Холерный вибрион колонизации и диарея в модели для взрослых рыбок данио

Резюме

Данио рерио являются естественным Vibrio cholerae принимающей и могут быть использованы для пилки и изучить весь инфекционных цикл от колонизации до передачи. Здесь мы продемонстрируем оценить V. cholerae уровни колонизации и количественно понос в данио рерио.

Аннотация

Холерный вибрион наиболее известен как инфекционный агент, который вызывает человеческие заболевания холерой. За пределами человека-хозяина V. cholerae главным образом существует в водной среде, где он взаимодействует с целым рядом высших водных видов. Позвоночных рыбы известны как экологические хост и являются потенциальным V. cholerae водохранилище в природе. V. cholerae и костистых рыб данио рерио, широко известный как данио рерио, происходят из Индийского субконтинента, предлагая давно взаимодействия в водной среде. Данио рерио являются организма идеальная модель для изучения многих аспектов биологии, включая инфекционные заболевания. Данио рерио может быть легко и быстро колонизирована V. cholerae после выдержки в воде. Кишечные колонизации V. cholerae приводит к производства понос и экскрецию реплицированных V. cholerae. Эти экскретируется бактерии могут затем перейти к колонизировать новые хозяева рыбы. Здесь, мы демонстрируем как оценить V. cholerae-кишечные колонизации в данио рерио и как количественно V. cholerae-индуцированной данио рерио понос. Колонизация модель должна быть полезной для исследователей, которые обучаются ли гены интереса может быть важно для принимающих колонизации и/или окружающей среды выживания. Количественная оценка данио рерио диареи должно быть полезным для исследователей, изучения любых кишечных патогенов, которые заинтересованы в изучении данио рерио как модель системы.

Введение

Холерный вибрион является водной, грамотрицательные бактерия, которая вызывает человеческие заболевания холерой, а также спорадических понос^1,2. V. cholerae встречается в окружающей среде во многих районах земного шара, часто ассоциируется с других водных организмов. Эти связывая организмы включают планктона, массы яйца насекомых, моллюсков и позвоночных рыбы видов^3,4,5,6,7. Несколько исследований изолированные V. cholerae от кишечных участки рыбы в различных географических районах^7,8,9,10. Присутствие V. cholerae рыб указывает, что рыбы могут выступать в качестве экологической водохранилище. Рыбы может быть причастны также в передачи заболевания людей и географическое распространение V. cholerae штаммов⁶.

Чтобы лучше понять, как V. cholerae взаимодействует с рыбой, данио рерио, более известный как данио рерио, был разработан в качестве модельной системы для изучения против холерыe¹¹. Данио рерио родным для Южной Азии, в том числе Бенгальского региона, которая считается первой водохранилище V. cholerae. До первой начала пандемии холеры в 1817, холеры не было сообщено за пределами Индии и Бангладеш. Таким образом данио рерио и V. cholerae почти наверняка связанные друг с другом над эволюционной временных масштабах, предполагая, что у рыбок данио являются V. cholerae хост в природной среды¹².

Данио рерио модель V. cholerae простой для выполнения и могут быть использованы для изучения всех патогенной V. cholerae жизненного цикла. Рыбы подвергаются воздействию V. cholerae , купание в воде, которые были привиты с известным количеством V. cholerae. В течение нескольких часов происходит колонизация кишечника, следуют производство понос. Понос состоит из муцина, белки, экскретируется бактерий и других кишечного содержимого. Степень понос может быть определена количественно с помощью нескольких простых измерений¹³. V. cholerae , был экскретируется зараженных рыб может потом заразить наивные рыбы, завершая цикл инфекционных. Таким образом в zebrafish модель резюмирует V. cholerae болезней человека процесса^12,14.

Наиболее часто используемые V. cholerae Животные модели были исторически мышей и кроликов^{14,,1516,17,18}. Эти модели важную роль в добавление к нашему знанию V. cholerae патогенеза. Однако потому что мышей и кроликов не природные V. cholerae хостов, существуют ограничения на какие аспекты V. cholerae жизненного цикла могут быть изучены. V. cholerae колонизации мышей и кроликов обычно требуется отсутствие кишечной микробиоты или предварительной обработки с помощью антибиотиков ущерб кишечной микробиоты. Обе модели требуют затравки ввести бактерий в желудочно-кишечный тракт или хирургические манипуляции непосредственно вводить бактерии в кишечнике. Данио рерио имеют преимущество в том, что легко колонизировали взрослых рыб с нетронутыми кишечную микрофлору и инфекционный процесс происходит естественно, без каких-либо манипуляций требуется.

Настоящая работа демонстрирует использование данио рерио как модель в V. cholerae инфекции. Инфекции, рассечение, перечисление колонизации V. choleraeи количественная оценка диареи, вызванной V. cholerae будет описано^12,13. Эта модель может быть полезным для ученых, заинтересованных как в процессе болезни V. cholerae , так и в V. cholerae экологического образа жизни.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Уэйн государственного университета. Этот метод впервые был описан в Runft и др. ¹²

1. Определение уровня колонизации кишечника

Примечание: Колонизации кишечника является наиболее полезным метрики в zebrafish модель, как он может использоваться для сравнения относительной фитнес различные штаммы V. cholerae или последствия мутации или гена нокауты.

1. Прививка данио рерио методом погружения
   Примечание: Это означает воздействия напоминает естественный ход инфекции.
   1. Подготовка V. cholerae
      1. Прививать 5 мл бульона (LB) lysogeny с изолированной V. cholerae колонии от LB пластины и проинкубируйте его при 37 ° C при встряхивании (180 об/мин) для 6-8 ч (ночь культуры).
      2. Прививать 25 мл свежего газобетона LB среды в коническую колбу 250 мл с 50 мкл выше ночь культуры. Инкубируйте 16 – 18 ч при 37 ° C при встряхивании (150 об/мин).
      3. Читайте оптическая плотность 600 Нм (₆₀₀OD) 1/10 разведение ночь культуры оценить количество бактерий / мл (OD₆₀₀ = 1 составляет ~ 10⁹ кое/мл.)
      4. Урожай клетки центрифугированием при 6000 g 10 мин удалить СМИ с пипеткой или слить в дезинфицирующий раствор. Ресуспензируйте клетки в стерильных PBS для желаемой концентрации, как правило, от 1 x 10-⁷ до 1 x 10¹⁰ мл ФСБ.
         Примечание: Здесь, мы ссылаемся на газобетона воды обратноосмотические, содержащие 60 мг/Л морской соли как стерильные заражения воды.
   2. Прививки и инкубации
      1. Поместите четыре или пять данио рерио в 400 мл стакан, содержащие 200 мл стерильного инфекции воды.
      2. Добавьте 1 мл V. cholerae (из шага 1.1.1.4.) для получения желаемого инфекции концентрации (обычно 5 х 10⁴ -5 x 10⁷ кое/мл) в 200 мл воды инфекции.
      3. Обложка стакан с перфорированной крышкой для предотвращения рыба выскочила; в верхней части коробки кончик 200 мкл работает хорошо для этого.
      4. Пометить каждый стакан и поместите их в стекла передней инкубатор набор на 28 ° C в течение всего эксперимента.
   3. Процедура для временной экспозиции
      Примечание: Временное воздействие на V. cholerae (обычно 6 h) последующим удалением пересевать бактерий является полезным для изучения передачи и для более точного количественного определения экскретируется бактерий.
      1. После 6 h воздействия Налейте стакан воды через ажурные собирать рыбу. Отказаться от зараженной воды в контейнер отбеливателя убить V. cholerae.
      2. Место снятые рыбы в стакан 200 мл стерильного инфекции воды. Разрешить рыбы плавают в этой чистой воде на 5 минут, чтобы удалить поверхности бактерии из рыбы.
      3. Повторите процедуру чистой (шаг 1.2.2) и место рыбы в новый стакан воды 200 мл стерильного инфекции. Сохранить рыбу в этот стакан в течение всего эксперимента.
2. Эвтаназия
   1. Когда эксперимент достигла требуемой конечной точки, взять образец инфекции воды (15 мл обычно достаточно) для обеспечения выделяющегося бактериальной графов и измерения понос (например, пробирного муцина, содержание белка, или OD), если требуется (раздел 2).
   2. Слейте оставшуюся воду через ажурные (для сбора рыбы) в отбеливатель, чтобы убить V. cholerae в воде.
   3. Место рыбы в стакан, содержащие инфекции воды плюс 336 мкг/мл 3-аминобензоат этиловый метансульфонат (tricaine) и инкубировать рыба в это tricaine решение для 20 мин на RT.
      Примечание: Рыболовные сети были стерилизованы с раствором отбеливателя 10%.
3. Рассечение
   1. Подготовка рыбы
      1. Совок рыбы из tricaine раствора с одноразовой пластиковой ложкой и поместите его на поверхность рассечения.
      2. Позиция рыба с его вентральной стороне перед вверх и ПИН-код его через нижнюю челюсть, с тупым концом ПИН под углом от центра тела. Другой контактный просто сместите в анус, также под углом от тела.
   2. Воздействия кишечного тракта
      1. Вентральной поверхности рыбы с ворса протрите тампоном смоченным в 70% этиловом спирте.
      2. Стерилизуйте беззаботными ножницы и скальпеля путем погружения их в 70% этанола и пылающий их.
      3. Сделайте небольшой надрез вдоль пополам в живот под кожу проникающим шкал и с помощью скальпеля. Будьте осторожны, чтобы не отрезать слишком глубоко, как желудочно-кишечного тракта расположен под кожу.
      4. С помощью ножниц, расширяют разрез тщательно по длине тела, резка не глубже, чем уровень кожи и избегая ануса.
      5. Сделайте два боковых порезов ножницами сторону голову рыбы, чтобы разрешить открытие разрез.
      6. Контакт кожа на каждой стороне боковые разрезы на поверхность рассечения, рыбалка булавки, от тела.
         Примечание: Советы контакты были ранее стерилизована пылающий их с алкоголем.
   3. Удаление кишечного тракта
      Примечание: Кишечного тракта должно быть видно, как бледный, очень тонкая трубка поверх других органов.
      1. Пламя стерилизуйте щипцы и затем использовать их для удаления всего желудочно-кишечного тракта (обычно 12-15 мм в длину). Поместите intestine в гомогенизации трубка, содержащая стеклянные бусины (см. шаги 1.4.1–1.4.2) и 1 мл раствора 1 x PBS или фунтов, на льду.
4. Гомогенизация
   1. Подготовить гомогенизации трубы заранее, проливной ~1.5 g 1 мм бисер в 2 мл трубы колпачок (заполнить их примерно на полпути) и затем стерилизовать их путем автоклавирования.
   2. Добавьте 1 мл стерильного LB или ПБС.
   3. Как только данио рерио кишечника был добавлен (шаг 1.3.3.1) трубы, винт крышки на очень плотно и закрепите труб в гомогенизатор вихря.
   4. Однородности выборок за 1 мин на максимальной скорости, а затем прохладной их на льду на 1 – 2 мин повторять этот цикл гомогенизации еще раз для полной гомогенизации.
      Примечание: Несколько альтернативных методов для гомогенизации также будет работать.
5. Количественная оценка уровня колонизации кишечника
   1. Подготовьте трубы (небольшие стеклянные пробирки или 1,5 мл microcentrifuge трубы) для последовательного растворения огневки, добавив 900 мкл LB или ПБС к каждой трубе. Для каждой рыбы, подготовить 5 – 6 трубок и сделать десятикратного серийных разведений кишечных огневки, добавив 100 мкл огневки первой трубки, vortexing его в смесь, а затем добавить 100 µL из первой трубки на вторую трубу.
   2. Повторите эту процедуру до тех пор, пока все разведения были подготовлены.
   3. Пластина 100 – 200 мкл каждого разведения на плиты агара LB, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина (если используется стрептомицин резистентных штаммов) и 40 мкг/мл X-Гал (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Инкубируйте пластины при 30 ° C для 16 – 18 ч.
   4. После ночи инкубации граф V. cholerae колоний на тарелках, либо с помощью автоматизированных колонии счетчика или вручную подсчета колоний; Это полезно для обозначения подсчет колоний с кончиком маркера.
   5. Определите кое в кишечнике рыбы путем умножения пластины счетчик на коэффициент разбавления суспензии, принимая во внимание объем, который был покрытием.

2. Измерение рыб понос

Примечание: Четыре различные метрики были использованы для оценки рыбы понос: муцина уровней воды, уровни общего экскретируется белка в воде, ОД₆₀₀ воды и V. cholerae кое в воды¹³. Диарея, как правило, становится очевидным, визуально приблизительно в 6 ч после воздействия данио рерио V. cholerae как описано выше.

1. Определить уровни муцина
   Примечание: Секрета муцина индуцируется в период колонизации V. cholerae и является хорошей мерой уровня экскреции, особенно в начале в инфекции¹³. Муцина assay является вариацией на микротитровальных кислоты периодической Шифф пробирного¹⁹.
   1. Подготовьте следующие материалы: 50% (w/v) периодической кислоты раствор и 0,1% раствор кислоты периодической рабочей (10 мкл 50% акций периодической кислоты, добавляется 5 мл 7% уксусной кислоты — использовать сразу после приготовления), стандарты муцина, 96-луночных микротитровальных плиты, Шифф Реагент.
      1. Подготовка стандартов муцина, приостановив следующие количества муцина (от свиного желудка типа III) в буфере ацетат натрия (100 мм натрия ацетата, ЭДТА 5 мм, pH 5.5 с уксусной кислоты кристаллизированной): 400 мкг/мл, 300 мкг/мл, 200 мкг/мл, 150 мкг/мл , 100 мкг/мл, 75 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл и 10 мкг/мл.
         Подготовить пластину, добавив 100 мкл заражения воды для каждой скважины, которая будет использоваться в assay следующим: пустой ПБС; муцина стандартов как описано выше, или образец воды от рыбы-инфекции. У каждого образца в трех экземплярах.
   2. Добавьте 50 мкл свежие периодические кислоты 0,1% раствора каждый хорошо с многоканальные пипетки и смешайте его закупорить вверх и вниз несколько раз.
   3. Плотно заверните пластину в полиэтиленовой пленкой и инкубировать при 37 ° C на 1 – 1,5 ч.
   4. Прохладный пластины до комнатной температуры для 5 – 10 минут добавить 100 мкл раствора (Шифф 's реагент) фуксин для каждой скважины и накапайте вверх и вниз, чтобы смешать его.
   5. Обернуть тарелку в полиэтиленовой пленкой и инкубировать его при комнатной температуре на качающейся платформе, пока не разработал цвет; Цвет обычно развивается в течение 20 мин, читать поглощения на 560 Нм, с помощью пластины читателя.
   6. Участок муцина калибровочной кривой (OD₅₆₀против мкг/мл муцина стандарт). Определите уровни муцина неизвестных путем выявления, где ОД₅₆₀ каждого неизвестного падает на калибровочной кривой и чтения соответствующего муцина концентрации для этого значения.
2. Определить уровни белка
   Примечание: Помимо муцина, общий уровень белков в воде являются другой прокси для уровней понос (пасмурно, жидкий стул) производства рыбы. Эта процедура использует стандартный assay Брадфорд для оценки уровня белка. Уровни белка оцениваются основе бычьим сывороточным альбумином (БСА) калибровочной кривой.
   1. Смешайте 100 мкл одного из стандартов BSA (см. Примечание ниже) или 100 мкл воды (вода из стакан, содержащие зараженные рыбы) инфекции с 900 мкл Брэдфорд реагента assay (Реагент assay белка Пирс работает хорошо для этого) в одноразовых кювет. Инкубируйте все образцы при комнатной температуре на 2 мин.
      Примечание: Следующие стандарты BSA были использованы: 1800 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 750 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 50 мкг/мл и 25 мкг/мл. BSA стандартов разводили газобетона дистиллированной воды.
   2. Читайте ОД₆₆₀ каждого стандарта или образец их с помощью спектрофотометра.
   3. Сюжет, BSA калибровочной кривой (OD₆₆₀против мкг/мл). Определите уровни белка неизвестных путем выявления где ОД₆₆₀ каждого неизвестного падает на BSA калибровочной кривой и прочитать соответствующие муцина концентрации для этого значения.
3. Мера ОД₆₀₀
   Примечание: Наличие понос (пасмурно, жидкий стул) явно очевидно, после нескольких h и простое определение₆₀₀ ОД может использоваться для количественного определения это.
   1. Инвертируйте трубка, содержащая заражения воды несколько раз, чтобы равномерно распределить содержимое. Добавьте 1 мл пробы воды в одноразовых кювет. Используйте 1 мл стерильного инфекции воды в качестве отрицательного контроля.
   2. «Пустой» измерения с помощью спектрофотометра 600 нм с использованием образца отрицательного контроля. Читать каждый образец воды на 600 Нм и записывать результаты.
4. Определение экскретируется V. cholerae кое/мл после инфекции
   Примечание: Одним из основных компонентов понос, производимые данио рерио экскретируется V. cholerae. Определение кое/мл может использоваться для таких целей, как оценка бактериальной репликации в желудочно-кишечном тракте рыбы и в качестве меры инфекционного дозы в экспериментах передачи. Эта мера лучше всего сделать, когда временное инфекции имело место. Если используется 24 h инфекции, то этот assay будет измерять комбинированные посевные плюс экскретируется V. cholerae.
   1. Взять образец воды в точке желаемое время и серийно разбавить его, как описано ранее.
   2. Пластина серийных разведений на выборочной СМИ (LB агар, содержащие стрептомицина или другой соответствующий антибиотик или DCLS) и инкубировать их в 30 ° C в течение 24 ч.
   3. Подсчет колоний. Вычислить кое / мл воды, как описано на шаге 1.5.

Результаты

V. cholerae колонизации кишечного тракта данио рерио

Чтобы дать пример типичного колонизации уровней, мы наблюдаем, мы прививку 5 х 10⁶ CFU штамма пандемического Эль-Тор V. cholerae N16961 в 200 мл воды в стакан, содержащий несколько рыбок д...

Обсуждение

Данио рерио — это относительно новая модель для изучения V. cholerae , но очень перспективным для будущего открытие ранее неизвестных аспектов V. cholerae биологии и патогенез^11,12,13 . Взрослый zebrafish модель имеет преимущества обеих приро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5