Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Resumo

Primários queratinócitos humanos isolados dos tecidos da pele fresca e sua expansão em vitro foram amplamente utilizados para pesquisas de laboratório e para aplicações clínicas. O método de isolamento convencional de queratinócitos humanos envolve um procedimento em duas fases sequenciais de digestão enzimática, que tem sido provado ser ineficiente na geração de células primárias de tecidos adultos devido à taxa de recuperação de baixo da célula e célula reduzida viabilidade. Nós recentemente relatou um método avançado para isolar humano primário epidérmico progenitoras de tecidos de pele que utiliza o inibidor de quinase Rho Y-27632 no meio. Comparado com o protocolo tradicional, este novo método é mais simples, mais fácil e menos demorado e aumenta o rendimento de células-tronco epiteliais e melhora suas características de células-tronco. Além disso, a nova metodologia não exige a separação da epiderme da derme e, portanto, é apropriada para isolar células de diferentes tipos de tecidos adultos. Este novo método de isolamento supera as principais deficiências dos métodos convencionais e é mais apropriado para produzir um grande número de células epidérmicas com alta potência para laboratório e para aplicações clínicas. Aqui, descrevemos o novo método em detalhe.

Introdução

O objetivo foi desenvolver um protocolo simples e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários (HKCs) de tecidos adultos, especialmente para aplicações clínicas. Células-tronco epidérmicas da pele, localizadas na camada basal da pele, possuem um alto potencial para proliferar e diferenciar e fornecer queratinócitos para manter as funções da pele^{1,2,3, 4}. HKCs isoladas de pele, tecidos são amplamente utilizados para pele tecido engenharia e regeneração, especialmente na reparação da pele danificada e em terapia gênica para aplicações clínicas^5,6. A questão-chave para aplicativos baseados em HKC é eficientemente isolar e expandir um grande número de HKCs com alto potencial em vitro^7,8. Apesar de vários grupos de pesquisa, desenvolveram métodos para produzir culturas de haste-como HKCs, esses métodos são, por vezes, demorado e complicado para realizar e tem outras limitações, tais como a célula de baixo rendimento e sendo limitada pelo tipo de amostra de pele usado⁹. Por exemplo, o método tradicional para isolar a HKCs dos tecidos da pele envolve uma digestão enzimática em duas fases, com uma separação da epiderme da derme⁶. Esse método geralmente funciona bem para tecidos neonatais, mas torna-se muito difícil quando usado para isolar as células de tecidos adultos.

Y-27632, um inibidor de Rho-associada a proteína quinase (ROCK), tem sido relatado para melhorar significativamente a eficiência das células-tronco epidérmicas isolamento e colônia crescimento^10,11,12. Em um estudo anterior, descobrimos que Y-27632 facilita o crescimento clonal das células epidérmicas, mas reduz o rendimento das células dérmicas controlando diferencialmente a expressão de moléculas de adesão¹³. Também estabelecemos um novo meio de inoculação condicionados, chamado G-médio, que suporta o crescimento e a produtividade das células epidérmicas primárias. Combinando G-médio com Y-27632, este novo método pode espontaneamente separar células epidérmicas e dérmicas após digestão enzimática, eliminando assim a etapa da epiderme-derme separação^13,14. Agora com base em relatórios anteriores, descrevemos o procedimento detalhado deste novo método para isolar HKCs do tecido da pele adulta.

Protocolo

Tecidos humanos utilizados neste protocolo foram tratados de acordo com as diretrizes do Comitê de ética da instituição pesquisa humana (NO.2015120401, data: 12 de maio de 2015).

1. preparações

1. Tecidos de pele abdominal adulto fresca coletar descartados da cirurgia plástica no hospital em um tubo de 50 mL com 10 mL de Dulbecco gelada é modificado médio águia (DMEM). A amostra pode ser mantida a 4 ° C por até 72 h sem significativamente afetar a viabilidade celular.
2. Prepare os reagentes e o meio de cultura, conforme descrito abaixo.
   1. Adicione 1 mL de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/L) a 50 mL de solução tampão fosfato (PBS) para preparar a solução de lavagem.
   2. Prepare-se dois conjuntos de soluções de digestão enzimática: (1) preparar 50 mL de dispase (2,5 mg/mL em DMEM) e 50 mL de tipo I colagenase (2,5 mg/mL em DMEM) separadamente para o método convencional; e (2) preparar 50 mL de uma mistura de dispase e tipo I colagenase (dissolver 125 mg de pó de dispase e 125 mg de tipo I pó de colagenase em 50 mL de DMEM) para o novo método.
      Nota: Todas as soluções de enzima devem ser filtradas com um filtro de 0,22 µm e manteve at4 ° C.
   3. Preparar soluções de digestão para os dois métodos: tripsina 0,05% e 0,25% tripsina foram adquiridos comercialmente. Preparar um 10mg/mL DNase eu solução dissolvendo-se 50 mg de DNase eu pó em 5 mL de PBS, filtrá-la com um filtro de 0,22 µm e armazená-lo a-20 ° C.
   4. Preparar 500 mL de meio de neutralizar a digestão enzimática: suplementado DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
   5. Preparar 500 mL de meio de inoculação (que contém o fator de crescimento médio, chamado G-médio): DMEM/F12 (3:1) médio contendo 1% penicilina/estreptomicina, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF2), ng/mL 20 fator de crescimento epidérmico (EGF), e Suplemento de 2% B27.
   6. Pré-tratamento de cultura celular de 100mm pratos com 2 mL de matriz de revestimento contendo tipo eu colágeno durante 30 min à temperatura ambiente.

2. convencional método

1. Tratamento prévio de tecidos de pele
   1. Tome 1,5 cm² dos tecidos da pele e lave-a 1 x 10 ml de PBS; em seguida, enxágue-o com 10 mL de etanol a 70% por 30 s e incube-2x com 10 mL de solução (PBS contendo 2% de penicilina e estreptomicina), de lavagem 5 min cada.
      Nota: Todas as lavagens são executadas em pratos de cultura celular de 100mm dentro de uma capa de fluxo laminar.
   2. Apare o tecido com tesoura estéril para remover a camada de gordura subcutânea em um prato de cultura celular de 100-mm e, em seguida, pesar o tecido da pele (o peso é 1 g neste protocolo).
      Nota: Aparamento suficiente é crucial para a eficiente separação da epiderme da derme. A camada de gordura amarelada pode ser facilmente distinguida visualmente.
   3. Transferir o tecido para um outro prato de 100mm estéril com o lado da derme para baixo e, em seguida, corte o tecido da pele em tiras de 3 a 4 mm de largura com uma lâmina de bisturi.
      Nota: O lado da derme com a camada de gordura é facilmente reconhecido visualmente.
   4. Adicionar 10 mL de solução de dispase de 2,5 mg/mL para os tecidos da pele em um prato de cultura de 100-mm e, em seguida, incubar o prato durante a noite a 4 ° C (não mais que 20 h).
      Nota: A quantidade de solução de dispase pode ser calculada usando-se 10 mL da solução de dispase para a digestão de cada grama de tecido.
2. Separação da epiderme do tecido cutâneo
   1. No segundo dia, retire a epiderme da derme usando uma pinça fina.
      Nota: Se é difícil de descascar fora a epiderme, a digestão de dispase não era suficiente, que é geralmente devido à insuficiente aparamento do tecido. Neste caso, o tecido precisa de um tempo de incubação.
   2. Picar a epiderme descascada com 500 µ l do meio de cultura celular em uma pasta de tecido usando lâminas de bisturi; em seguida, resuspenda-lo com 10 mL de tripsina 0,25% em um tubo de 50 mL e incube-20 min em banho-maria a 37 ° C, com agitação.
3. Coleta e cultivo de células primárias
   1. Neutralize a atividade da tripsina, adicionando um volume igual de solução de neutralização (10 mL no presente protocolo).
   2. Dissociar as células epidérmicas pipetando a solução acima e abaixo de 20 x com uma pipeta sorológica de 10 mL e transferir a solução de célula através de um filtro de célula de 100 µm para remover todos os restos de tecido residual.
   3. Centrifugue a solução de célula a 200 x g por 5 min após filtração; resuspenda o pellet de células em meio de neutralização para lavagem e, então, centrifugue ele novamente a 200 x g , para obter o centrifugado.
   4. Ressuspender as células em 10 mL do meio de baixo-cálcio, isento de soro queratinócito (SFM). Leve 10 µ l desta solução para contar o número total de células e, em seguida, cerca de 2 x 10⁶ células da placa com 10 mL de SFM em pratos de cultura celular 100mm pré-tratados com matriz de revestimento (contendo colágeno tipo I).
      Nota: O revestimento é um passo necessário para o método convencional.
   5. Altere o meio de cultura cada 2 d.
      Nota: Verificar a adesão celular sob um microscópio, antes e depois de mudar o meio de cultura.
   6. Passagem das células quando eles alcançam cerca de 80% confluência.
      Nota: Todos os pratos de cultura são pré-tratados com a matriz de revestimento.

3. o novo método

1. Tratamento prévio de tecidos de pele
   1. Colete o tecido como descrito acima (passo 2.1) para o método convencional.
   2. Lave o tecido da pele 1 x 10 ml de PBS e, em seguida, pesá-lo em um recipiente plástico estéril por uma balança electrónica (o peso é de cerca de 1 g no presente protocolo).
      Nota: O peso mínimo de tecido necessário para este protocolo é 0,1 g, uma vez que é difícil obter um número suficiente de células, se a amostra de tecido usada é muito pequena. Não há nenhum peso máximo de tecido para este protocolo, que em última análise, depende da capacidade de manipulação do operador.
   3. Usar fórceps para enxaguar o tecido da pele com 10 mL de etanol a 70% por 30 s.
   4. Incubar o tecido 2 x com 10 mL de solução (preparada na etapa 2.1.1), por 5 min de lavagem de cada vez.
      Nota: Todas as etapas de lavagem observadas acima são executadas em pratos de cultura celular de 100mm dentro de uma capa de fluxo laminar (um capuz de cultura de tecidos).
   5. Transferi o tecido para outro prato de cultura da célula de 100-mm estéril.
   6. Usando lâminas de bisturi, picar o tecido completamente em uma pasta de tecido.
   7. Adicione 200 µ l de PBS cada 5 min para manter os tecidos molhados.
      Nota: Leve em torno de 15 min para obter as etapas 3.1.5 - 3.1.7. Todas as etapas acima são executadas à temperatura ambiente.
2. Digestão dos tecidos da pele
   1. Transferi a solução de tecido homogeneizado em um tubo de 50 mL. Adicione 10 mL de mistura de enzimas para cada 1 g de tecido da pele. Homogeneiza as enzimas com os tecidos homogeneizados.
   2. Incube a mistura com agitação em banho-maria a 37 ° C por 1h.
   3. Adicionar um volume de 1/5 de tripsina 0,25% (2,5 mL neste protocolo) para a mistura de digestão por outro 30 min em um banho-maria a 37 ° C.
   4. Adicionar DNase eu solução à mistura de enzima na proporção de 1: 100 (v/v) (250 µ l neste protocolo) e incube-lo por 5 min à temperatura ambiente.
3. Coleta e cultivo de células primárias
   1. Pare o processo de digestão, adicionando 12,5 mL de meio de neutralização em uma proporção de 1:1. Pipete a solução acima e para baixo por cerca de 20 x, usando uma pipeta de 10 mL serológica para dissociar as células.
   2. Filtre as células dissociadas através de um filtro de célula de 100 µm para remover os restos de tecido. Centrifugue o sobrenadante com 200 x g durante 5 min. observar o sedimento no fundo do tubo.
   3. Desprezar o sobrenadante e lavar o centrifugado com 10 mL de meio de neutralização e centrifugar novamente a 200 x g por 5 min coletar as células.
   4. Ressuspender as células em 10 mL de meio de inoculação (G-médio da etapa 1.2.5) com 10 µM de Y-27632.
   5. Leve 10 µ l da solução para contar o número total de células e, então, cerca de 2 x 10⁶ células da placa com 10 mL de G-médio em um prato de cultura celular de 100-mm.
      Nota: O precoating passo não é necessário para o novo método, e não há remoção da camada dérmica também é necessária.
   6. Depois de 3-d, substitua o meio de inoculação médio SFM baixo-cálcio. Altere o meio de cultura cada 2 d.
      Nota: Verificar a aderência de célula antes e depois de mudar o meio.
   7. Passagem das células quando eles alcançam cerca de 80% confluência.
      Nota: Se necessário, pré-tratamento das células com tripsina 0,05% por 2 min e lavar as células com PBS para remover contaminantes células dérmicas antes trypsinizing as células epidérmicas.

4. célula passagem

1. Remover o meio, lavar as células com PBS e, em seguida, adicione 2 mL de tripsina 0,05% (por cada prato de 100-mm).
2. Incube as células em uma incubadora (37 ° C com 5% CO₂), por 5 min.
3. Verifique as células usando um microscópio para certificar-se de que todas as células têm retirado o prato de cultura.
4. Adicione 8 mL de DMEM com 10% FBS para neutralizar a reação enzimática e, em seguida, coletar as células em um tubo de 15 mL.
5. Centrifugar a 200 x g por 5 min obter o centrifugado.
6. Remover o sobrenadante lentamente e, em seguida, resuspenda o pellet celular com 10 mL de meio SFM e contar o número de células.
7. Placa 1 x 10⁶ células com 10 mL de SFM em cada prato de 100mm célula.
8. Altere o meio de cada 2 d.

Resultados

Diagramas esquemáticos do novo método (figura 1A) e o método convencional (figura 1B) são apresentados na Figura 1. O método convencional é uma digestão de duas etapas, o que requer um procedimento de 2 dias. Por outro lado, o novo método é uma digestão de uma etapa, que leva cerca de 3 horas para executar. Importante, o novo método de uma etapa pode obter duas populações (células epid?...

Discussão

HKCs primárias cultivadas têm sido amplamente utilizados para tratar feridas em clínicas por mais de três décadas e, desde então, tem sido sempre importante eficientemente obter um número suficiente de células para aplicações clínicas em tempo hábil. Portanto, na prática, o método de isolamento convencional, o que exige a separação da epiderme da derme, torna difícil atender a essas demandas, devido o baixo rendimento das células e a baixa capacidade de passagem de células adultas. Aqui, descrevemos um...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis