성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

요약

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

초록

기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

서문

목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부^1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 ⁴. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램^5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서^7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 다른 제한이 복잡 하 고 시간이 많이 소요 되기도 ⁹를 사용합니다. 예를 들어, 피부 조직에서 HKCs을 전통적인 방법은 진 피⁶에서 표 피의 분리 2 단계 효소 소화를 포함 한다. 그 방법은 일반적으로 신생아 조직을 위해 잘 작동 하지만 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 사용 하는 경우 그것은 매우 어려워집니다.

Y-27632, 억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)의 표 피 줄기 세포 격리와 식민지 성장^10,,1112의 효율성을 크게 향상을 보고 되었습니다. 이전 연구에서 우리는 Y-27632 상피 세포의 클론 성장을 촉진 하지만 차동 접착 분자¹³의 식을 조절 하 여 피부 세포의 수확량 감소를 발견 했다. 우리는 또한 성장과 기본 표 피 세포의 수익률을 지 원하는 G-매체 라는 새로운 조건된 접종 매체 설립. G-매체 Y-27632와 결합 하 여이 새로운 메서드는 표 피-진 피 분리^13,14단계 제거 효소 소화 후 저절로 피 및 피부 세포를 분리할 수 있습니다. 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 지금 성인 피부 조직에서 HKCs을이 새로운 방법의 상세한 절차를 설명 합니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일).

1입니다. 준비

1. 얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
2. 아래에 설명 된 시 약 및 문화 매체를 준비 합니다.
   1. 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 세척 솔루션 준비의 50 mL에 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 mg/L) 1 mL를 추가 합니다.
   2. 두 효소 소화 솔루션의 준비: (1) dispase (2.5 mg/mL에서 DMEM) 50 mL를 준비 하 고 50 mL의 유형 I 콜라 (2.5 mg/mL에서 DMEM) 별도로 기존의 방법; (2) 50 mL dispase의 혼합물을 준비 하 고 나에 게 콜라를 입력 (디졸브 125 mg dispase 가루와 125 밀리 그램의 유형 I 콜라 분말 DMEM의 50 ml에서) 새로운 방법에 대 한.
      참고: 모든 효소 솔루션 해야 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고 유지 at4 ° c.
   3. 소화 솔루션을 준비 하는 두 가지 방법에 대 한: 0.05 %trypsin 및 0.25 %trypsin 상업적으로 구입 했다. 10 mg/mL DNase 준비 나 DNase PBS의 5 mL에 분말의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 솔루션 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고-20 ° c.에 그것을 저장
   4. 효소 소화를 무력화 하는 매체의 500 mL를 준비: DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보완.
   5. 500 mL 접종 매체 (성장 요소가 포함 된 매체, G-매체 라는)의 준비: DMEM/F12 (3:1) 매체 1% 페니실린/스, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)를 포함 하 고 2 %B27 보충입니다.
   6. 100 m m 세포 배양을 pretreat 나 실 온에서 30 분 동안 콜라겐의 형식을 포함 하는 코팅 매트릭스 2 mL와 함께 요리.

2. 종래의 방법

1. 피부 조직 전처리
   1. 피부 조직의 1.5 c m² 를가 고 그것을 씻어 10 mL의 PBS; 1 x 다음, 30 대 70% 에탄올 10 mL로 씻어 s 그것을 품 어 및 세척 솔루션 (PBS 2% 페니실린과 스 포함), 5 분의 10 mL와 함께 2 배.
      참고: 모든 세척 100 mm 셀 문화 요리 층 흐름 후드 내부에서 수행 됩니다.
   2. 조직 100 mm 셀 문화 접시에 있는 피하 지방 층을 제거 하 고, 다음, 피부 조직 (무게는이 프로토콜에 1 g)를 무게를 멸 균가 위로 잘라.
      참고: 충분 한 트리밍은 진 피에서 표 피의 효율적인 분리에 대 한 매우 중요 합니다. 노란 지방 층 구분할 수 있습니다 쉽게 시각적으로.
   3. 아래 진 피 쪽으로 또 다른 100 m m 메 마른 요리 조직을 전송 하 고, 다음, 피부 조직을 메스 블레이드를 사용 하 여 3-4 m m-와이드 스트립으로 잘라.
      참고: 지방 층과 진 피 쪽 쉽게 시각적으로 인식 된다.
   4. 100 m m 문화 접시에 피부 조직에 2.5 mg/mL dispase 솔루션의 10 mL를 추가 하 고, 다음, 4 ° C (더 이상 20 h)에서 하룻밤 접시를 품 어.
      참고: dispase 솔루션의 금액의 조직의 각 그램의 소화에 대 한 dispase 솔루션의 10 mL를 사용 하 여 계산할 수 있습니다.
2. 피부 조직에서 표 피의 분리
   1. 둘째 날에는 정밀한 족집게를 사용 하 여 진 피에서 표 피를 벗기십시오.
      참고: 표 피를 벗기다 어려운 경우 dispase 소화 충분 하지 않았다, 일반적으로 조직의 부족 한 잘라내기 때문입니다. 이 경우에 조직 이상 보육 시간이 필요합니다.
   2. 메스;를 사용 하 여 조직 슬러리에 세포 배양 매체의 500 µ L로 벗 겨 표 피를 말하다 그런 다음, 50 mL 튜브에 0.25 %trypsin 10 mL와 함께 그것을 resuspend 하 고 그것에 알 떨고와 37 ° C에서 물 욕조에 20 분을 품고.
3. 수집 및 기본 세포의 배양
   1. 중화 솔루션 (10 mL이 프로토콜에서)의 동일한 볼륨을 추가 하 여 트립 신 활동을 무력화.
   2. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 20 x 위아래로 솔루션 pipetting으로 표 피 세포를 해리 하 고 어떤 잔여 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 전달 합니다.
   3. 여과; 후 5 분 동안 200 x g 에서 셀 솔루션을 원심 세척에 대 한 중립화 매체에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고, 다음, 셀 펠 렛을 얻기 위해 200 x g 에 다시 원심.
   4. 낮은 칼슘, 혈 청 무료 keratinocyte 매체 (SFM) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 총 셀 수를 계산 하 고, 약 2 x 10⁶ 셀 100 mm 셀 문화 요리 코팅 매트릭스와 청소용된으로 SFM의 10 mL 다음, 접시에이 솔루션의 10 µ L를가지고 (포함 하는 유형 I 교원 질).
      참고: 코팅은 종래의 방법에 대 한 필요한 단계 이다.
   5. 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다.
      참고: 전과 문화 매체를 변경한 후 현미경으로 세포 접착을 확인 하십시오.
   6. 그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류.
      참고: 모든 문화 요리는 청소용 코팅 매트릭스와 함께.

3. 새로운 방법

1. 피부 조직 전처리
   1. 조직 설명 대로 위의 (2.1 단계) 종래의 방법에 대 한 수집 합니다.
   2. 씻어 피부 조직 1 x 10 mL PBS의 그리고, 다음, (무게는이 프로토콜에 약 1 g) 전자 규모에 의해 살 균 플라스틱 용기에 무게.
      참고: 조직의이 프로토콜에 필요한 최소 무게는 0.1 g, 때문에 사용 하는 조직 표본은 너무 작은 경우 셀의 충분 한 수를 얻기 어렵다. 궁극적으로 연산자의 처리 용량에 따라 달라 집니다이 프로토콜에 대 한 조직의 최대 무게가 있다.
   3. 겸 자 30 대 70% 에탄올 10 mL와 피부 조직 린스를 사용 하 여 s.
   4. 조직 2 품 어 세척 솔루션 (2.1.1 단계에서 준비), 5 분 동안 각 시간 10 mL x.
      참고: 위에서 언급 된 모든 세척 단계 100 mm 셀 문화 요리 층 류 두건 (조직 문화 후드) 내부에서 수행 됩니다.
   5. 다른 100 mm 셀 문화 살 균 접시 전송 조직.
   6. 메스를 사용 하 여 말하다 조직을 철저 하 게 조직 슬러리에.
   7. 젖은 조직 유지를 200 µ L의 PBS 마다 5 분을 추가 합니다.
      참고: 단계 3.1.5-3.1.7 약 15 분 소요. 위의 단계를 모두 상 온에서 수행 됩니다.
2. 피부 조직의 소화
   1. 무 균된 조직 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다. 피부 조직의 모든 1g에 대 한 효소 혼합물의 10 mL를 추가 합니다. 무 균 조직 효소를 철저 하 게 혼합.
   2. 1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕에 떨고와 혼합물을 품 어.
   3. 37 ° c.에 물 목욕에서 또 다른 30 분 소화 혼합물에 0.25 %trypsin (2.5 mL이 프로토콜에서)의 1/5 볼륨 추가
   4. DNase를 추가 나 1: 100 (v/v) 비율로 (이 프로토콜에 250 µ L) 효소 혼합물에 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.
3. 수집 및 기본 세포의 배양
   1. 1:1 비율로 중립화 매체의 12.5 mL을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다. 약 20 배, 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 세포 분열을 위한 솔루션을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.
   2. 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 셀을 필터링 합니다. 200 x g 5 분 관찰 튜브의 하단에 펠 릿에서 상쾌한 원심
   3. 삭제는 상쾌한 고 200 x g 세포를 수집 5 분에 다시 중화 매체, 그리고 원심 분리기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.
   4. Y-27632의 10 µ M와 접종 매체 (G-중간 단계의 1.2.5) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
   5. 총 셀 수를 계산 하 고, 다음, 대략 2 x 10⁶ 셀 100 mm 셀 문화 접시에 G 매체의 10 mL 접시 솔루션의 10 µ L를 가져가 라.
      참고: precoating 단계는 새로운 방법에 대 한 필요 하 고 피부 층의 아무 제거도 필수.
   6. 3 d, 후 접종 매체를 낮은 칼슘 SFM 매체 바꿉니다. 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다.
      참고: 매체 변경 전후 세포 접착을 확인 하십시오.
   7. 그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류.
      참고: 필요한 경우 0.05% trypsin 2 분에 대 한 셀을 pretreat 고 표 피 세포를 trypsinizing 전에 피부 세포를 오염 제거에 PBS 가진 세포를 씻어.

4. 셀 뿌리고

1. 제거 매체, PBS, 셀을 세척 하 고, 다음, (각 100 m m 접시) 당 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가.
2. 5 분 동안 인큐베이터 (5% CO₂와 37 ° C)에서 세포를 품 어.
3. 모든 세포는 문화 접시에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인 하는 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 합니다.
4. 추가 10 %DMEM 8 mL FBS 효소 반응 중화 하 고, 다음, 15 mL 튜브에 세포를 수집을.
5. 셀 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안 200 x g 에서 원심.
6. 상쾌한을 천천히 제거, SFM 매체의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 그리고 셀의 수를 계산 합니다.
7. 각 100 mm 셀 접시에 SFM의 10 mL로 플레이트 1 x 10⁶ 셀.
8. 매체 마다 2 d를 변경 합니다.

결과

새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표...

토론

상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis