שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

Abstract

ראשי keratinocytes האנושי מבודד רקמות עור רענן, שלהם הרחבה במבחנה היה בשימוש נרחב עבור מחקר מעבדתי, יישומים קליניים. השיטה המקובלת בידוד keratinocytes האנושי כרוך הליך רציפים עיכול אנזימטי בן שני שלבים, אשר הוכח להיות יעיל ליצירת תאים העיקרי של רקמות בוגרות עקב קצב התאוששות התאים נמוך תא מופחת הכדאיות. לאחרונה דיווחנו שיטה מתקדמת כדי לבודד אנושי ראשוני עוריות ובתאים של רקמות העור אשר מנצל את מעכבי קינאז רו Y-27632 בטווח הבינוני. בהשוואה עם פרוטוקול מסורתיים, שיטה חדשה הוא יותר פשוט, קל יותר, פחות זמן רב, ו מגביר תאי אפיתל התשואה ומגבירה את המאפיינים תאי הגזע שלהם. יתר על כן, המתודולוגיה החדשה אינה דורשת את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, ומתאים, לכן, לבודד תאים מסוגים שונים של רקמות בוגרות. שיטה חדשה זו בידוד מתגבר את החסרונות העיקריים של שיטות קונבנציונליות, והוא מתאים יותר לייצר מספר גדול של תאים באפידרמיס עם האון גבוהה הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים. כאן, אנו מתארים את השיטה החדשה בפירוט.

Introduction

המטרה הייתה לפתח פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לבודד keratinocytes אנושי ראשוני (HKCs) של רקמות בוגרות, במיוחד עבור יישומים קליניים. תאי גזע עוריות העור, מותאם לשכבת הבסיס של העור, בעלי פוטנציאל גבוה כדי להתרבות, להבדיל ולספק keratinocytes כדי לשמור על הפונקציות של העור^{1,2,3, 4}. HKCs מבודד מן העור רקמות נמצאים בשימוש נרחב למטרות בעור רקמות הנדסה והתחדשות, במיוחד בתיקון של עור פגוע, ריפוי גנטי עבור יישומים קליניים^5,6. הנושא המרכזי עבור יישומים מבוססי-HKC הוא ביעילות לבודד ולהרחיב מספרים גדולים של HKCs עם גבוהה פוטנציאל במבחנה^7,8. למרות קבוצות מחקר שונות פיתחו שיטות כדי לייצר תרבויות של גזע דמוי HKCs, שיטות אלה הם לעיתים זמן רב ומורכב לבצע ויש מגבלות אחרות, כגון תא נמוך התשואות מוגבלים לפי סוג העור הדגימה שימוש⁹. למשל, השיטה המסורתית כדי לבודד HKCs רקמות העור כרוך עיכול אנזימטי של שני שלבים עם הפרדה של האפידרמיס הדרמיס⁶. בשיטה זו בדרך כלל עובד טוב בשביל לרקמות neonatal, אבל זה הופך להיות קשה מאוד, כאשר נעשה שימוש כדי לבודד תאים של רקמות בוגרות.

Y-27632, מעכב של רו-הקשורים חלבון (רוק), דווח לשפר באופן משמעותי את היעילות של תאי אפידרמיס בידוד והמושבה הצמיחה^10,11,12. במחקר הקודם, גילינו כי Y-27632 מקלה על צמיחת תאים אפידרמיס המשובטים אך מפחית את התשואה של עורי תאים על-ידי שליטה באופן שונה את הביטוי של מולקולות אדהזיה¹³. הקמנו גם מדיום ממוזגים חיסון חדש, בשם G-בינוני, אשר תומך את הצמיחה ואת התשואה של ראשי תאים באפידרמיס. על ידי שילוב G-בינוני עם Y-27632, שיטה חדשנית זו יכול באופן ספונטני נפרד תאים באפידרמיס עורי לאחר אנזים עיכול, ובכך להסיר את השלב של האפידרמיס-הדרמיס ההפרדה^13,14. על סמך דיווחים קודמים, נתאר עכשיו ההליך מפורט של שיטה חדשה כדי לבודד HKCs של רקמת עור מבוגר.

Protocol

ברקמות אנושיות בשימוש פרוטוקול זה יטופל בהתאם לקווים המנחים של ועדת האתיקה האנושית המחקר של המוסד (NO.2015120401, תאריך: מאי 12, 2015).

1. תכשירים

1. רקמות לאסוף טריים בעור בטן למבוגרים שנמחקו מן לכירורגיה פלסטית בבית החולים, שפופרת 50-mL עם 10 מ"ל של Dulbecco קר כקרח המתואמת של הנשר בינוני (DMEM). ניתן לשמור את הדגימה ב 4 ° C עבור עד 72 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי את הכדאיות התא.
2. להכין את ריאגנטים תרבות בינוני כפי שמתואר להלן.
   1. להוסיף 1 מ"ל של פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מ ג/ליטר) 50 מ של פתרון באגירה פוספט (PBS) כדי להכין את הפתרון כביסה.
   2. להכין שני סטים של אנזים עיכול פתרונות: (1) להכין 50 מ של dispase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM), 50 מ של סוג אני collagenase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM) בנפרד עבור השיטה המקובלת; (2) להכין 50 מ של תערובת של dispase, מסוג collagenase (התמוססות 125 מ ג של אבקת dispase ו- 125 מ"ג של להקליד אני אבקת collagenase 50 מ של DMEM) על השיטה החדשה.
      הערה: כל הפתרונות אנזים צריך להיות מסונן עם מסננת 0.22-מיקרומטר, המשיכה חברת at4 מעלות צלזיוס.
   3. הכנת מערכת העיכול פתרונות עבור שתי שיטות: 0.05% טריפסין, 0.25% טריפסין נרכשו מסחרית. הכינו 10 mg/mL DNase אני הפתרון על ידי המסת 50 מ"ג של DNase אני לפדר ב 5 מ של PBS, תסנן את זה עם מסננת 0.22-מיקרומטר, ואחסן אותו ב-20 ° C.
   4. הכנת 500 מ"ל של מדיום כדי לנטרל. את עיכול אנזימטי: בינוני DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
   5. הכנת 500 מ"ל של חיסון בינוני (צמיחה פקטור-המכילות בינוני, בשם G-בינוני): DMEM/F12 בינונית (3:1) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין, fungizone µg/mL 40, 40 ng/mL פיברובלסט גורם גידול 2 (FGF2), 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), ו תוספת 2% B27.
   6. Pretreat תרבית תאים מ מ 100 מנות עם 2 מ של ציפוי מטריצה המכילה סוג אני קולגן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

2. השיטה המקובלת

1. רעלני רקמת העור
   1. קח 1.5 ס מ² של רקמת העור ולשטוף אותו x 1 עם 10 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לשטוף אותו עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s דגירה זה 2 x עם 10 מ"ל לרחוץ את הפתרון (PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין), 5 דקות כל אחד.
      הערה: כל שוטף מבוצעות במנות תרבות תא 100-מ מ בתוך תא למינארי.
   2. חתוך את הרקמה במספריים סטרילי כדי להסיר את שכבת השומן התת עורית בצלחת תרבות תא 100-מ מ, ואז, שוקל רקמת העור (המשקל הוא 1 g בפרוטוקול זה).
      הערה: זמירה מספקת חיונית מאוד ההפרדה יעיל של האפידרמיס של הדרמיס. שכבת השומן צהבהב ניתן בקלות להבחין ויזואלית.
   3. להעביר הרקמה תבשיל סטרילי אחר של 100 מ מ עם הצד הדרמיס למטה וחותכים, ואז, רקמת העור לרצועות 3 ל 4-מ מכולו באמצעות להב סכין.
      הערה: הצד הדרמיס עם שכבת השומן בקלות מזוהה מבחינה ויזואלית.
   4. הוסף 10 מ"ל של 2.5 מ"ג/מ"ל dispase פתרון לרקמות העור בצלחת 100-מ מ תרבות ', לאחר מכן, דגירה המנה בין לילה ב 4 ° C (לא יותר מ- 20 h).
      הערה: ניתן לחשב את כמות dispase פתרון באמצעות 10 מ"ל של dispase פתרון למערכת העיכול של כל גרם של רקמת.
2. ההפרדה של האפידרמיס של רקמת העור
   1. ביום השני, לקלף האפידרמיס של הדרמיס באמצעות פינצטה משובחים.
      הערה: אם קשה לקלף את האפידרמיס, עיכול dispase לא הספיק, שהוא בדרך כלל עקב מחסור חיתוך של הרקמה. במקרה זה, הרקמה צריך זמן דגירה ארוך יותר.
   2. מינצ האפידרמיס קלופים עם 500 µL תא תרבות בינוני לתוך slurry רקמות באמצעות להבים ומהדקים; לאחר מכן, resuspend זה עם 10 מ"ל של 0.25% טריפסין בשפופרת 50-mL, דגירה זה 20 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C, ברעידות.
3. ואוסף culturing התאים הראשי
   1. לנטרל את פעילות טריפסין על-ידי הוספת אמצעי שווה של פתרון ניטרול (10 מ"ל ב פרוטוקול זה).
   2. מביצועם התאים באפידרמיס מאת pipetting הפתרון לכל אורך 20 x עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת רקמות שיורית.
   3. Centrifuge הפתרון תא ב x 200 גרם במשך 5 דקות לאחר סינון; resuspend בגדר תא במדיום ניטרול לרחצה, ואז, centrifuge אותו שוב ב x 200 גרם להשיג בגדר תא.
   4. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של סידן נמוכה, ללא סרום תקין בינוני (SFM). לקחת 10 µL של פתרון זה כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 10⁶ תאים עם 10 מ"ל של SFM לתוך תא 100-מ מ תרבות מאכלים מיוחדים עם ציפוי מטריקס (המכיל מסוג קולגן).
      הערה: ציפוי היא צעד הכרחי עבור השיטה המקובלת.
   5. לשנות את המדיום תרבות כל d 2.
      הערה: בדוק את הידבקות תאים במיקרוסקופ לפני ואחרי שינוי המדיום תרבות.
   6. המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות.
      הערה: כל המנות תרבות הם מיוחדים עם המטריצה ציפוי.

3. השיטה החדשה

1. רעלני רקמת העור
   1. לאסוף את הרקמה כמפורט לעיל (שלב 2.1) עבור השיטה המקובלת.
   2. לשטוף את רקמת העור 1 x עם 10 מ"ל ל- PBS, ואז, שוקל אותה בתוך מיכל פלסטיק סטרילית מאת מידה אלקטרוניים (המשקל הוא בסביבות 1 g בפרוטוקול זה).
      הערה: המשקל המזערי של רקמות לצורך פרוטוקול זה הוא 0.1 g, שכן הוא קשה להשיג מספר מספיק של תאים אם הדגימה רקמות בשימוש הוא קטן מדי. אין שום משקל מקסימלי של רקמה עבור פרוטוקול זה, אשר בסופו של דבר תלוי יכולת טיפול של המפעיל.
   3. להשתמש מלקחיים ולשטוף את רקמת העור עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s.
   4. דגירה הרקמה 2 x עם 10 מ"ל של כביסה לפתרון (להכין בשלב 2.1.1), 5 דקות בכל פעם.
      הערה: כל השלבים כביסה שצוין לעיל מתבצעות ב- 100-מ מ תא מנות תרבות בתוך תא למינארי (ברדס תרביות רקמה).
   5. להעביר את הרקמה תבשיל סטרילי תרבות 100-מ מ תא אחר.
   6. באמצעות להבים ומהדקים, מינצ הרקמה ביסודיות לתוך slurry רקמות.
   7. להוסיף 200 µL ל- PBS כל 5 דקות כדי לשמור על הרקמות רטוב.
      הערה: לוקח בערך 15 דקות לקבלת צעדים 3.1.5 - 3.1.7. כל הצעדים הנ ל מתבצעים בטמפרטורת החדר.
2. העיכול של רקמת עור
   1. להעביר את פתרון הומוגני רקמה לתוך צינור 50-mL. להוסיף 10 מ של אנזים תערובת עבור כל 1 g של רקמת העור. מערבבים האנזימים ביסודיות עם הרקמות homogenized.
   2. דגירה התערובת ברעידות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עבור 1 h.
   3. להוסיף נפח 1/5 של 0.25% טריפסין (2.5 מ ל פרוטוקול זה) לתערובת לעיכול עבור עוד 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
   4. להוסיף DNase אני הפתרון לתערובת האנזימים ביחס של 1: 100 (v/v) (250 µL ב פרוטוקול זה) דגירה זה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. ואוסף culturing התאים הראשי
   1. לעצור את תהליך העיכול על-ידי הוספת מ"ל של ניטרול בינוני על יחס 1:1. Pipette הפתרון למעלה ולמטה במשך 20 x, באמצעות פיפטה סרולוגית 10-mL מביצועם התאים.
   2. לסנן את התאים dissociated דרך מסננת תא 100-מיקרומטר לפנות את הפסולת רקמות. Centrifuge את תגובת שיקוע ב x 200 גרם במשך 5 דק להתבונן בגדר בתחתית הצינורית.
   3. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 10 מ"ל של ניטרול בינוני, צנטריפוגה שוב ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.
   4. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של חיסון בינוני (G-בינוני מהשלב 1.2.5) עם 10 מיקרומטר של Y-27632.
   5. קח 10 µL של הפתרון כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 10⁶ תאים עם 10 מ"ל של G-בינוני לתוך תבשיל תרבות תא 100-מ מ.
      הערה: השלב precoating אינו הכרחי עבור השיטה החדשה, ללא הסרה של שכבת הדרמיס נדרש גם.
   6. לאחר בתלת-ממד, החלף המדיום חיסון סידן נמוך SFM בינוני. לשנות את המדיום תרבות כל d 2.
      הערה: בדוק את הידבקות תאים לפני ואחרי שינוי המדיום.
   7. המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות.
      הערה: אם יש צורך, pretreat את התאים עם 0.05% טריפסין למשך 2 דקות ולשטוף את התאים עם PBS להסרת זיהום עורי תאים לפני trypsinizing את התאים באפידרמיס.

4. תא Passaging

1. להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף, ואז, 2 מ של טריפסין 0.05% (לפי כל מנה 100 מ מ).
2. דגירה התאים בתוך אינקובטור (37 ° C עם 5% CO₂) במשך 5 דקות.
3. בדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא כי כל התאים יש מנותקת המנה תרבות.
4. הוסף 8 מ של DMEM עם 10% FBS כדי לנטרל את התגובה אנזימטי, ואז, לאסוף את התאים בשפופרת 15-mL.
5. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי להשיג בגדר התא.
6. להסיר את תגובת שיקוע לאט, לאחר מכן, resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של SFM בינוני, לספור את מספר התאים.
7. צלחת עונה 1 פרק 10 תאים⁶ עם 10 מ"ל של SFM לתוך כל מנה תא 100-מ מ.
8. לשנות את המדיום כל d 2.

תוצאות

דיאגרמות סכמטית של השיטה החדשה (איור 1 א'), השיטה המקובלת (איור 1B) מוצגים באיור1. השיטה המקובלת היא עיכול בשני שלבים, המחייב הליך יומיים. לעומת זאת, השיטה החדשה היא עיכול בשלב אחד, אשר לוקח כ- 3 שעות לביצוע. חשוב, השיטה החדשה בשלב...

Discussion

בתרבית HKCs העיקרי היה להיות מנוצל באופן נרחב לטיפול פצעי במרפאות במשך יותר משלושה עשורים, מאז, זה היה תמיד חשוב ביעילות להשיג מספר מספיק של תאים עבור יישומים קליניים מבעוד. לפיכך, בפועל, השיטה המקובלת בידוד, הדורש את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, מקשה לעמוד בדרישות אלה, בשל התשואה נמוכה של התא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis