו- µg/mL 40 של X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.
4. לאחר לילה הדגירה, לספור מושבות נ' cholerae על הלוחות, באמצעות מונה הניתן המושבה אוטומטית או ידנית לספור את המושבות; זה עוזר לסמן את המושבות שנספרו עם טיפ סמן.
5. לקבוע את CFU לכל דג המעי על ידי הכפלת הרוזן צלחת הגורם דילול של ההשעיה, לוקח בחשבון את עוצמת הקול זה היה מצופה.

2. מדידה של דגים שלשול

הערה: ארבעה מדדים שונים שימשו להערכת דגים שלשול: רמות mucin המים, את רמות החלבון המופרשת הכוללת את המים, את יתר₆₀₀ של המים, את נ' cholerae CFU מים¹³. שלשול בדרך כלל הופך להיות ראייה ברורה כ 6 שעות לאחר החשיפה של דג זברה כדי נ' cholerae כמתואר לעיל.

לקבוע רמות mucin
הערה: הפרשת Mucin הנגרמת במהלך הקולוניזציה נ' cholerae , הוא מדד טוב של רמות הפרשה, ובמיוחד בתחילת זיהום¹³. Mucin וזמינותו הינה וריאציה על החומצה המחזורית microtiter assay שיף¹⁹.
1. להכין את החומרים הבאים: 50% (w/v) חומצה המחזורית פתרון מניות ו- 0.1% חומצה המחזורית הפתרון עובד (µL 10 של המניה המחזורית חומצה 50% יתווספו 5 מ ל חומצה אצטית 7% — להשתמש מיד לאחר ביצוע), mucin סטנדרטים, 96-ובכן microtiter צלחות, שיף מגיב.
  1. הכנת תקנים mucin על ידי השעיית הכמויות הבאות של mucin (מתוך הבטן חזירי סוג III) במאגר אצטט נתרן (100 מ מ סודיום אצטט, 5 מ מ EDTA, pH ל 5.5 עם חומצה אצטית): 400 µg/mL 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150-µg/mL , µg 100/mL, µg 75/mL, µg 50/mL, µg 25/mL ו- 10 µg/mL.
    להכין הצלחת על-ידי הוספת µL 100 של זיהום מים כל טוב זה ישמש בבית וזמינותו כדלקמן: ריק 1 x PBS; סטנדרטים mucin כמתואר לעיל, או דגימת מים מן הזיהום דגים. כל מדגם דולר.
2. להוסיף 50 µL טריים 0.1% חומצה המחזורית לפתרון אחד טוב עם פיפטה רב-ערוצי ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
3. עוטף את הצלחת היטב בניילון נצמד, דגירה זה ב 37 ° C עבור h 1-1.5.
4. מגניב את הצלחת עד בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דקות להוסיף 100 µL Fuchsin פתרון (ריאגנט של שיף) כל טוב, וכל pipet למעלה ולמטה כדי לערבב את הכל.
5. עוטף את הצלחת בניילון נצמד, דגירה זה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נדנדה עד צבע פיתחה; הצבע הוא פותח בדרך כלל בתוך 20 דקות לקרוא את ספיגת-560 nm שימוש בקורא צלחת.
6. להתוות עקומה סטנדרטי mucin (OD₅₆₀לעומת µg/mL mucin רגיל). לקבוע את רמות mucin הנעלמים על ידי זיהוי איפה OD₅₆₀ נודע לכל נופל על העקומה רגיל ולקרוא את הריכוז mucin המתאים עבור ערך זה.
לקבוע רמות החלבון
הערה: מלבד mucin, הכולל רמות חלבון במים הם proxy נוספת עבור הרמות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) המיוצר על ידי הדג. הליך זה משתמש assay ברדפורד סטנדרטיים כדי להעריך את רמות החלבון. רמות החלבון מוערך על פי עיקול רגיל אלבומין שור (BSA).
1. מערבבים 100 µL של אחד הסטנדרטים BSA (ראה הערה להלן) או 100 µL של זיהום מים (מים מן כשהספל המכיל דגים נגועים) עם µL 900 של ברדפורד ריאגנט assay (פירס חלבון assay הכימית עובד עליו היטב) ב cuvette חד פעמיות. דגירה כל דוגמאות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  הערה: תקני BSA הבאים שימשו: 1,800 µg/mL 1,000 µg/mL, µg 750/מ"ל, 500 µg/mL, µg 250/mL, µg 125/mL, µg 50/mL, 25 µg/mL. הסטנדרטים BSA היו מדולל במים מזוקקים בלוק.
2. לקרוא את יתר₆₆₀ של כל תקן או לטעום אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים.
3. מגרש העקומה סטנדרטי BSA (OD₆₆₀לעומת µg/mL). לקבוע את רמות החלבון של הנעלמים על-ידי זיהוי איפה OD₆₆₀ נודע לכל נופל על העקומה סטנדרטי BSA ולקרוא את הריכוז mucin המתאימים ביותר עבור ערך זה.
מדד יתר₆₀₀
הערה: הנוכחות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) ניכרת בעליל לאחר מספר h ונחישות פשוט OD₆₀₀ יכול לשמש כדי לכמת את זה.
1. היפוך הצינור המכיל את זיהום המים מספר פעמים לפיזור אחיד של התוכן. להוסיף 1 מ"ל של דגימת מים cuvette חד פעמיות. השתמש 1 מ"ל של מים דלקת סטרילית של הפקד שלילי.
2. לבצע מדידה "ריק" באמצעות את ספקטרופוטומטרים ב 600 nm באמצעות המדגם שליטה שלילי. לקרוא כל מדגם המים ב 600 nm ולהקליט התוצאות.
קביעת מופרש נ' cholerae CFU/mL לאחר ההדבקה
הערה: מרכיב עיקרי של השלשול שמפיק את דג זברה מופרש נ' cholerae. הקביעה של CFU/mL יכול לשמש למטרות כגון הערכת את שכפול חיידקים דגים העיכול וכן מידת המינון זיהומיות בניסויים שידור. פעולה זו נעשית כאשר זיהום חלוף התרחש. אם זיהום 24 שעות ביממה, וזמינותו הזה ימדוד את inoculum משולב בתוספת של excreted נ' cholerae.
1. קח דגימת מים בנקודת הזמן הרצויים, באופן סדרתי למהול אותו כפי שתואר לעיל.
2. לוחית רישוי של דילולים טורי במדיה סלקטיבית (המכיל סטרפטומיצין או אנטיביוטיקה מתאימה נוספת או DCLS אגר ליברות), דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
3. לספור את המושבות. לחשב את CFU לכל מיליליטר מים כפי שמתואר בשלב 1.5.

תוצאות

(פ') cholerae התיישבות ספינלי מעיים דג זברה

כדי לספק דוגמה של רמות קולוניזציה אופייני שלנו להתבונן, אנחנו מחוסן 5 x 10⁶ CFU של מגיפת באל תור נ' cholerae המתח N16961 ב 200 מ של מים בתוך המכיל מספר דג זברה. לאחר 6 שעות של זיהום, הדגים היו נשטפים במי?...

Discussion

דג זברה היא מודל חדש יחסית ללמוד נ' cholerae אך טומן בחובו הרבה הבטחה הגילוי העתידי של היבטים לא מוכרת של נ' cholerae ביולוגיה ו פתוגנזה¹¹^,¹²^,¹³ . המודל דג זברה למבוגרים יש את היתרונות של להיות טבעי שני מארח נ' cholerae המכיל microbiota מעיים ללא פ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

תודה נילי מלודי, ג'ון אלן, באזל Abuaita, ו דונה Runft על מאמציהם בסיוע לפיתוח המודל דג זברה. המחקר דיווחו כאן נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספרי פרס R21AI095520 ו- R01AI127390 (כדי ג'פרי ה Withey). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

References

Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137 cholerae diarrheal

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: