Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Zusammenfassung

Primären menschlichen Keratinozyten aus frischem Hautgewebe und ihre Erweiterung in-vitro- isoliert haben für Laborforschung und klinische Anwendungen weit verbreitet. Die konventionelle Isolationsmethode der menschlichen Keratinozyten beinhaltet ein zweistufiges sequentielle enzymatische Verdauung Verfahren, die sich bewährt hat, als ineffizient bei der Schaffung von Primärzellen von adulten Geweben aufgrund der niedrigen Zelle Wiederfindungsrate und reduzierten Zelle Lebensfähigkeit. Wir berichteten vor kurzem eine fortgeschrittene Methode, menschliche primäre epidermaler Vorläuferzellen von Hautgewebe zu isolieren, die die Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 im Medium nutzt. Im Vergleich mit dem traditionellen Protokoll, diese neue Methode ist einfacher, leichter und weniger zeitaufwendig, und epithelialen Stammzellen Ausbeute erhöht und verbessert ihre Stammzell-Eigenschaften. Darüber hinaus der neuen Methodik erfordert nicht die Trennung der Epidermis von der Dermis, und eignet sich somit für die Isolierung von Zellen aus verschiedenen Arten von adulten Geweben. Diese neue Isolationsmethode überwindet die größten Schwächen der herkömmlichen Methoden und eignet sich eher für die Herstellung von großen Zahlen von epidermalen Zellen mit hoher Potenz für Labor und klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir die neue Methode im Detail.

Einleitung

Ziel war es, ein einfaches und effizientes Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten (HKCs) von adulten Geweben, vor allem für klinische Anwendungen isolieren zu entwickeln. Epidermalen Hautstammzellen, lokalisiert in der basalen Schicht der Haut, besitzen ein hohes Potenzial zu vermehren und zu unterscheiden und bieten Keratinozyten zur Aufrechterhaltung der Funktionen der Haut^{1,2,3, 4}. HKCs von Geweben weit für Haut Gewebe-Engineering und Regeneration Zwecke, vor allem in der Reparatur der beschädigten Haut und in der Gentherapie für klinische Anwendungen^{5,6 verbreitet sind}Haut isoliert. Die Schlüsselfrage für HKC-basierten Anwendungen ist es, effizient zu isolieren und zu große Anzahl von HKCs mit hohem Potenzial in-vitro-^7,8zu erweitern. Obwohl verschiedene Forschergruppen Methoden entwickelt, um die Kulturen der Stamm-ähnliche HKCs zu produzieren, sind diese Methoden manchmal zeitaufwendig und kompliziert zu führen und andere Einschränkungen, z. B. niedrige Zelle Renditen und durch die Art der Haut Probe begrenzt ⁹verwendet. Zum Beispiel beinhaltet die traditionelle Methode, HKCs von Hautgewebe zu isolieren eine zweistufigen enzymatischen Verdauung mit einer Trennung der Epidermis von der Dermis-⁶. Diese Methode funktioniert in der Regel gut für neonatale Gewebe, aber es wird sehr schwierig, wenn verwendet, um Zellen aus adulten Geweben zu isolieren.

Y-27632, ein Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), wurde berichtet, erheblich verbessern die Effizienz der epidermalen Stammzellen isoliert und Kolonie Wachstum^10,11,12. In einer früheren Studie entdeckten wir, dass Y-27632 das klonale Wachstum der Epidermiszellen erleichtert sondern den Ertrag der dermalen Zellen verringert durch die differentiell Steuerung des Ausdrucks der Adhäsion Moleküle¹³. Wir stellte auch ein neues konditionierten Inokulation Medium, genannt G-Medium, das Wachstum und Ertrag von primären epidermalen Zellen unterstützt. Durch die Kombination G-Medium mit Y-27632, kann diese neuartige Methode epidermale und dermale Zellen spontan nach Enzym Verdauung, so dass den Schritt der Epidermis-Dermis Trennung^13,14trennen. Basierend auf früheren Berichten, beschreiben wir nun die Einzelheiten des Verfahrens der neuen Methode HKCs von Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren.

Protokoll

Menschlichem Gewebe, die in diesem Protokoll verwendeten nach den Richtlinien des Instituts Humanforschung Ethik-Kommission behandelt wurden (NO.2015120401, Datum: 12. Mai 2015).

1. Vorbereitungen

1. Sammeln frische Erwachsenen Bauchhaut Gewebe verworfen von plastische Chirurgie am Krankenhaus in einen 50-mL-Tube mit 10 mL eiskaltes Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM). Das Präparat kann bei 4 ° C bis zu 72 h ohne erheblichen Auswirkungen auf die Zellviabilität gehalten werden.
2. Bereiten Sie die Reagenzien und Kulturmedium wie unten beschrieben vor.
   1. Fügen Sie 1 mL Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/L) bis 50 mL von Phosphat-gepufferte Lösung (PBS), die Waschlösung vorzubereiten.
   2. Bereiten Sie zwei Sätze von Enzym Verdauung Lösungen: (1) bereiten Sie 50 mL Dispase (2,5 mg/mL in DMEM) und 50 mL Typ I Kollagenase (2,5 mg/mL in DMEM) separat für die konventionelle Methode; und (2) bereiten Sie 50 mL einer Mischung aus Dispase und Typ I Kollagenase (auflösen 125 mg Dispase Pulver und 125 mg Typ I Kollagenase Pulver in 50 mL DMEM) für die neue Methode.
      Hinweis: Alle Enzym Lösungen sollten mit einem 0,22 µm-Sieb gefiltert und at4 ° c gehalten
   3. Beide Methoden Verdauung Lösungen vorbereiten: Trypsin 0,05 % und 0,25 % Trypsin im Handel gekauft wurden. Bereiten Sie eine 10 mg/mL DNase ich Lösung durch Auflösen von 50 mg DNase ich in 5 mL PBS Pulver, mit einem 0,22 µm-Sieb Filtern und speichern Sie es bei-20 ° C.
   4. Bereiten Sie 500 mL des Mediums, die enzymatische Verdauung zu neutralisieren: DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
   5. 500 mL Inokulation Medium (Wachstum-Faktor-haltige Mittel, genannt G-Medium) vorbereiten: DMEM/F12 (3:1) Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin, 40 µg/mL Fungizone, 40 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Zuschlag von 2 % B27.
   6. 100 mm Zellkultur Vorbehandeln Gerichte mit 2 mL der Beschichtung Matrix, Typ enthält ich Kollagen für 30 min bei Raumtemperatur.

2. konventionelle Methode

1. Haut-Gewebe-Vorbehandlung
   1. Nehmen Sie 1,5 cm² von Hautgewebe und waschen Sie es 1 X mit 10 mL PBS; dann spülen sie mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 s und inkubieren Sie es 2 X mit 10 mL Waschlösung (PBS, enthält 2 % Penicillin und Streptomycin), 5 min.
      Hinweis: Alle Waschungen sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze durchgeführt.
   2. Schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere Entfernen der subkutanen Fettschicht in der Kulturschale 100 mm Zelle und dann wiegen das Hautgewebe (das Gewicht beträgt 1 g in diesem Protokoll).
      Hinweis: Ausreichende Besatz ist sehr entscheidend für die effiziente Trennung der Epidermis von der Dermis. Die gelbliche Fettschicht kann optisch leicht unterscheiden.
   3. Übertragen Sie das Gewebe auf ein weiteres 100 mm steril Gericht mit der Lederhaut Seite nach unten, und dann schneiden Sie das Hautgewebe in 3 bis 4 mm breite Streifen mit einem Skalpellklinge.
      Hinweis: Die Dermis-Seite mit der Fettschicht ist visuell erkennbar.
   4. Das Hautgewebe in der Kulturschale 100 mm 10 mL 2,5 mg/mL Dispase-Lösung hinzu und inkubieren Sie dann die Schale über Nacht bei 4 ° C (nicht mehr als 20 h).
      Hinweis: Die Menge der Dispase Lösung kann berechnet werden, mit 10 mL Dispase-Lösung für die Verdauung von jedem Gramm Gewebe.
2. Trennung von der Epidermis der Hautgewebe
   1. Am zweiten Tag die Epidermis von der Dermis, die mit einer feinen Pinzette abziehen.
      Hinweis: Ist es schwierig, die Oberhaut abziehen, war die Dispase Verdauung nicht ausreichend, die ist in der Regel aufgrund unzureichender Trimmen des Gewebes. In diesem Fall braucht das Gewebe eine längere Inkubationszeit.
   2. Hacken Sie die geschälte Epidermis mit 500 µL Zellkulturmedium in ein Gewebe Gülle mit Skalpellklingen; dann, mit 10 mL von 0,25 % Trypsin in einen 50-mL-Tube Aufschwemmen Sie und inkubieren Sie es 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C mit schütteln.
3. Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
   1. Neutralisieren Sie die Trypsin-Aktivität durch ein gleiches Volumen der Neutralisierung-Lösung (10 mL in diesem Protokoll) hinzufügen.
   2. Die epidermalen Zellen durch die Lösung nach oben und unten 20 X mit einer serologischen 10-mL-Pipette pipettieren zu distanzieren und ein 100 µm Zelle Sieb, alle restlichen Gewebe Ablagerungen zu entfernen die Zelle Lösung durchlaufen.
   3. Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 200 X g für 5 min nach der Filtration; Aufschwemmen der Zelle Pellet in Neutralisation Mittel zum Waschen und anschließend Zentrifugieren es wieder bei 200 X g Zelle Pellet zu erhalten.
   4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Medium Low-Calcium, serumfreien Keratinozyten (SFM). Nehmen Sie 10 µL dieser Lösung auf die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 10⁶ Zellen mit 10 mL der SFM in 100 mm Zelle Kultur Gerichte vorbehandelt mit Beschichtung Matrix (mit Typ I Kollagen).
      Hinweis: Die Beschichtung ist ein notwendiger Schritt für die konventionelle Methode.
   5. Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion unter dem Mikroskop, vor und nach der Änderung des Kulturmediums.
   6. Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss.
      Hinweis: Alle Kultur-Gerichte sind mit der Matrix-Beschichtung vorbehandelt.

(3) die neue Methode

1. Haut-Gewebe-Vorbehandlung
   1. Sammeln Sie das Gewebe wie beschrieben oben (Schritt 2.1) für die konventionelle Methode.
   2. Waschen Sie das Hautgewebe 1 X mit 10 mL PBS und dann in einen sterilen Behälter aus Kunststoff durch eine elektronische Waage (das Gewicht ist etwa 1 g in diesem Protokoll) wiegen.
      Hinweis: Das Mindestgewicht des Gewebes benötigt für dieses Protokoll ist 0,1 g, da es schwierig ist, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, wenn die Gewebeprobe verwendet zu klein ist. Es gibt keine maximale Gewicht des Gewebes für dieses Protokoll, die letztlich die Umschlagskapazität des Betreibers abhängt.
   3. Pinzette verwenden, um das Hautgewebe mit 10 mL 70 % igem Ethanol für 30 spülen s.
   4. Inkubieren Sie das Gewebe 2 X mit 10 mL Lösung (in Schritt 2.1.1 vorbereitet), für 5 min jedes Mal zu waschen.
      Hinweis: Alle oben aufgeführten Waschschritte sind im 100-mm-Zelle Kultur Gerichte in einem Laminar-Flow-Kapuze (Gewebekultur Kapuze) durchgeführt.
   5. Übertragen Sie das Gewebe auf eine andere Zelle 100 mm steril Kulturschale.
   6. Verwendung von Skalpellklingen, Hackfleisch das Gewebe gründlich in ein Gewebe Gülle.
   7. Fügen Sie 200 µL PBS alle 5 min., um das Gewebe feucht zu halten.
      Hinweis: Nehmen Sie ca. 15 min für Schritte 3.1.5 - 3.1.7. Die oben genannten Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.
2. Verdauung von Hautgewebe
   1. Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe-Lösung in eine 50-mL-Tube. Fügen Sie 10 mL Enzym Mischung für je 1 g von Hautgewebe. Mischen Sie die Enzyme mit dem homogenisierte Gewebe gründlich.
   2. Inkubieren Sie die Mischung mit schütteln in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 h.
   3. Fügen Sie ein 1/5 Volumen von 0,25 % Trypsin (2,5 mL in diesem Protokoll) auf die Verdauung-Mischung für weitere 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C.
   4. Fügen Sie DNase ich Lösung für das Enzym-Gemisch im Verhältnis 1: 100 (V/V) (250 µL in diesem Protokoll) und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Sammlung und Kultivierung von Primärzellen
   1. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 12,5 mL Neutralisation Medium im Verhältnis 1:1. Pipette die Lösung oben und unten für ungefähr 20 x, mit einer serologischen 10-mL-Pipette, um die Zellen zu trennen.
   2. Filtern Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 µm Zelle Sieb, das Gewebe Ablagerungen zu entfernen. Zentrifugieren des Überstands 200 X g für 5 min. beobachten das Pellet am Boden des Röhrchens.
   3. Verwerfen Sie den überstand und waschen Sie die Zelle Pellet mit 10 mL der Neutralisation Medium und Zentrifuge wieder bei 200 X g für 5 min um die Zellen zu sammeln.
   4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Inokulation Medium (G-Mittel aus Schritt 1.2.5) mit 10 µM Y-27632.
   5. Nehmen Sie 10 µL der Lösung für die Ergebniszelle Anzahl und dann Platte ca. 2 x 10⁶ Zellen mit 10 mL G-Medium in der Kulturschale 100-mm-Zelle.
      Hinweis: Der precoating Schritt ist nicht erforderlich für die neue Methode, und keine Entfernung der dermalen Schicht ist erforderlich.
   6. Ersetzen Sie nach 3-d die Inokulation Medium mit Low-Calcium SFM Medium. Ändern Sie das Kulturmedium jeden 2 d.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Zelladhäsion, vor und nach dem Ändern des Mediums.
   7. Durchgang der Zellen, wenn sie etwa 80 % erreichen Zusammenfluss.
      Hinweis: Gegebenenfalls Vorbehandeln der Zellen mit 0,05 % Trypsin für 2 min und waschen Sie die Zellen mit PBS, dermale Zellen vor trypsinizing der Epidermiszellen verunreinigen zu entfernen.

(4) Zelle Passagierung

1. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie dann 2 mL 0,05 % Trypsin (pro pro 100 mm Schale).
2. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator (37 ° C mit 5 % CO₂) für 5 min.
3. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen aus der Kulturschale abgelöst haben.
4. Fügen Sie 8 mL DMEM mit 10 % FBS zu neutralisieren die enzymatische Reaktion und dann sammeln die Zellen in einem 15-mL-Tube.
5. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min um die Zelle Pellet zu erhalten.
6. Den überstand langsam entfernen dann Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL SFM Medium und die Anzahl der Zellen.
7. Platte 1 x 10⁶ Zellen mit 10 mL der SFM in jeder Zelle 100 mm Schale.
8. Verändern Sie das Medium jeder 2 d.

Ergebnisse

Schematische Darstellungen der neuen Methode (Abbildung 1A) und der konventionellen Methode (Abbildung 1 b) sind in Abbildung 1dargestellt. Die konventionelle Methode ist eine zweistufige Verdauung, die eine 2-Tages-Verfahren erfordert. Die neue Methode ist dagegen eine einstufige Verdauung, die dauert rund 3 Stunden durchzuführen. Wichtig ist, erhalten die neue One-Step-Methode zwei Populationen (e...

Diskussion

Kultivierte primäre HKCs haben häufig genutzt, um Wunden in Kliniken mehr als drei Jahrzehnte lang zu behandeln, und seit dieser Zeit wurde es immer wichtig, ausreichende Zahl von Zellen für klinische Anwendungen in einer fristgerechten Weise effizient zu erhalten. Daher erschwert in der Praxis, die herkömmliche Isolierung-Methode, die die Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert, diese Anforderungen durch die geringe Ausbeute an Zellen und die geringe Fähigkeit, adulte Zellen die passage. Hier beschreiben wi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis