أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لكفاءة عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. يبسط هذا الأسلوب الإجراء التقليدي باستخدام Y-27632 مثبط لموسيقى الروك في الأجلين المتوسط والتطعيم بصورة عفوية فصل خلايا البشرة من خلايا الجلد.

Abstract

الكيراتينيه البشرية الأولية المعزولة من أنسجة الجلد طازجة وعلى التوسع في المختبر يستخدم على نطاق واسع لمختبر البحوث والتطبيقات السريرية. طريقة العزل التقليدية الكيراتينيه البشرية ينطوي على إجراء خطوتين هضم الأنزيمي متسلسل، التي ثبت أن تكون غير فعالة في توليد الخلايا الأولية من أنسجة البالغين نظراً لمعدل استرداد الخلية منخفضة وانخفاض الخلية البقاء. نحن ذكرت مؤخرا أسلوب متقدمة لعزل الخلايا البشرية السلف البشرة الأولية من أنسجة الجلد التي تستخدم مثبطات كيناز رو Y-27632 في الأجل المتوسط. وبالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا الأسلوب الجديد هو أبسط وأسهل وأقل استهلاكاً للوقت، ويزيد الغلة طلائي الخلايا الجذعية ويعزز خصائصها الخلايا الجذعية. وعلاوة على ذلك، المنهجية الجديدة لا تتطلب انفصال البشرة عن الأدمة، وذلك، وهي مناسبة لعزل الخلايا من أنواع مختلفة من الأنسجة الكبار. هذا الأسلوب الجديد في عزلة يتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الطرق التقليدية، وهو أكثر ملاءمة لإنتاج إعداد كبيرة من خلايا البشرة بفاعلية عالية للمختبرات والتطبيقات السريرية. وهنا يصف لنا الطريقة الجديدة بالتفصيل.

Introduction

والهدف من ذلك وضع بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية (هككس) من أنسجة البالغين، خاصة بالنسبة للتطبيقات السريرية. خلايا جذعية البشرة الجلد، المترجمة في الطبقة القاعدية للجلد، وتمتلك إمكانات كبيرة لتتكاثر والتفريق وتوفير الكيراتينيه للحفاظ على وظائف الجلد^{1،2،3، 4}-هككس المعزولة من الجلد أنسجة تستخدم على نطاق واسع في الأغراض الجلد الأنسجة الهندسة والتجديد، خاصة في إصلاح تلف الجلد والعلاج الجيني للتطبيقات السريرية^5،6. هو القضية الرئيسية للتطبيقات المستندة إلى HKC لعزل بكفاءة وتوسيع إعداد كبيرة من هككس مع ارتفاع محتمل في المختبر^7،8. على الرغم من أن مختلف مجموعات بحثية تطورت أساليب إنتاج ثقافات هككس الشبيهة الجذعية، هذه الأساليب في بعض الأحيان تستغرق وقتاً طويلاً ومعقداً لأداء والقيود الأخرى، مثل الخلية منخفضة الغلة ويجري محدودة حسب نوع العينة الجلد ويستخدم⁹. على سبيل المثال، الأسلوب التقليدي لعزل هككس من أنسجة الجلد ينطوي خطوتين هضم الأنزيمي مع انفصال البشرة عن الأدمة⁶. هذا الأسلوب عادة ما يعمل بشكل جيد الوليدي الأنسجة، ولكن يصبح من الصعب جداً عندما تستخدم لعزل خلايا من أنسجة البالغين.

Y-27632، المانع من البروتينات المرتبطة رو كيناز (روك)، أبلغ أن يعزز كفاءة الخلايا الجذعية البشرة العزلة ومستعمرة النمو^10،،من¹¹¹². في دراسة سابقة، اكتشفنا أن Y-27632 يسهل نمو خلايا البشرة الاستنساخ ولكن يقلل عائد خلايا الجلد عن طريق خلطات السيطرة على التعبير عن التصاق جزيئات¹³. كما أنشأنا وسيلة تلقيح مكيفة جديدة، تسمى ز-المتوسطة، التي تدعم النمو والعائد من خلايا البشرة الأولية. من خلال الجمع بين ز-متوسطة مع Y-27632، يمكن فصل هذا الأسلوب رواية عفويا خلايا البشرة والجلد بعد إنزيم الهضم، وبالتالي إزالة الخطوة البشرة-الأدمة الفصل^13،14. استناداً إلى التقارير السابقة، ونحن الآن أن تصف الإجراءات المفصلة لهذا الأسلوب الجديد لعزل هككس من أنسجة الجلد الكبار.

Protocol

الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول قد تم التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية للمؤسسة (NO.2015120401، التاريخ: 12 مايو 2015).

1-الأعمال التحضيرية

1. تعديل الأنسجة جمع جلد البطن الكبار جديدة سيتم تجاهلها من الجراحة التجميلية في المستشفى في أنبوب 50 مل مع 10 مل دولبيكو المثلج النسر المتوسطة (دميم). يمكن الاحتفاظ بالعينة في 4 درجات مئوية ليصل إلى 72 ساعة دون درجة كبيرة تؤثر على بقاء الخلية.
2. إعداد الكواشف والمتوسطة الثقافة كما هو موضح أدناه.
   1. إضافة 1 مل من البنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 مغ/لتر) إلى 50 مل من محلول التي مخزنة الفوسفات (PBS) لإعداد الحل الغسيل.
   2. إعداد مجموعتين من إنزيم الهضم الحلول: (1) إعداد 50 مل ديسباسي (2.5 ملغ/مل في دميم) و 50 مل من النوع الأول كولاجيناز (2.5 ملغ/مل في دميم) بشكل منفصل عن الطريقة التقليدية؛ و (2) إعداد 50 مل مزيج ديسباسي والنوع الأول كولاجيناز (ذوب 125 ملغ من مسحوق ديسباسي و 125 ملغ من النوع الأول من مسحوق كولاجيناز في 50 مل دميم) للأسلوب الجديد.
      ملاحظة: جميع إنزيم الحلول ينبغي تصفيتها بمصفاة 0.22 ميكرومتر وأبقى at4 درجة مئوية.
   3. إعداد الحلول الهضم لكلا الأسلوبين: التربسين 0.05% و 0.25% التربسين تم شراؤها تجارياً. إعداد 10 ملغ/مل الدناز أنا الحل بإذابة 50 مغ الدناز أنا مسحوق في 5 مل من برنامج تلفزيوني، تصفية بمصفاة 0.22 ميكرومتر، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
   4. إعداد 500 مل متوسطة تحييد الهضم الأنزيمي: دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
   5. إعداد 500 مل من التطعيم المتوسطة (التي تحتوي على عامل النمو المتوسطة، دعا ز-المتوسطة): DMEM/F12 المتوسطة (3:1) الذي يحتوي على 1% البنسلين/ستربتوميسين، 40 ميكروغرام/مل فونجيزوني، 40 نانوغرام/مليلتر تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو 2 (FGF2)، 20 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (لو)، و الملحق 2% B27.
   6. بريتريات خلية 100 ملم ثقافة الأطباق مع 2 مل مصفوفة الطلاء الذي يحتوي على نوع الكولاجين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

2-الأسلوب التقليدية

1. المعالجة المسبقة أنسجة الجلد
   1. تأخذ 1.5 سم² من أنسجة الجلد وغسله x 1 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني؛ ثم شطفة مع 10 مل إيثانول 70% ل 30 s واحتضان أنه x 2 مع 10 مل من الغسيل الحل (برنامج تلفزيوني يتضمن البنسلين 2% وستربتوميسين)، كل 5 دقائق.
      ملاحظة: يتم تنفيذ يغسل جميع في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق داخل غطاء الاندفاق الصفحي.
   2. تقليم النسيج مع مقص معقم إزالة طبقة الدهون تحت الجلد في صحن ثقافة خلية 100 مم، وتزن ثم أنسجة الجلد (الوزن 1 ز في هذا البروتوكول).
      ملاحظة: التشذيب كافية بالغ الأهمية لكفاءة فصل البشرة من الأدمة. ويمكن بسهولة تمييز طبقة الدهون مصفر بصريا.
   3. نقل الأنسجة إلى آخر طبق معقم 100 ملم مع الجانب باطن الجلد إلى أسفل، وثم قطع أنسجة الجلد إلى شرائح 3 إلى 4-مم-على صعيد استخدام شفرة المبضع.
      ملاحظة: الجانب الأدمة مع طبقة الدهون بسهولة التعرف بصريا.
   4. أضف 10 مل من محلول ديسباسي 2.5 ملغ/مل إلى أنسجة الجلد في صحن ثقافة 100 ملم، واحتضان ثم طبق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أي أكثر من 20 ح).
      ملاحظة: يمكن حساب مقدار ديسباسي الحل باستخدام 10 مل من محلول ديسباسي لهضم كل جرام من الأنسجة.
2. انفصال البشرة عن أنسجة الجلد
   1. اليوم الثاني، تقشر البشرة من باطن الجلد باستخدام الملقط غرامة.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب أن تقشر البشرة، الهضم ديسباسي لم تكن كافية، الذي يحدث عادة بسبب اقتطاع غير كافية للأنسجة. وفي هذه الحالة، يحتاج الأنسجة فترة حضانة أطول.
   2. فرم البشرة مقشرة مع 500 ميليلتر من مستنبت الخلية إلى ملاط أنسجة استخدام شفرات مشرط؛ ثم، ريسوسبيند أنه مع 10 مل التربسين 0.25% في أنبوب 50 مل واحتضان من 20 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، مع الهز.
3. جمع واستزراع الخلايا الأولية
   1. تحييد نشاط التربسين بإضافة وحدة تخزين مساوية لتحييد الحل (10 مل في هذا البروتوكول).
   2. فصل خلايا البشرة قبل بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً 20 x مع ماصة 10 مل مصلية وتمرير الحل خلية عن طريق مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة أي حطام الأنسجة المتبقية.
   3. الطرد المركزي حل الخلية في 200 x ز لمدة 5 دقائق بعد الترشيح؛ ريسوسبيند بيليه الخلية في تحييد المتوسطة للغسيل، وثم الطرد المركزي أنه مرة أخرى في 200 x ز للحصول على خلية بيليه.
   4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة keratinocyte الكالسيوم منخفضة وخالية من المصل (SFM). تأخذ 10 ميليلتر لهذا الحل عد عدد الخلايا الإجمالية، ولوحة حوالي 2 × 10⁶ خلايا، ثم مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق pretreated مع مصفوفة الطلاء (التي تحتوي على النوع الأول من الكولاجين).
      ملاحظة: يتم طلاء خطوة ضرورية للطريقة التقليدية.
   5. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 (د).
      ملاحظة: التحقق من التصاق الخلايا تحت مجهر قبل وبعد تغيير الثقافة المتوسطة.
   6. مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80% التقاء.
      ملاحظة: جميع أطباق الثقافة هي pretreated مع مصفوفة الطلاء.

3-أسلوب جديد

1. المعالجة المسبقة أنسجة الجلد
   1. جمع الأنسجة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2، 1) للأسلوب التقليدي.
   2. أغسل أنسجة الجلد 1 x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، وتزن ثم، في حاوية بلاستيكية معقمة بمقياس إلكترونية (الوزن حوالي 1 ز في هذا البروتوكول).
      ملاحظة: وزن الحد الأدنى من الأنسجة اللازمة لهذا البروتوكول 0.1 غ، نظراً لأنه من الصعب الحصول على عدد كاف من الخلايا إذا كانت العينة الأنسجة المستخدمة صغيرة جداً. لا يوجد أي الحد الأقصى للوزن من الأنسجة لهذا البروتوكول، الذي يعتمد في نهاية المطاف على قدرة التعامل مع المشغل.
   3. استخدام الملقط شطف أنسجة الجلد مع 10 مل إيثانول 70% لمدة 30 ثانية.
   4. احتضان الأنسجة 2 x مع 10 مل من الغسيل الحل (أعد الخطوة 2.1.1)، لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الغسيل المشار إليها أعلاه في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق داخل غطاء الاندفاق الصفحي (غطاء زراعة الأنسجة).
   5. نقل الأنسجة إلى آخر خلية 100 ملم الثقافة طبق العقيمة.
   6. باستخدام شفرات مشرط، فرم النسيج دقيق إلى ملاط أنسجة.
   7. إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل 5 دقائق للحفاظ على الأنسجة الرطبة.
      ملاحظة: يستغرق حوالي 15 دقيقة لخطوات 3.1.5-3.1.7. يتم تنفيذ كافة الخطوات المذكورة أعلاه في درجة حرارة الغرفة.
2. هضم أنسجة الجلد
   1. نقل الحل النسيج المتجانس في أنبوب 50 مل. أضف 10 مل مخلوط الإنزيم لكل 1 غ من أنسجة الجلد. مزيج الإنزيمات تماما مع أنسجة المتجانس.
   2. احتضان المخلوط مع الهز في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ح 1.
   3. إضافة وحدة تخزين 1/5 من 0.25% التربسين (2.5 مل في هذا البروتوكول) إلى الخليط الهضم لآخر 30 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
   4. إضافة الدناز أنا الحل إلى خليط الإنزيم بنسبة 1: 100 (v/v) (250 ميليلتر في هذا البروتوكول) وتبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. جمع واستزراع الخلايا الأولية
   1. إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 12.5 مل من تحييد المتوسطة بنسبة 1:1. "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً لحوالي 20 x, استخدام ماصة 10 مل مصلية لفصل الخلايا.
   2. تصفية الخلايا معزولة عن طريق مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة الحطام الأنسجة. الطرد المركزي المادة طافية في 200 x ز 5 دقيقة ملاحظة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
   3. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه الخلية مع 10 مل من تحييد المتوسطة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 200 x ز لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.
   4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من التطعيم المتوسطة (ز-المتوسطة من الخطوة 1.2.5) مع 10 ميكرون من Y-27632.
   5. تأخذ 10 ميليلتر من الحل لعد عدد الخلايا الإجمالية، ولوحة حوالي 2 × 10⁶ خلايا، ثم مع 10 مل من ز-المتوسطة إلى طبق ثقافة خلية 100 ملم.
      ملاحظة: الخطوة precoating غير ضروري للأسلوب الجديد، ولا إزالة طبقة الجلد مطلوب أما.
   6. بعد 3 د، يستعاض عن المتوسطة التطعيم منخفضة الكالسيوم المتوسطة الإدارة المستدامة للغابات. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 (د).
      ملاحظة: التحقق من التصاق الخلايا قبل وبعد تغيير المتوسطة.
   7. مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80% التقاء.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، بريتريت الخلايا مع التربسين 0.05% لمدة 2 دقيقة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة تلوث خلايا الجلد قبل تريبسينيزينج خلايا البشرة.

4-خلية باساجينج

1. إزالة المتوسطة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وثم إضافة 2 مل التربسين 0.05% (لكل طبق 100 ملم).
2. احتضان الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية، مع 5% CO₂) لمدة 5 دقائق.
3. فحص الخلايا باستخدام مجهر للتأكد من أن كافة الخلايا وقد فصل من طبق الثقافة.
4. إضافة 8 مل دميم مع 10% FBS تحييد رد فعل الانزيمية، ومن ثم، جمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
5. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق للحصول على خلية بيليه.
6. إزالة المادة طافية ببطء، ثم، ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات المتوسطة وحساب عدد الخلايا.
7. بلايت 1 × 10⁶ خلايا مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في كل طبق خلية 100 ملم.
8. تغيير المتوسطة كل 2 (د).

النتائج

وترد في الشكل 1التخطيطية للأسلوب الجديد (الشكل 1A) والطريقة التقليدية (الشكل 1B). هو الأسلوب التقليدي خطوتين هضم، الأمر الذي يتطلب إجراء 2 يوم. على النقيض من ذلك، هو أسلوب جديد هضم خطوة واحدة، والتي تستغرق حوالي 3 ساعات لأداء. ا...

Discussion

هككس الابتدائي مثقف قد استخدمت على نطاق واسع لعلاج الجروح في مستوصفات لأكثر من ثلاثة عقود، ومنذ ذلك الوقت، أنها كانت دائماً أهمية كفاءة الحصول على إعداد كافية من الخلايا للتطبيقات السريرية في الوقت مناسب. ولذلك، في الممارسة العملية، طريقة العزل التقليدية، الأمر الذي يتطلب انفصال البشرة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis