Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Resumo

Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.

Resumo

Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.

Introdução

Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica^1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie^3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal de peixes em diferentes zonas geográficas^7,8,9,10. A presença de V. cholerae em peixes indica que o peixe pode atuar como um reservatório ambiental. Peixes também poderiam ser implicados na transmissão da doença aos seres humanos e na disseminação geográfica de V. cholerae estirpes⁶.

Para entender melhor como o V. cholerae interage com peixe, Danio rerio, mais conhecido como peixe-zebra, foi desenvolvido como um sistema modelo para estudar V. cólerae¹¹. Zebrafish são nativas do Sul da Ásia, incluindo a região da Baía de Bengala, que é pensado para ser o mais antigo reservatório de V. cholerae. Antes do início primeiro cólera pandemia, em 1817, a cólera não tinha sido relatada fora do que é hoje a Índia e Bangladesh. Portanto, zebrafish e V. cholerae quase certamente associado com o outro em escalas de tempo evolutivo, sugerindo que zebrafish são uma série de V. cholerae no ambiente natural¹².

O modelo de zebrafish para o V. cholerae é simples de executar e pode ser usado para estudar a patogenicidade de todo o ciclo de vida V. cholerae . Peixes são expostos para o V. cholerae por tomar banho na água que tenha sido inoculado com um número conhecido de V. cholerae. Dentro de algumas horas, colonização intestinal ocorre, seguido pela produção de diarreia. Diarreia consiste de mucina, proteínas, bactérias excretadas e outro conteúdo intestinal. O grau de diarreia pode ser quantificado usando algumas medições simples¹³. V. cholerae que tem sido excretado pelos peixes infectados pode então ir para infectar os peixes ingênuo, completando o ciclo infeccioso. Portanto, o modelo de zebrafish recapitula o V. cholerae doença humana processo^12,14.

O mais frequentemente usado V. cholerae modelos animais têm sido, historicamente, ratos e coelhos^{14,15,16,17,18}. Esses modelos têm sido fundamentais para adicionar ao nosso conhecimento de V. cholerae patogênese. No entanto, porque os ratos e coelhos não são naturais V. cholerae anfitriões, existem limitações a que aspectos do ciclo de vida V. cholerae podem ser estudados. A V. cholerae colonização de ratos e coelhos, normalmente, requer a ausência da microbiota intestinal ou um tratamento prévio com antibióticos para danificar a microbiota intestinal. Ambos os modelos requerem ou gavagem para introduzir as bactérias para o sistema digestivo ou manipulação cirúrgica para injetar diretamente as bactérias no intestino. Zebrafish têm uma vantagem em que peixes adultos com uma microbiota intestinal intacta prontamente são colonizados e o processo infeccioso acontece naturalmente, sem qualquer manipulação necessária.

O presente trabalho demonstra a utilização do zebrafish como modelo em V. cholerae infecção. A infecção, dissecação, enumeração de colonizar V. choleraee a quantificação de diarreia causada pelo V. cholerae será descrito^12,13. Este modelo é provável que seja útil para os cientistas interessados no processo de doença V. cholerae e o V. cholerae ambiental estilo de vida.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Wayne State University. Esse método foi descrito pela primeira vez em Runft et al . ¹²

1. determinação dos níveis de colonização Intestinal

Nota: Colonização Intestinal é a métrica mais útil no modelo de zebrafish como ele pode ser usado para comparar a adequação relativa de diversas variedades de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou nocautes de gene.

1. Inoculação de zebrafish por imersão
   Nota: Este meio de exposição assemelha-se o curso natural da infecção.
   1. Preparação do V. cholerae
      1. Inocular 5ml de caldo lisogenia (LB) com um isolado V. cholerae colônia de um LB da placa e incubar a 37 ° C, com agitação (180 rpm) para 6-8 h (cultura durante a noite).
      2. Inocule 25 mL de meio fresco de LB esterilizado em um Erlenmeyer de 250 mL com 50 µ l de cultura acima durante a noite. Incube-16 – 18 h a 37 ° C, com agitação (150 rpm).
      3. Ler a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) de uma diluição de 1/10 da cultura durante a noite para estimar o número de bactérias por mL (o OD₆₀₀ = 1 é 10 ~⁹ UFC/mL.)
      4. Colher as células por centrifugação a 6.000 g durante 10 min. remover a mídia com uma pipeta ou derramá-lo fora em uma solução desinfetante. Ressuspender as células em PBS estéril para a concentração desejada, tipicamente entre 1 x 10⁷ a 1 x 10¹⁰ por ml de PBS.
         Nota: Aqui, nos referimos a autoclavado osmose reversa água contendo sais de 60 mg/L do mar como água estéril de infecção.
   2. Inoculação e incubação
      1. Colocar um copo de 400 mL, contendo 200 mL de água estéril infecção zebrafish quatro ou cinco.
      2. Adicione 1 mL de V. cholerae (da etapa 1.1.1.4.) para obter a concentração desejada de infecção (tipicamente 5 x 10⁴ a 5 x 10⁷ UFC/mL) em 200 mL de água de infecção.
      3. Cobrir o recipiente com uma tampa perfurada para evitar que os peixes saltem para fora; parte superior de uma caixa de dica de 200 µ l funciona bem para isso.
      4. Etiquete cada copo e colocá-los em uma incubadora de vidro da frente regulado a 28 ° C, para a duração do experimento.
   3. Procedimento para a exposição transitória
      Nota: Uma exposição transitória para o V. cholerae (tipicamente de 6 h) seguida da remoção das bactérias inoculando é útil para estudar a transmissão e para a quantificação mais precisa de bactérias excretadas.
      1. Após 6 h de exposição, deite fora a água do copo através de uma rede para recolher os peixes. Descarte a água infectada dentro de um recipiente de água sanitária para matar o V. cholerae.
      2. Coloque o peixe removido em um copo de 200 mL de água estéril de infecção. Permitir que os peixes a nadar nessa água limpa por 5 min remover as bactérias de superfície do peixe.
      3. Repita o procedimento líquido (etapa 1.2.2) e coloque o peixe em um novo copo de 200 mL de água estéril de infecção. Mantenha o peixe este copo para a duração do experimento.
2. Eutanásia
   1. Quando o experimento alcançou seu ponto final desejado, tirar uma amostra da infecção água (15 mL é geralmente suficiente) permitir excretadas contagens bacterianas e a medição de diarreia (tais como o ensaio de mucina, teor de proteínas e/ou OD), se desejado (secção 2).
   2. Despeje o restante da água através de um arrastão (para recolher os peixes) em água sanitária para matar o V. cholerae na água.
   3. Coloque o peixe em um béquer contendo água de infecção mais 336 µ g/mL de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) e incube-os peixes nesta solução tricaina por 20 min no RT
      Nota: As redes de pesca foram esterilizados com uma solução de água sanitária 10%.
3. Dissecação
   1. Preparação de peixes
      1. Escave um peixe para fora a solução tricaina com uma colher de plástico descartável e coloque-o na superfície de dissecação.
      2. Posição o peixe com o seu lado ventral virada para cima e pino através do maxilar inferior, com a extremidade romba do pino angular longe do centro do corpo. Coloque outro pino só posterior ao ânus, também em ângulo longe do corpo.
   2. Exposição do trato intestinal
      1. Limpe a superfície ventral do peixe com uma limpeza de fiapos, embebida em etanol 70%.
      2. É necessário esterilize um bisturi e Tesoura Vannas mergulhando-os em etanol a 70% e em chamas-los.
      3. Faça uma pequena incisão longitudinal na barriga apenas sob a pele, penetrando as escalas e usando o bisturi. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, como o trato intestinal está localizado logo abaixo da pele.
      4. Usando a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do comprimento do corpo, evitando o ânus e a corte não mais profundo do que o nível da pele.
      5. Fazer dois cortes laterais com a tesoura em direção a cabeça do peixe para permitir uma abertura da incisão.
      6. Pino da pele de cada lado das incisões laterais à superfície dissecação, dobrando os pinos para fora, longe do corpo.
         Nota: As pontas dos pinos foram previamente esterilizadas por flamejante-los com álcool.
   3. Remoção do trato intestinal
      Nota: O trato intestinal deve ser visível como um tubo pálido, muito fino, em cima de outros órgãos.
      1. Flama-esterilizar o fórceps e então usá-los para remover todo trato intestinal (geralmente de 12 a 15 mm de comprimento). Coloque o intestino em um tubo de homogeneização contendo grânulos de vidro (ver passos 1.4.1–1.4.2) e 1 mL de 1X PBS ou LB, no gelo.
4. Homogeneização
   1. Preparar os tubos de homogeneização com antecedência pelo derramamento ~1.5 g de grânulos de vidro de 1 mm em 2 mL tampa de rosca tubos (preenchê-los aproximadamente na metade do caminho) e então esterilizá-los em autoclave.
   2. Adicione 1 mL de LB estéril ou 1X PBS.
   3. Uma vez que os intestinos de zebrafish tem sido parafuso adicionado (etapa 1.3.3.1) para os tubos, as tampas na muito firmemente e prenda os tubos num homogeneizador vórtice.
   4. Homogeneizar as amostras por 1 min na configuração máxima e, em seguida, fixe-los no gelo para 1 a 2 min. Repita este ciclo de homogeneização mais uma vez para uma homogeneização completa.
      Nota: Vários métodos alternativos para homogeneização também irão funcionar.
5. Quantificar os níveis de colonização intestinal
   1. Prepare tubos (tubos de ensaio de vidro pequeno ou tubos de microcentrifuga de 1,5 mL) para a diluição serial do homogenate adicionando 900 µ l de LB ou 1X PBS a cada tubo. Para cada peixe, preparar tubos de 5 – 6 e fazer 10 vezes diluições em série do homogenate intestinal adicionando-se 100 µ l de homogeneizado para o primeiro tubo, num Vortex para mistura e em seguida, adicionar 100 µ l do tubo do primeiro para o segundo tubo.
   2. Repita este procedimento até que todas as diluições foram preparadas.
   3. Placa de 100 a 200 µ l de cada diluição em placas de ágar LB contendo 100 µ g/mL de estreptomicina (se usando cepas resistentes de estreptomicina) e 40 µ g/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incube as placas a 30 ° C para 16 – 18 h.
   4. Após a incubação durante a noite, contagem das colónias V. cholerae nas placas, usando um contador de colônia automática ou manualmente, contando as colônias; é útil marcar as colônias contadas com uma ponta de marcador.
   5. Determine o CFU por intestino de peixe multiplicando-se a contagem de placa pelo factor de diluição da suspensão, tendo em conta o volume que foi chapeado.

2. medição de diarreia de peixe

Nota: Quatro métricas diferentes foram usadas para avaliar a diarreia de peixe: os níveis de mucina na água, os níveis de proteína excretados geral em água, o OD₆₀₀ da água e o V. cholerae CFU na água¹³. Diarreia normalmente torna-se visualmente evidente aproximadamente 6 h após a exposição do zebrafish para V. cholerae conforme descrito acima.

1. Determinar os níveis de mucina
   Nota: A secreção de mucina é induzida durante a colonização de V. cholerae e é uma boa medida de níveis de excreção, especialmente no início de infecção¹³. O ensaio de mucina é uma variação sobre o ácido periódico microtiter Schiff ensaio¹⁹.
   1. Preparar os seguintes materiais: solução de ácido periódico a 50% (p/v) e solução de 0,1% ácido periódico trabalho (10 µ l do estoque 50% ácido periódico adicionado a 5 mL de ácido acético 7% — usar imediatamente depois de fazer), padrões de mucina, placas de microtitulação 96 poços, Schiff reagente.
      1. Preparar padrões de mucina, suspendendo as seguintes quantidades de mucina (a partir de um tipo de suínos estômago III) em um tampão de acetato de sódio (100 mM de sódio acetato, 5mM EDTA, pH 5.5 com ácido acético glacial): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL.
         Preparar a placa adicionando-se 100 µ l de infecção a água a cada poço que será usado no ensaio da seguinte forma: em branco 1X PBS; padrões de mucina conforme descrito acima, ou uma amostra de água da infecção de peixe. Fazer cada amostra em triplicado.
   2. Adicione 50 µ l de solução de ácido periódico fresca de 0,1% para cada um bem com uma pipeta multicanal e misturá-lo pipetando subindo e descendo várias vezes.
   3. Embrulhe em filme plástico da placa e incubar a 37 ° C para 1-1.5 h.
   4. Fixe a placa até à temperatura de 5 a 10 min. Adicione 100 µ l de solução de fucsina (do reagente de Schiff) a cada poço e pipeta para cima e para baixo misturá-lo.
   5. Embrulhe o prato em filme plástico e incube-lo à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço até que desenvolveu a cor; a cor é geralmente desenvolvida dentro de 20 min. ler a absorvância a 560 nm, utilizando um leitor de placa.
   6. Traça uma curva padrão de mucina (OD₅₆₀vs µ g/mL mucina padrão). Determine os níveis de mucina do soldado desconhecido, identificando onde o OD₅₆₀ cada desconhecido cai na curva padrão e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.
2. Determinar os níveis de proteína
   Nota: Além de mucina, níveis de proteína total na água são outro proxy para os níveis de diarreia (fezes nublado, líquido) produzidos pelos peixes. Este procedimento usa um ensaio de Bradford padrão para estimar os níveis de proteína. Níveis de proteína são estimados com base em cima de uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA).
   1. Misture 100 µ l de uma das normas de BSA (ver nota abaixo) ou 100 µ l de água de infecção (água do Béquer contendo o peixe infectado) com 900 µ l de Bradford reagente de ensaio (Reagente de ensaio da proteína de Pierce funciona bem para isso) em uma cubeta descartável. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 min.
      Nota: As seguintes normas de BSA foram utilizadas: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Os padrões de BSA foram diluídos em água destilada esterilizada.
   2. Leia o OD₆₆₀ de cada norma, ou prove-los usando um espectrofotômetro.
   3. Traça a curva padrão BSA (OD₆₆₀vs µ g/mL). Determine os níveis de proteína do soldado desconhecido, identificando onde OD₆₆₀ cada desconhecido cai sobre a curva padrão de BSA e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.
3. Medida OD₆₀₀
   Nota: A presença de diarreia (fezes nublado, líquido) manifesta-se visivelmente após vários h e uma simples determinação de₆₀₀ OD podem ser usados para quantificar isso.
   1. Inverta o tubo contendo água a infecção várias vezes para distribuir o conteúdo. Adicione 1 mL da amostra de água para uma cubeta descartável. Use 1 mL de água estéril infecção como controlo negativo.
   2. Realizar uma medição "em branco", utilizando o espectrofotômetro a 600 nm, utilizando a amostra de controlo negativo. Leia cada amostra de água a 600 nm e registar os resultados.
4. Determinação de excretada V. cholerae UFC/mL após a infecção
   Nota: Um componente importante da diarreia produzida pelo zebrafish é excretado V. cholerae. A determinação da CFU/mL pode ser utilizada para fins tais como estimar a replicação bacteriana no trato intestinal peixe e como uma medida de uma dose infecciosa em experimentos de transmissão. Esta medida é feita melhor quando uma infecção transitória tem ocorrido. Se uma infecção de 24 h é usada, este ensaio medirá o inóculo combinado, mais o excretados V. cholerae.
   1. Tirar uma amostra de água no ponto de tempo desejado e diluí-la em série conforme descrito anteriormente.
   2. As diluições de série em meios selectivos (ágar-ágar LB contendo estreptomicina ou outro antibiótico apropriado ou DCLS) da placa e incube-os a 30 ° C por 24 h.
   3. Conte as colônias. Calcule o UFC / mL de água, conforme descrito na etapa 1.5.

Resultados

V. cholerae colonização do trato intestinal de zebrafish

Para fornecer um exemplo dos níveis típicos de colonização que observamos, nós inoculado 5 x 10⁶ UFC da pandemia EL Tor V. cholerae estirpe N16961 em 200 mL de água numa proveta contendo vários zebrafish. Após 6 h de infecção, os peixes foram lavados em água doce e transferidos para um copo de 200 mL de água esterilizada infecção c...

Discussão

O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese^11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5