Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Résumé

Des kératinocytes humains primaires isolés des tissus de la peau fraîche et leur expansion in vitro ont été largement utilisées pour la recherche en laboratoire et pour des applications cliniques. La méthode d’isolation classiques des kératinocytes humains implique une procédure en deux étapes séquentielles de la digestion enzymatique, qui s’est avérée inefficace dans la génération de cellules primaires provenant de tissus adultes en raison du taux de récupération des cellules faibles et cellulaire réduite viabilité. Nous avons récemment rapporté une méthode avancée pour isoler les cellules progénitrices épidermiques primaires humaines provenant de tissus de la peau qui utilise l’inhibiteur de kinase Rho Y-27632 dans le milieu. En comparaison avec le protocole traditionnel, cette nouvelle méthode est plus simple, plus facile et moins chronophage et augmente le rendement des cellules souches épithéliales et améliore leurs caractéristiques de cellules souches. De plus, la nouvelle méthodologie ne nécessite pas la séparation de l’épiderme, du derme et, est donc adaptée pour isoler les cellules de différents types de tissus adultes. Cette nouvelle méthode d’isolement surmonte les principales lacunes des méthodes conventionnelles et est plus adaptée pour produire un grand nombre de cellules épidermiques avec forte puissance pour laboratoire et pour des applications cliniques. Nous décrivons ici la nouvelle méthode en détail.

Introduction

L’objectif était d’élaborer un protocole simple et efficace pour isoler des kératinocytes humains primaires (HKCs) provenant de tissus adultes, en particulier pour des applications cliniques. Les cellules souches épidermiques peau, localisées dans la couche basale de la peau, possèdent un potentiel élevé de proliférer et de différencier et de fournir des kératinocytes pour maintenir les fonctions de la peau^{1,2,3, 4}. HKCs isolées de la peau, les tissus sont employés couramment pour peau tissu ingénierie et régénération, particulièrement dans la réparation de la peau endommagée et en thérapie génique pour des applications cliniques^5,6. La question clé pour les applications HKC est d’isoler efficacement et de développer un grand nombre de HKCs avec haut potentiel in vitro^7,8. Bien que plusieurs groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour produire des cultures de souches-comme HKCs, ces méthodes sont parfois long et compliqué à réaliser et ont d’autres limitations, telles que les cellules faibles rendements et limité par le type d’échantillon de peau utilisé⁹. Par exemple, la méthode traditionnelle pour isoler HKCs de tissus cutanés implique une digestion enzymatique en deux étapes avec une séparation de l’épiderme, le derme⁶. Cette méthode fonctionne généralement bien pour tissus néonatales, mais il devient très difficile lorsqu’il est utilisé pour isoler les cellules provenant de tissus adultes.

Y-27632, un inhibiteur de la protéine associée à Rho kinase (ROCK), a été signalé à améliorer considérablement l’efficacité des cellules souches épidermiques isolement et colonie croissance^10,11,12. Dans une étude précédente, nous avons découvert que Y-27632 facilite la croissance clonale de cellules épidermiques, mais réduit le rendement des cellules dermiques de façon différentielle contrôlant l’expression des molécules d’adhérence¹³. Nous avons aussi établi un nouveau milieu conditionné l’inoculation, appelé G-medium, qui soutient la croissance et le rendement des cellules épidermiques primaires. En combinant le milieu G-avec Y-27632, cette nouvelle méthode permet de séparer spontanément des cellules épidermiques et dermiques après digestion enzymatique, éliminant ainsi l’étape de l’épiderme-derme séparation^13,14. Se fondant sur les rapports précédents, nous avons maintenant décrire la procédure détaillée de cette nouvelle méthode isoler HKCs du tissu cutané adulte.

Protocole

Les tissus humains utilisés dans le présent protocole ont été traités conformément aux directives du Comité d’éthique de l’Institution recherche humaine (NO.2015120401, date : 12 mai 2015).

1. les préparatifs

1. Tissus de la peau d’abdominale adultes frais virés écartés de chirurgie plastique à l’hôpital dans un tube de 50 mL avec 10 mL de Dulbecco glacee modifiée milieu Eagle (DMEM). L’échantillon peut être maintenu à 4 ° C pendant 72 h sans affecter sensiblement la viabilité des cellules.
2. Préparer les réactifs et le milieu de culture, tel que décrit ci-dessous.
   1. Ajouter 1 mL de pénicilline (100 U/mL) et à la streptomycine (100 mg/L) dans 50 mL de solution tamponnée au phosphate (PBS), afin de préparer la solution de lavage.
   2. Préparer deux ensembles de solutions de digestion enzymatique : (1) préparation de 50 mL d’a (2,5 mg/mL en DMEM) et 50 mL de type I collagénase (2,5 mg/mL en DMEM) séparément pour la méthode conventionnelle ; et (2) préparer 50 mL d’un mélange d’a et de collagénase de type I (dissoudre 125 mg de poudre d’a et 125 mg de type I poudre de collagénase dans 50 mL de DMEM) pour la nouvelle méthode.
      Remarque : Toutes les solutions enzymatiques doivent être filtrées avec un filtre de 0,22 µm et conservées à 4 ° C.
   3. Préparer des solutions de digestion pour les deux méthodes : la trypsine 0.05 % et 0,25 % de trypsine ont été achetées dans le commerce. Préparer une DNase 10 mg/mL j’ai solution en dissolvant 50 mg de DNase I poudre dans 5 mL de PBS, filtrez-le avec un filtre de 0,22 µm et conserver à-20 ° C.
   4. Préparer 500 mL de milieu pour neutraliser la digestion enzymatique : milieu DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine.
   5. Préparer 500 mL de milieu de l’inoculation (moyen contenant du facteur de croissance, appelée G-milieu) : DMEM/F12 (3:1) medium contenant 1 % pénicilline/streptomycine, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2), 20 facteur de croissance épidermique (EGF), ng/mL et Supplément de 2 % B27.
   6. Prétraitez les cultures cellulaires de 100 mm plats avec 2 mL de matrice de revêtement contenant du type j’ai collagène pendant 30 min à température ambiante.

2. conventionnel méthode

1. Prétraitement de tissus de la peau
   1. Prendre 1,5 cm² du tissu cutané et lavez-le 1 x 10 ml de PBS ; Ensuite, rincez-la avec 10 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 s et il Incuber 2 x 10 ml de solution (PBS contenant 2 % de pénicilline et de streptomycine), de lavage 5 min chacun.
      Remarque : Tous les lavages sont effectuées dans les récipients de culture de cellules de 100 mm à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
   2. Coupez le tissu avec des ciseaux stériles pour enlever la couche de graisse sous-cutanée dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm et, ensuite, peser les tissus de la peau (le poids est 1 g dans le présent protocole).
      Remarque : Compensation suffisante est tout à fait crucial pour la séparation efficace de l’épiderme du derme. La couche de graisse jaunâtre peut être aisément distinguée visuellement.
   3. Transférer le tissu dans un autre récipient stérile de 100 mm avec le côté du derme vers le bas et, ensuite, couper les tissus de la peau en lanières de 3 à 4 mm-largeur à l’aide d’une lame de bistouri.
      Remarque : Le côté du derme avec la couche de graisse est facilement reconnaissable visuellement.
   4. Ajouter 10 mL de solution a 2,5 mg/mL pour les tissus cutanés dans une boîte de Petri de 100 mm et, ensuite, incuber le plat du jour au lendemain à 4 ° C (pas plus de 20 h).
      Remarque : La quantité de solution a peut être calculée à l’aide de 10 mL de solution a pour la digestion de chaque gramme de tissu.
2. Séparation de l’épiderme dans les tissus de la peau
   1. Le deuxième jour, peler l’épiderme du derme à l’aide de pinces fines.
      Remarque : S’il est difficile à décoller de l’épiderme, la digestion a ne suffisait pas, qui est habituellement en raison de l’insuffisante Coupe du tissu. Dans ce cas, le tissu a besoin d’un temps d’incubation plus longs.
   2. Émincer l’épiderme Pelée avec 500 µL de milieu de culture cellulaire dans une boue de tissu à l’aide de lames de bistouri ; Ensuite, il resuspendre avec 10 mL de 0,25 % de trypsine dans un tube de 50 mL et il incuber 20 min dans un bain d’eau à 37 ° C, sous agitation.
3. Collecte et mise en culture de cellules primaires
   1. Neutraliser l’activité de la trypsine en ajoutant un volume égal de solution de neutralisation (10 mL dans le présent protocole).
   2. Dissocier les cellules épidermiques en pipettant également, la solution de haut en bas 20 x avec une pipette sérologique de 10 mL et passer la solution de la cellule à travers un tamis de cellule de 100 µm pour éliminer les débris de tissu résiduel.
   3. Centrifuger la solution cellulaire à 200 x g pendant 5 min après filtration ; Resuspendre le culot dans un milieu de neutralisation pour le lavage et, ensuite, le centrifuger à nouveau à 200 x g pour obtenir le culot cellulaire.
   4. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de kératinocytes de faible teneur en calcium, sans sérum (GDF). Prendre 10 µL de cette solution pour compter le nombre total de cellules et, ensuite, plaque environ 2 x 10⁶ cellules avec 10 mL de l’AFD dans les récipients de culture 100 mm cellule prétraités avec matrice de revêtement (contenant du collagène de type I).
      Remarque : Le revêtement est une étape nécessaire à la méthode conventionnelle.
   5. Changer le milieu de culture tous les 2 jours.
      Remarque : Vérifier l’adhérence de cellules au microscope avant et après avoir changé le milieu de culture.
   6. Les cellules de passage lorsqu’ils atteignent environ 80 % confluence.
      Remarque : Tous les récipients de culture sont prétraités avec la matrice de revêtement.

3. la nouvelle méthode

1. Prétraitement de tissus de la peau
   1. Percevoir le tissu tel que décrit ci-dessus (étape 2.1) pour la méthode conventionnelle.
   2. Laver les tissus de la peau 1 x 10 ml de PBS et, ensuite, il peser dans un flacon en plastique stérile par une balance électronique (le poids est environ de 1 g dans le présent protocole).
      Remarque : Le poids minimum de tissu nécessaire pour que ce protocole est 0,1 g, car il est difficile d’obtenir un nombre suffisant de cellules si l’échantillon de tissu utilisé est trop petite. Il n’y a aucun poids maximum du tissu pour ce protocole, qui dépendante de la capacité de manutention de l’opérateur.
   3. Utiliser des pinces pour rincer le tissu cutané avec 10 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 s.
   4. Incuber le tissu 2 x 10 ml de solution (préparée à l’étape 2.1.1), pendant 5 min à laver chaque fois.
      Remarque : Toutes les étapes de lavage susmentionnées sont effectuées dans les récipients de culture de cellules de 100 mm à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire (une hotte de culture de tissus).
   5. Transférer le tissu dans un autre récipient stérile de la culture cellulaire de 100 mm.
   6. À l’aide de lames de bistouri, émincer les tissus soigneusement dans une boue de tissu.
   7. Ajouter 200 µL de PBS toutes les 5 min pour garder les tissus humides.
      Remarque : Prendre environ 15 min pour obtenir la procédure 3.1.5 - 3.1.7. Toutes les étapes ci-dessus sont effectuées à température ambiante.
2. Digestion du tissu cutané
   1. Transvaser la solution de tissu homogénéisé dans un tube de 50 mL. Ajouter 10 mL de mélange d’enzymes par 1 g de tissu cutané. Bien mélanger les enzymes avec les tissus homogénéisés.
   2. Incuber le mélange avec la secousse dans un bain-marie à 37 ° C pendant 1 h.
   3. Ajouter un volume de 1/5 de 0,25 % de trypsine (2,5 mL dans le présent protocole) au mélange digestion pendant 30 min dans un bain d’eau à 37 ° C.
   4. Ajouter DNase I solution au mélange enzyme à un ratio de 1 : 100 (v/v) (250 µL dans le présent protocole) et il incuber pendant 5 min à température ambiante.
3. Collecte et mise en culture de cellules primaires
   1. Arrêter le processus de digestion en ajoutant 12,5 mL de milieu de neutralisation dans un rapport 1:1. Déposer la solution monter et descendre pour environ 20 x, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL de dissocier les cellules.
   2. Filtrer les cellules dissociées à travers un tamis de cellule de 100 µm pour éliminer les débris tissulaires. Centrifuger le surnageant à 200 x g pendant 5 min. Observez la pastille au fond du tube.
   3. Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de neutralisation et centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 5 min recueillir les cellules.
   4. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de l’inoculation (G-milieu de l’étape 1.2.5) avec 10 µM de Y-27632.
   5. Prendre 10 µL de la solution de compter le nombre total de cellules et, ensuite, plaque environ 2 x 10⁶ cellules avec 10 mL de milieu-G dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm.
      Remarque : L’étape alluvionnaire n’est pas nécessaire pour la nouvelle méthode, et aucun ablation de la couche dermique n’est nécessaire non plus.
   6. Après 3 jours, remplacez le milieu de l’inoculation par moyen de GDF de faible teneur en calcium. Changer le milieu de culture tous les 2 jours.
      Remarque : Vérifier l’adhésion cellulaire avant et après avoir changé le milieu.
   7. Les cellules de passage lorsqu’ils atteignent environ 80 % confluence.
      Remarque : Si nécessaire, un prétraitement des cellules avec de la trypsine 0.05 % pendant 2 min et laver les cellules avec du PBS pour enlever la contamination des cellules dermiques avant trypsinisation les cellules épidermiques.

4. cellule passage

1. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS et, ensuite, ajouter 2 mL de 0.05 % de trypsine (par chaque plat de 100 mm).
2. Incuber les cellules dans un incubateur (37 ° C avec 5 % de CO₂) pendant 5 min.
3. Vérifier les cellules à l’aide d’un microscope pour s’assurer que toutes les cellules ont détaché de la boîte de Pétri.
4. Ajoutez 8 mL de DMEM avec 10 % FBS à neutraliser la réaction enzymatique et, puis, de recueillir les cellules dans un tube de 15 mL.
5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min obtenir le culot cellulaire.
6. Retirez le surnageant lentement et, ensuite, resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de GDF et compter le nombre de cellules.
7. Plaque de 1 x 10⁶ cellules avec 10 mL de la GDF dans chaque boîte de cellule de 100 mm.
8. Changer le milieu tous les 2 jours.

Résultats

Diagrammes schématiques de la nouvelle méthode (Figure 1 a) et la méthode conventionnelle (Figure 1 b) sont présentés dans la Figure 1. La méthode conventionnelle est une digestion en deux étapes, qui nécessite une procédure de 2 jours. En revanche, la nouvelle méthode est une digestion en une seule étape, qui dure environ 3 heures à effectuer. Ce qui est important, la nouvelle méthode e...

Discussion

HKCs primaires cultivées ont été largement utilisés pour traiter les plaies dans les cliniques pendant plus de trois décennies et, depuis lors, il a toujours été important obtenir efficacement un nombre suffisant de cellules pour des applications cliniques en temps opportun. Par conséquent, dans la pratique, la méthode conventionnelle d’isolement, qui requiert une séparation de l’épiderme du derme, rend difficile de répondre à ces demandes, en raison du faible rendement des cellules et la faible capacit?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis